数千年来，利用酵母将单糖发酵转化为醇是众所周知的，也就是说，啤酒是人类历史上几乎所有文化和人口的产物。在生物燃料领域，具有高淀粉含量的第一代原料，例如玉米，已成功地以工业规模用于生产乙醇。第一代技术的发酵方法利用设备来水解原料以生产具有非常高浓度的单聚C6糖的水解醪，主要是葡萄糖，并且很少或者没有酵母抑制剂，例如乙酸。此外，第一代原料中不存在半纤维素衍生的糖，如木糖。
木质纤维素原料水解产物的使用存在一系列需要解决的问题，其中大多数是在以工业规模开展该过程时发生的，大多数问题与使该过程在经济上可行有关；其他则与木质纤维素原料水解产物的特定特征相关，这使得木质纤维素原料水解产物的使用比第一代水解产物更难。
通过酵母转化木质纤维素原料水解产物的第一个缺点是存在C5单糖，主要是木糖。已知木糖难以或者不可能通过天然酶和酵母转化，并且已经设计了特殊基因修饰的酶合剂和酵母来转化半纤维素部分。即使经过基因修饰的酵母能够发酵葡萄糖和木糖，木糖的转化也很慢。
通过酵母转化木质纤维素原料水解产物的第二个缺点是木质纤维素原料水解产物的低糖浓度，其通常以湿基计每千克水解产物总糖量低于100克。在低糖浓度下，酵母的糖摄取速率缓慢，从而促进了生物污染物(例如细菌)的繁殖，其消耗了可用糖的相关部分以生产不需要的生物产物，例如乳酸。酵母的低木糖转化也进一步加强了该问题。因此，通常通过化学或者生物化学制剂(例如抗生素)或者通过物理因素(如热或者光)对木质纤维素原料水解产物灭菌，增加了整体成本。
通过酵母转化木质纤维素原料水解产物的第三个缺点是水解产物中存在抑制性化合物。通常在预处理或者水解木质纤维素原料中产生的化合物例如乙酸、甲酸、糠醛降低了酵母摄取糖的能力，或者至少降低了摄取速率。通常在酵母转化上游的不同阶段去除抑制性化合物，再次增加了整体成本。
通过酵母转化木质纤维素原料水解产物的第四个缺点是，通常需要搅拌水解产物，木质纤维素原理水解产物通常以浆液的形式生产，因此搅拌困难且昂贵。木质纤维素原料水解产物浆液可以分离成包括水和水溶性糖的液体成分以及包括水不溶性预处理的木质纤维素原料的固体成分，再次增加了工艺成本。
木质纤维素原料水解产物的发酵过程中的一个主要问题是降低对酵母的总需要量，这对最终产品成本有很大影响。为解决该问题，通常实施繁殖步骤，其中在促进酵母生长的条件下将酵母插入繁殖培养基中，从而允许产生更多发酵细胞以用于后续发酵过程中。繁殖可以以分批、分批进料和连续模式进行。虽然已经证实酵母在包括合成糖(木糖和葡萄糖)的繁殖培养基上繁殖在实验室规模上是有效的，但已经提出了在木质纤维素原料水解产物上繁殖酵母的不同方法来降低繁殖培养基的成本。
WO2009155633A1公开了包括含C5化合物材料的底物在酵母菌生长中或者酵母菌产物的生产中的用途，其中含C5化合物材料是：(a)从木质纤维素水解产物中获得的含C5化合物材料；(b)从木质纤维素水解产物的发酵中获得的含C5化合物材料；或者(c)(a)和(b)的混合物。该专利申请也公开了使用底物生产酵母菌生物量或者酵母菌产物的方法，该方法包括将包括含C5化合物材料的底物与酵母菌在引起酵母菌生长或者产物产生的条件下一起培育。因此，该专利申请没有提及在木质纤维素水解产物上繁殖酵母所涉及的特定问题和相关解决方案。
WO2014072232A1公开了酵母的有氧繁殖工艺，其中酵母在反应器中生长，包括以下步骤：a)用碳源和初始酵母菌群填充反应器，b)任选地在反应器中以分批方式生长初始酵母菌群，c)测量反应器中的pH值，d)以分批进料方式向反应器中以一定速率添加木质纤维素水解产物，以使反应器中的pH值处于预定值，并且e)在充分繁殖后，从反应器中隔离酵母。步骤a)的碳源可以是稀释的木质纤维素水解产物，其中提供木质纤维素水解产物的稀释以降低木质纤维素水解产物的抑制剂化合物的作用。在工业规模上控制以进料分批模式的生长是困难的，并且增加了成本，以及在木质纤维素水解产物上的繁殖过程中维持有氧条件需要强烈的搅拌和高气流。此外，该专利申请没有认识到生物污染物的存在是繁殖步骤中的关键。也就是说，细菌或者野生酵母污染在繁殖期间很少有问题，因为酵母繁殖罐比发酵罐小而且更容易清洁。除清洁外，可以添加抗菌产品以防止不需要的微生物生长。
US8450094公开了一种在用于繁殖的培养基上繁殖酵母的方法，其中，将木糖作为细胞团生长的碳源提供给培养基。第一细胞团在有氧条件下繁殖，第二细胞团中具有每体积培养基每分钟至少1.0体积空气的气流，其在后续步骤中任选地在第三细胞团中繁殖。该专利中公开的生产合理数量酵母的后续方法需要在有利于生物污染物的条件下长的繁殖时间，因此需要对碳源进行灭菌。
因此需要一种可以在工业规模上使用的、在木质纤维素原料水解产物上繁殖酵母菌的方法。据信所公开的方法克服了在使用木质纤维素原料水解产物时的上述缺点，提供了一种以工业规模在木质纤维素原料水解产物上繁殖酵母的解决方案。
概要
公开了一种用于繁殖酵母的方法，所述酵母能够发酵木质纤维素原料水解产物的葡萄糖和木糖，所述方法包括在至少第一和第二繁殖周期中繁殖酵母。第一繁殖周期(Pn，其中n＝1)包括以下步骤：使酵母以起始酵母密度与包括第一部分木质纤维素原料水解产物的第一培养基接触；并且允许酵母繁殖以产生包括水和第一繁殖酵母的第一粘稠培养液，其中第一培养基中至少50％的葡萄糖和少于20％的木糖在第一繁殖周期中被消耗。第二周期(P2，n＝2)包括以下步骤：将第一粘稠培养液分离成至少第一去除部分和第一残留部分，其中第一残留部分和第一去除部分都包括一些第一繁殖酵母；使第一残留部分与包括第二部分木质纤维素原料水解产物的第二培养基接触；并且允许酵母繁殖以产生包含水和第二繁殖酵母的第二粘稠培养液，其中第二培养基中至少50％的葡萄糖和少于20％的木糖在第二繁殖周期中被消耗。
所公开的方法可以进一步包括后续繁殖周期Pn，其中n是大于2的整数并且比前一个周期的周期数(n-1)大1，每个繁殖周期Pn包括以下步骤：将Pn-1粘稠培养液分离成至少Pn-1去除部分和Pn-1残留部分，其中Pn-1残留部分和Pn-1去除部分都包括一些Pn-1繁殖的酵母；接触至少一个之前周期的粘稠培养液的残留部分和包括Pn部分的木质纤维素原料水解产物的Pn培养基；并且允许酵母繁殖以产生Pn粘稠培养液，其中Pn培养基中至少50％的葡萄糖和少于20％的木糖在Pn繁殖周期中被消耗。
还公开了允许酵母在繁殖周期Pn中繁殖的步骤可以以分批模式进行，其中n是等于或大于1的整数。
进一步公开了第一繁殖周期中的起始酵母密度可以是以湿基计在每毫克第一培养基中1×106至1×108个酵母细胞的范围内。
还公开了可以选择Pn-1去除部分的量和木质纤维素原料水解产物的Pn部分的量，以使Pn繁殖周期中起始酵母密度以湿基计每毫克Pn培养基的酵母细胞在在1×106至1×108范围内，其中n是大于1的整数。
进一步公开了Pn繁殖周期中的起始酵母密度，其中n是大于1的整数，可以大于第一繁殖周期中的起始酵母密度。
还公开了Pn繁殖周期中的最终酵母密度可以在以湿基计每毫克Pn粘稠培养液中1×107至1×109个酵母细胞的范围内，其中n是等于或者大于1的整数。
进一步公开了第一繁殖周期的繁殖时间可以是小于选自30小时、25小时和20小时组成的组的值。
还公开了Pn繁殖周期的繁殖时间可以是小于选自由第一繁殖时间的70％、50％和40％组成的组的百分比值，其中n是大于1的整数。
进一步公开了培养基可以进一步包括氮源。
还公开了该方法中可以不添加维生素和/或微量元素。
进一步公开了木质纤维素原料水解产物可以包括生物污染物，并且在起始Pn培养基中生物污染物的密度可以在选自由起始Pn培养基的100CFU/ml至106CFU/ml、101CFU/ml至105CFU/ml，和102CFU/ml至103CFU/ml组成的组的范围内的，其中n是等于或大于1的整数。
还公开了木质纤维素原料水解产物可以不进行任何灭菌。
进一步公开了可以不向该方法中添加抗菌剂。
还公开了木质纤维素原料水解产物可以是包括水不溶性预处理的木质纤维素原料的浆液。
进一步公开了Pn培养基的干物质可以小于30％并且大于选自由5％、10％、15％和20％组成的组的百分比值，其中n是等于或者大于1的整数。
还公开了所有繁殖周期可以在唯一的繁殖容器中进行。
进一步公开了繁殖容器可以在繁殖周期之间和/或繁殖周期期间不经受任何灭菌和/或清洁。
还公开了所公开的方法可以进一步包括以下步骤：在至少一个发酵容器中引入一个或多个Pn去除部分和包括另一部分木质纤维素原料水解产物的发酵培养基；允许酵母发酵葡萄糖和木糖以产生包括发酵产物的发酵液，其中n是等于或大于1的整数。
详述
公开了一种多步骤方法，用于在各自的培养基上以两个或更多个繁殖周期来顺序地繁殖酵母，每个培养基包括一部分木质纤维素原料水解产物。酵母能够发酵葡萄糖和木糖单糖，其为木质纤维素原料水解产物的两种主要糖组分。
根据一个方面，所公开的方法提供了一种解决方案，该解决方案可以在工业规模上实施，克服在真实转换设备中发生的问题。
根据另一方面，所公开的方法允许从少量酵母开始生产在随后的发酵步骤中所需的酵母，从而显著地降低发酵成本。
根据另一方面，在所公开的方法中，酵母繁殖发生在转化设备中已经可获得的木质纤维素原料水解产物上，从而避免或者大大降低与昂贵的碳源相关的成本。
根据另一方面，所公开的方法使得能够使用木质纤维素原料水解产物，其可以包含不可忽略水平的生物污染物，而无需使用任何灭菌剂或工序。
根据另一方面，在所公开的方法中，酵母繁殖可以在不添加维生素和其他昂贵营养素的情况下发生。
根据另一方面，在所公开的方法中，酵母繁殖进行的繁殖时间比本领域公开的方法短。
在本公开的上下文中，通过“繁殖酵母”或者“酵母生长”或者“产生酵母”，意指通过在合适的条件下用碳源和任选的其他营养素饲喂初始酵母量来获得增加的酵母量或者酵母生物质的量的方法。酵母生物质的量或酵母量的增加通过增加全部生成的酵母细胞的数量而发生，并且可以通过在繁殖步骤的开始和结束时或者在繁殖步骤期间确定细胞密度来验证。细胞密度可以通过在繁殖步骤的不同时间对培养基的代表性样品中存在的酵母细胞进行计数来确定。
所公开方法的酵母不仅能够发酵C6单糖，优选葡萄糖，而且能够发酵C5单糖，优选木糖。由于天然存在的酵母通常不能摄取木糖，因此在所公开的方法中使用的酵母优选是非天然存在的酵母或者衍生自非天然存在的酵母。
术语“非天然存在的”酵母意指微生物具有至少一种基因改变，其通常在参考物种天然存在的菌株中不存在，包括参考物种的天然存在的菌株，以使天然存在的酵母成为能够发酵葡萄糖和木糖。基因改变可以包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达的核酸，其他核酸添加，核酸缺失和/或酵母遗传物质的其他功能性破坏的修饰。这些修饰可以包括，例如，编码区和其功能片段，用于参考物种的异源、同源或者异源和同源多肽。附加的修饰可以包括，例如，非编码调节区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。
本公开的非天然存在的酵母可以包含稳定的基因改变，其是指能够繁殖超过五代而不减少改变的酵母。通常，稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰，特别稳定的修饰将持续超过约25代，更特别地，稳定的遗传修饰将大于50代，包括无限期。
本公开的酵母可以选自任何已知属和种的酵母。例如N.J.W.Kreger-van Rij描述的酵母，“酵母，”酵母生物学第1卷，第2章，A.H.Rose和J.S.Harrison编辑，学术出版社，伦敦，1987年。在一个实施方案中，酵母选自酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、拿逊酵母属(Nadsonia)、油脂酵母属(Lipomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、三角酵母属(Trigonopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)、短梗霉属(Aureobasidium)、油脂酵母属(Lipomyces)、法夫酵母属(Phaffia)、红酵母(Rhodotorula)、耶氏酵母属(Yarrowia)和许旺酵母属(Schwanniomyces)所组成的组。优选地，酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
在所公开的方法中，用于繁殖酵母的主要碳源是衍生自木质纤维素原料的水解产物。木质纤维素原料的详细描述可以在WO2015028156A1第11-14页中找到，其通过参考方式并入本文。优选的木质纤维素原料选自农业残余物，特别是秸秆，例如麦秆、稻草，或者蔗渣，例如甘蔗渣的组。硬木和软木也受益于这一方法。任选地，也可以使用其他碳源如磨拉石或合成糖，但木质纤维素原料水解产物的单糖按重量计优选为该过程中使用的总碳源的至少80％、更优选为至少90％、最优选为至少95％。在甚至最优选的实施方案中，木质纤维素原料水解产物是用于繁殖酵母的公开方法中使用的唯一的碳源。
木质纤维素原料水解产物优选通过多步骤方法衍生自木质纤维素原料，所述方法包括预处理木质纤维素原料以产生预处理的木质纤维素原料，并对预处理的木质纤维素原料进行酶水解。预处理增加了其中所含碳水化合物对酶的作用的可及性。优选的预处理包括在加压反应器中用汽相水对木质纤维素原料进行水热处理，并通过快速释放施加到原料上的压力来蒸汽爆破水热处理的原料。水热处理优选在130℃至230℃的温度范围下进行1分钟至180分钟。优选通过蒸汽在至少10巴的压力下对反应器加压，以获得原料的有效分解。
在一个实施方案中，木质纤维素原料经受浸泡过程或步骤，以在加压反应器中水热处理之前去除原始木质纤维素原料中包含的一部分非木质纤维素化合物，例如无机盐、蜡和有机酸。在浸泡步骤或过程中，也可以分离外部污染物，例如地面、石头和收获残余物。浸泡过程优选包括将木质纤维素原料引入包括水的浸泡液体中，所述浸泡液体的温度为20℃至100℃，更优选为40℃至70℃，并且浸泡时间为30秒至30分钟，更优选为3分钟至15分钟。
任选地，木质纤维素原料在水或者包括水的液体中进行初步水热处理，以在引入加压反应器容器之前溶解包含在木质纤维素原料中的一部分水不溶性碳水化合物。初步水热处理在加压条件下，在水以蒸汽或者液相或其混合物存在下，在100℃至190℃，优选130℃至180℃，最优选140℃到170℃的温度下进行。初步水热处理进行的时间为在10分钟至3小时，优选15分钟至3小时，最优选20分钟至60分钟的范围内。初步水热处理主要溶解木质纤维素原料的半纤维素组分，其可在较高温度下经受热降解，并且由此将包括水和水溶性木糖聚合物和低聚物以及任选其他半纤维素衍生的糖的液体与固体木质纤维素原料分离。
对预处理的木质纤维素原料进行酶水解以将聚合和低聚糖水解成单糖，包括葡萄糖和木糖。酶水解包括在促进酶活性的条件下使浆液形式的预处理的木质纤维素原料与酶或者酶组合物接触。因此，通过将预处理的木质纤维素原料与包括水的液体混合以使干物质优选在10％至25％之间，来提供预处理的木质纤维素原料的浆液；任选地，当实施初步水热处理时，也可以使用至少一部分包括水和其中产生的溶解的木糖聚合物和低聚物的液体。酶水解通常在4.5至5.0之间的pH和45℃至55℃之间的温度下进行，并且在混合搅拌下水解时间为24小时至72小时。
酶水解可以在一个或多个步骤中进行。优选地，酶水解在分离的水解容器中分两步进行。在第一个水解步骤中，在第一容器中进行12小时至30小时的时间，获得预处理的木质纤维素原料的部分水解，以获得预处理的木质纤维素原料的液化，从而获得部分水解的粘度低于初始浆液的混合物。然后将部分水解的混合物移入第二水解容器，其中第二水解步骤持续12小时至60小时的时间以获得木质纤维素原料水解产物，其包含水、残余的水不溶性预处理的木质纤维素原料以及包括葡萄糖和木糖的水溶性糖。木质纤维素原料水解产物可以进一步包括其他C6和C5水溶性单糖，通常浓度分别低于葡萄糖和木糖。
甚至更优选地，酶水解根据WO2010113130的教导进行，其以参考方式并入本文。
可以从木质纤维素原料水解产物中除去至少一部分残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料。残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料的分离可以例如通过倾析、离心或者挤压木质纤维素原料水解产物或其组合来获得。然而，即使在所公开的繁殖过程中残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料的存在可能引起混合问题，浸泡在残余固体中的一些水溶性单糖可以在分离步骤中从木质纤维素原料水解产物中取出并丢失，因此，在优选的实施方案中，不进行固体去除，并且木质纤维素原料水解产物是包括水不溶性预处理的木质纤维素原料的浆液。
从木质纤维素原料衍生木质纤维素原料水解产物的上述一个或多个方法是示例性和优选的实施方案，以提供用作根据所公开的方法繁殖酵母的主要碳源的木质纤维素原料水解产物，并且应理解它们并非旨在以任何方式限制本发明的范围。
木质纤维素原料水解产物可具有5％至30％，优选10％至20％的干物质。
木质纤维素原料水解产物的葡萄糖浓度以湿基计可以在20g/Kg至100g/Kg木质纤维素原料水解产物的范围内，优选为30g/Kg至70g/Kg，最优选为40g/Kg至50g/Kg。
木质纤维素原料水解产物的木糖浓度以湿基计可以在10g/Kg至40g/Kg木质纤维素原料水解产物的范围内，优选为15g/Kg至30g/Kg，最优选为20g/Kg至25g/Kg。
木质纤维素原料水解产物可以进一步包括选自乙酸、甲酸、糠醛和羟甲基糠醛(5-HMF)的清单的抑制剂化合物，其在先前的预处理和水解步骤或过程中形成，并抑制酵母生长，至少导致增长率延迟。
特别地，乙酸可以具有以湿基计2g/Kg至7g/Kg木质纤维素原料水解产物的浓度。
木质纤维素原料水解产物可以进一步含有生物污染物，如通常在工业规模操作中发生的。生物污染物是与根据所公开的方法繁殖的酵母不同的微生物，并且其存在通常对所公开的方法的产率有害，消耗一部分完全可用于所需酵母生长的单糖。生物污染物可包括细菌和真菌，以及与待繁殖的所需酵母不同的酵母，例如野生型酵母。细菌乳酸菌，特别是乳杆菌属，是主要的细菌污染物。通常将发酵混合物的乳酸浓度作为污染程度的衡量标准。通过对木质纤维素原料水解产物、培养和发酵基以及该过程中涉及的设备进行灭菌来控制生物污染，其可以通过添加抗菌剂(例如抗生素或者其他无菌剂)或者通过灭菌程序(例如巴氏杀菌法)获得，通过在发酵/繁殖过程之前、之间或期间施加物理因子，其中包括热、光和辐射。“灭菌”在此被认为是生物污染物密度降低至少100倍。在所公开的方法中优选避免使用引入额外成本的抗菌剂和灭菌程序，同时将生物污染物的生长保持在合理的低水平。
优选地，木质纤维素原料水解产物不经受任何灭菌步骤或程序，这在工业规模上实施是困难和昂贵的。
优选地，在所公开的方法中没有使用抗菌剂，也没有在公开的方法之前将它们加入木质纤维素原料水解产物中。
在所公开的方法中，酵母在顺序的繁殖周期中，在此由Pn表示，其中n大于或等于1，在各自的培养基上繁殖，其包括不同的木质纤维素原料水解产物的等分试样。所公开的繁殖过程包括至少两个繁殖周期。为了降低整个过程中起始酵母的成本，优选繁殖周期至少为3，更优选至少为5，最优选至少为7。即使没有理论限制，也可以认为繁殖周期可以重复多达20次而不改变酵母发酵葡萄糖和木糖的能力。
优选地，每个繁殖周期以分批模式进行，其中木质纤维素原料水解产物在开始繁殖周期之前或在繁殖周期的开始时加入。
在第一繁殖周期中，使第一数量的酵母与第一培养基接触，并保持在促进酵母繁殖的条件下以产生第一繁殖酵母。在随后的每个繁殖周期Pn中，在先前的繁殖周期中繁殖的酵母的一部分用作运行繁殖周期Pn的接种物，先前的繁殖周期优选地是紧接在前的繁殖周期Pn-1。因此，将适量的先前繁殖的酵母与Pn培养基接触并使其繁殖以产生Pn繁殖的酵母。在所有繁殖周期Pn中，取决于繁殖条件，一部分糖碳可被酵母细胞转化为发酵产物。乙醇是优选的发酵产物。
第一繁殖周期相对于所有后续繁殖周期具有明显的特征。也就是说，在第一繁殖周期中，使用起始酵母。当起始酵母与第一培养基接触时，酵母最初的糖摄取不会显著发生。该时期称为迟滞期并且可以认为是酵母对木质纤维素原料水解产物的适应期，其中酵母生长可忽略不计。在随后的繁殖周期Pn中使用的酵母，其中n大于1，是在木质纤维素原料水解产物上繁殖的酵母，因此相应的迟滞期Pn相对于第一繁殖周期的迟滞期显著降低。
糖摄取速率是所公开方法的重要参数，特别是在木质纤维素原料水解产物包括一些生物污染物且不使用灭菌和抗菌剂的情况下，因为在这些条件下生物污染物的竞争性生长得到了增强。酵母的葡萄糖摄取相对于木糖摄取是最受欢迎的，因此繁殖培养基中的葡萄糖浓度将开始降低，而木糖摄取将不会显著进行直至葡萄糖浓度降低至某一临界值以下。随着酵母对培养基中剩余糖的亲和力降低，酵母的总糖摄取速率将随时间降低，使得生物污染物的竞争性生长有利。因此，在所公开的方法中，所有繁殖周期Pn，其中n是等于或大于1的整数，被延长足够的时间以消耗起始繁殖培养基中包含的至少50％的葡萄糖，和起始繁殖培养基中包含的少于20％的木糖。缩进的是葡萄糖和木糖消耗量是在繁殖步骤期间发生的总消耗量，并且可以通过测量繁殖培养基中的相应糖浓度来验证。因此，在繁殖周期Pn中发生的总糖消耗还包括生物污染物对糖的摄取，其旨在所公开的方法中被最小化，并且还包括最终转化为发酵产物的糖。为了在产生的酵母生物质方面提高该方法的产率，优选地，繁殖周期进行的繁殖时间足以消耗起始繁殖培养基的至少70％的葡萄糖，最优选至少80％。同时，为了避免总糖摄取速率达到生物污染物的竞争性生长的临界值，优选地，繁殖周期Pn延长一段足以消耗起始培养基中少于10％的木糖的繁殖时间，最优选少于5％。应注意，所公开的方法的每个繁殖周期可以通过特定的葡萄糖和木糖消耗和繁殖时间来表征，条件是这些参数在公开的范围内。还应注意，虽然在繁殖步骤中消耗的木糖总量优选大于0，但在某些情况下，至少在第一繁殖周期中木糖可能不会被明显消耗。也就是说，由于其较长的迟滞期，第一繁殖周期通常需要繁殖时间，该繁殖时间大于后续繁殖周期中的繁殖时间。第一繁殖周期可以进行小于30小时，但优选小于25小时，更优选小于20小时，最优选小于16小时的繁殖时间。后续Pn繁殖周期的繁殖时间，其中n是大于1的整数，优选小于第一繁殖时间的70％，更优选小于50％，最优选小于40％。
即使可以使用多于一个的繁殖容器，优选地，所有繁殖周期都在唯一的繁殖容器中进行。为了使成本最小化，繁殖容器优选在繁殖周期之间和/或繁殖周期期间不经受任何灭菌和/或清洁。
为了限制生物污染物的竞争性生长的影响，木质纤维素原料水解产物优选在用于所公开的方法之前保持在45℃至55℃的温度，并且最优选在酶水解或者最终的酶水解步骤的温度下。在此温度下，生物污染物的活性显著降低。
在每个繁殖周期Pn中，其中n是等于或大于1的整数，木质纤维素原料水解产物的一部分Pn用于形成培养基。木质纤维素原料水解产物的该部分Pn的温度降低至繁殖周期Pn的繁殖温度，其优选在28℃至35℃的范围内。热交换器可用于将木质纤维素原料水解产物的该部分Pn冷却至繁殖容器中或者在进入繁殖容器之前的繁殖温度。
可以使用水或包括水的液体，以及与木质纤维素原料水解产物不同的任选的有限数量的额外碳源来实现所需的干物质。所公开方法提供的优点之一是在干物质下进行的可能性高于使用木质纤维素水解产物作为主要碳源的其它已知方法。培养基的干物质优选小于30％，因为它难以搅拌，并且优选大于5％，更优选大于10％，甚至更优选大于15％，最优选大于20％。可以在低于繁殖温度的温度下加入水或者包括水的液体以冷却木质纤维素原料水解产物的该部分Pn。
因此，在起始Pn培养基中的生物污染物的密度可以保持在合理水平，其可以在起始Pn培养基的100CFU/ml至106CFU/ml的范围内，优选为101CFU/ml至105CFU/ml，最优选为102CFU/ml至103CFU/ml，其中n是等于或者大于1的整数。
培养基Pn，其中n是等于或大于1的整数，还可以包括氮源，通常是尿素，其是酵母的廉价营养源，但优选不含添加的维生素和/或微量元素，其通常在实验室规模上用作生长补充剂，但是非常昂贵。换句话说，优选地，在该过程期间或在该过程之前的步骤中，不向木质纤维素原料水解产物和培养基中添加维生素和/或微量元素。
优选地，培养基Pn的pH值调节至5.0至5.5的值，例如通过添加例如适量的碱(氢氧化钠溶液)。如果需要将pH值保持在所需范围内，可在繁殖步骤期间加入额外的等分试样的碱。
在第一繁殖周期中，酵母可以添加到第一培养基中，或者添加到用于形成第一培养基的组分中。在一个实施方案中，将酵母添加到用于形成第一繁殖培养基的木质纤维素原料水解产物的第一部分中。与第一培养基接触的酵母量将根据第一繁殖培养基的总体积而变化。优选地，在第一繁殖周期中，加入一定量的酵母，使得起始酵母密度以湿基计为每毫克第一培养基的酵母细胞在1×106至1×105个之间。
在所有繁殖周期Pn中，其中n是等于或者大于1的整数，繁殖优选在有氧条件下发生，以增强所产生的繁殖酵母的量。有氧条件的特征在于繁殖培养基中的平均氧饱和度大于10％。氧饱和度是培养基中溶解的氧的浓度(O2)与在稳定平衡下的温度和压力下将在培养基中溶解的最大氧气量之比。因此，氧气、空气或者包括氧气的其他气体混合物的流动被插入繁殖培养基中，优选地以50vvm和200vvm之间的平均流速。为了促进繁殖培养基中的氧扩散，还可以向繁殖培养基提供搅拌或混合。在繁殖步骤的至少一部分期间可以保持有氧条件。在一些情况下，可以通过作用于培养基的混合来实现有氧/无氧条件的特定循环间隔。
在Pn繁殖周期结束时，其中n是等于或者大于1的整数，获得包括水和第一繁殖酵母的Pn粘稠培养液。粘稠培养液还可以进一步包括发酵产物、不被酵母消耗的水溶性糖和残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料，其中的发酵产物即乙醇，其通过酵母的发酵活性产生。在一个优选的实施方案中，木质纤维素原料水解产物还包括来自一个或多个水解步骤的残余酶，其一部分仍然是有活性的。即使繁殖条件对酶活性不是最佳的，但残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料中的一部分水不溶性碳水化合物可以水解成因此可供酵母使用的额外的水溶性糖。在这种情况下，酵母消耗的葡萄糖和木糖的总量将考虑额外的水溶性糖。
在所有繁殖周期Pn中，将产生一定量的繁殖酵母，其可以是相应的酵母起始量的5至15倍。相同的优选范围适用于酵母细胞密度。优选地，在Pn繁殖周期中，最终酵母密度以湿基计为每毫克第一培养基在1×107至1×109个酵母细胞之间。
在随后的繁殖周期Pn中，其中n是大于1的整数，然后将Pn-1粘稠培养液分成至少两个部分，即Pn-1粘稠培养液的去除部分和残留部分，每个部分包括一些先前繁殖的酵母Pn-1的一部分。优选的分离包括Pn-1残留部分和Pn-1去除部分中Pn-1粘稠培养液的分开，其中两部分具有相同的组成。在最优选的实施方案中，从繁殖容器中除去Pn-1粘稠培养液的去除部分，并将Pn-1残留部分留在繁殖容器中进行Pn繁殖周期。在一些实施方案中，分离可以包括选择性分离粘稠培养液的特定组分，例如通过过滤或离心，以产生具有不同组成的两个部分。因此，在一些情况下，这两个部分的特征在于具有粘稠酵母的不同密度。在一些实施方案中，这两个部分可以具有不同含量的残余水不溶性预处理木质纤维素原料。
在第一繁殖周期(Pn-1)之后，该过程经历如上所述用于繁殖周期的第二繁殖周期(Pn-2)，其中n是大于1的整数。
残留部分Pn-1的量优选为以湿基计小于Pn-1粘稠培养液重量的50％，更优选小于40％，最优选小于25％。
在第一繁殖P1之后的每个繁殖周期Pn中，来自先前繁殖周期的残余部分用作酵母接种物。优选地，在繁殖周期Pn中，使用紧接在前的繁殖周期Pn-1的残留部分。因此，来自先前繁殖周期的残余部分与包括木质纤维素原料水解产物的相应部分Pn的培养基接触。在一个优选的实施方案中，将木质纤维素原料水解产物的Pn等分试样加入到包含来自Pn-1繁殖周期的残留部分的繁殖容器中以形成Pn培养基。由于竞争性污染物繁殖，在Pn繁殖周期中使用的残留部分中的生物污染物的密度可以大于木质纤维素原料水解产物中的生物污染物的密度。木质纤维素原料水解产物的合适部分Pn的添加将在起始Pn繁殖培养基中将生物污染物的密度稀释至所需值。
优选地，选择来自先前繁殖周期的残余部分的量和用于形成Pn培养基的木质纤维素原料水解产物的Pn部分的量，以在Pn繁殖周期中具有比在第一繁殖周期中的起始酵母密度大的起始酵母密度。
甚至更优选地，选择来自先前繁殖周期的残余部分的量和用于形成Pn培养基的木质纤维素原料水解产物的Pn部分的量，以在Pn繁殖周期中具有某一起始酵母密度，其大于以湿基计每毫克Pn培养基在1×106至1×108个酵母细胞之间，其中n是大于1的整数。
粘稠培养液中的去除部分，其包括在不同繁殖周期中繁殖的酵母，之后可以用于发酵包括水溶性糖的发酵培养基以产生发酵产物。优选地，发酵产物是乙醇。
在一个优选的实施方案中，在发酵容器中使粘稠培养液的一个或者多个去除部分的与包括另一部分木质纤维素原料水解产物的发酵培养基接触。木质纤维素原料水解产物用作碳源以形成发酵培养基，以这种方式使得繁殖的酵母已经适应发酵培养基。残留的木糖和任选地包含在粘稠培养液的去除部分中的葡萄糖也在该过程中发酵，以增加总发酵产率。发酵产生发酵液，其包括可以分离和回收的发酵产物。
试验
木质纤维素原料水解产物的制备
选择小麦秸秆用于证明所公开的方法。
首先，通过在158℃的温度下进行初步水热处理65分钟，对原料进行预处理，首先溶解原料。该方法产生预处理的原料浆液，其通过挤压机分离成固体部分和液体部分，液体部分主要包含低聚物。将该固体部分用蒸汽在204℃下进行水热处理4分钟，然后蒸汽爆破，以产生固体的预处理木质纤维素原料。
将固体的预处理木质纤维素原料和包括低聚物的液体部分在生物反应器中混合，并加入水以获得干物质重量含量为15％的预处理的木质纤维素原料浆液，通过添加氢氧化钠将pH值调节至5.0±0.2，然后将经预处理的木质纤维素原料浆液进行酶水解。
加入能够水解C6和C5糖的诺维信(Novozymes)商业酶合剂CTec3，相当于预处理的木质纤维素原料中每克葡聚糖7％的蛋白质毫克的剂量，并且浆液在连续搅拌72小时、在50℃下水解。
得到的木质纤维素原料水解产物是浆液，其干物质重量为15％，包括液体馏分和残留的水不溶性预处理的木质纤维素原料。水解产物的组成报告在表1中。在表中，残余的水不溶性预处理的木质纤维素原料在其组分中分离(不溶性葡聚糖、不溶性木聚糖和木质素以及其他不溶物)。乙酸、甲酸、糠醛、羟甲基糠醛是酵母繁殖的抑制性化合物。
乳酸是由细菌污染产生的，因此被认为是细菌存在的标志。因此，木质纤维素原料水解产物中存在某种生物污染。将木质纤维素原料水解产物保持在50℃的温度直至其用于以下繁殖实验。没有引入抗生素。
表格1基于湿基的木质纤维素原料水解产物的组成
繁殖试验
根据能够在工业规模上实施的程序，通过执行三个连续的繁殖周期来证明所公开的方法。在这些周期之间没有进行灭菌。
表2中报道了培养基和粘稠培养液的组成。表中仅考虑了与该过程相关的水溶性化合物。尚未报道其他水溶性化合物和固体化合物。
在第一繁殖周期中，在生物反应器中插入1.2L体积的热木质纤维素原料水解物浆液，并补充1.5g/L的尿素溶液，形成第一培养基。通过控制氢氧化钠将pH值设定为5.2±0.1。没有使用维生素和其他营养素。在插入酵母之前将培养基冷却至32℃。
在空气流量为1VVh的有氧条件下，在300rpm的搅拌下以分批配置进行每个周期中的繁殖。VVh对应于每小时每个培养基体积流动的气体体积。
通过细胞计数(Neubauer细胞计数室)确定酵母细胞密度，并通HPLC分析培养基的组成以确定残留葡萄糖和木糖以及酵母繁殖的关键化合物的浓度。两次测量均在每个繁殖周期的开始和结束时进行。
在第一繁殖周期中，由Leaf Technologies提供的能够发酵葡萄糖和木糖的商业转基因酵母CelluXTM2，以每毫克培养基中1.3×107个酵母细胞的起始酵母密度插入培养基中。
考虑到初始迟滞期，第一个繁殖周期进行14小时的繁殖时间。在第一粘稠培养液中实现酵母细胞浓度为每毫克1.5×108个酵母细胞。通过计算生长因子来评估生长表现，所述生长因子是在繁殖结束和开始时酵母细胞浓度之间的比率。在第一繁殖周期中获得约10的生长因子。
消耗了起始第一繁殖培养基中约76％的初始葡萄糖和小于10％的初始木糖。乳酸浓度没有显着增加，表明细菌污染物的繁殖处于合理水平。还产生了一定量的乙醇。
在第一繁殖周期结束时，从生物反应器中取出一部分第一粘稠培养液，并将约240mL第一粘稠培养液的残留部分留下进行第二个繁殖周期。
在第二繁殖周期中，用在引入之前冷却至约32℃的第二部分木质纤维素原料水解产物再填充生物反应器，并补充尿素。与第一次繁殖一样，第二培养基的体积为1.2L。因此，木质纤维素原料水解产物的第二部分占第二培养基的约80％，第一粘稠培养液的残留部分占第二培养基的约20％(新鲜水解产物与残留水解产物的比例为4：1)。
起始第二培养基中的葡萄糖含量略低于第一培养基中的葡萄糖含量，因为第一粘稠培养液的残留部分中葡萄糖贫化。此外，在第二培养基中存在一些乙醇，即使在没有问题的繁殖水平下也是如此。由此，在第二繁殖培养基中存在乙醇的起始浓度时发生第二次繁殖。第二繁殖周期中的起始酵母浓度为5.3×107。与第一培养基类似，乳酸以低浓度存在。
第二次繁殖进行6小时。在对应于约3.2的生长因子的第二粘稠培养基中实现每毫克酵母细胞浓度为1.7×108个酵母细胞。
消耗了起始第二繁殖培养基中约66％的初始葡萄糖和小于10％的初始木糖。同样，乳酸的浓度没有显著增加，表明细菌污染物的繁殖处于合理的水平，并且还产生了一定量的乙醇。
在繁殖周期2完成之后，根据与繁殖周期2相同的过程执行第三周期(第三繁殖时间6小时)。
起始酵母细胞浓度为4.2×107，并且在对应于约3的生长因子的第三粘稠培养基中实现酵母细胞浓度为每毫克1.3×108个酵母细胞。
在起始第三繁殖培养基中约63％的初始葡萄糖和少于10％的初始木糖被消耗，产生的乳酸很少。
表格2繁殖周期的起始培养基(t0)和粘稠培养液(t14，t6)的组成
发酵试验
将繁殖培养液的去除部分用作发酵木质纤维素原料水解产物不同等分试样的接种物。
在每个发酵步骤中，将960mL木质纤维素原料水解产物的等分试样引入发酵容器中，冷却至约32℃，然后加入体积为240ml的繁殖培养液的每个去除部分以形成相应的发酵培养基。通过氢氧化钠溶液将pH值设定为5±0.1，并补充1.0g/L的尿素溶液。因此，在每个发酵步骤中，用作接种物的相应去除部分的体积是发酵培养基总体积的约1：5。
在没有气流的情况下，以分批配置进行48小时发酵，在300rpm的搅拌下保持温度为32℃。在发酵中，通过木质纤维素原料水解产物中包含的酶继续酶水解残余的水不溶性预处理的木质纤维素原料，并且一些额外的糖可用于酵母。
在发酵步骤的开始(t0，发酵培养基)和结束(t48，发酵液)测量发酵培养基和发酵液的组成，并报告在表3中。应注意，所有发酵培养基都含有来自用新鲜木质纤维素原料水解产物稀释的相应繁殖培养液的一些乙醇；乙醇浓度足够低，不会对发酵步骤产生问题。在所有发酵步骤中，细菌污染非常低或可忽略不计，由乳酸浓度证实的细菌污染是稳定的。
几乎发酵培养基中的单糖被繁殖的酵母消耗，表明遗传修饰的酵母在多个繁殖/发酵周期中保持了其发酵葡萄糖和木糖的能力。
表3发酵循环的起始发酵培养基(t0)和发酵液(t48)的组成