耻垢分枝杆菌的遗传修饰株的制作方法

本发明涉及基于非病原性细菌的重组细菌，所述细菌具有含有通过分子诊断测定检测的来自病原体的目的核酸的修饰的基因组并且模拟所述病原体的诊断特征。本发明还涉及包含该重组细菌的诊断对照组合物和用于产生该重组细菌的方法。所述重组细菌是检测病原体如结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的安全，可靠的质量对照。结核病(tb)是一种毁灭性疾病，难以有效进行临床管理。其强大的性质与过时的诊断方法使得在护理点的治疗越来越困难，特别是在耐药菌株的不断增加的流行中。随着许多微生物疾病的诊断从细菌培养和显微鉴定方法转向分子生物系统，自动化需要严格的校准以确保结果的灵敏度和特异性。世界卫生组织(who)已批准两项核苷酸扩增测定(naa)诊断测试（即mtb/rif(cepheidinnovation)和genotypemdrtbpluslineprobeassay(lpa)(hain))，用于肺病患者中结核分枝杆菌的标准鉴定，其可同时鉴定该生物体以及评估rif和/或inh抗性。这使临床医生能够为患者量身定制药物治疗方案，从而不仅可以改善治疗效果，还可以限制社区的传播。在这里，我们报告相关的非病原性上壤细菌耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)的修饰菌株，其在mtb/rif(mtb/rif)和lpa中关于生物鉴定和rif抗性分析方面模拟h37rv的诊断特征(diagnosticprofile)。为了将这种方法扩展到其他疾病，我们还证明，可以将金黄色葡萄球菌基因序列引入耻垢分枝杆菌，以在设计用于鉴定金黄色葡萄球菌中的甲氧西林(methicillin)抗性的sanasalcomplete盒中产生阳性反应。该发现表明，该应用在诊断平台上具有用于产生来自非感染性生物体的替代阳性naa信号的希望。目前，mtb/rif测定的校准标准品是在结核分枝杆菌h37rv的实验室菌株中生产的，其程序冗长，危险且昂贵，因为它需要大量生产活细菌，然后将其杀死以使它们安全处理和运输。修饰的耻垢分枝杆菌有望成为大规模校准标准生产，外部质量评估和一般临床监测的替代品，因为预计这些诊断的全球需求将增加。目前who规定的tb治疗方案包括四种药物：异烟肼(inh)，吡嗪酰胺(pza)，乙胺丁醇(emb)和利福平(rif)。rif通过结合转录复合物的rna聚合酶(rnap)β亚基rpob而有效杀死结核分枝杆菌，因此抑制rna的合成从而抑制蛋白质的合成。通过非同义氨基酸取代产生抗性，所述非同义氨基酸取代阻止rif与rnap的活性位点结合，同时保留复合物的功能。在rif存在下，在临床和实验室中，敏感菌株被针对性选择，这导致抗药性突变菌株的生长。虽然rif抗性突变(rifr)在正常生长条件下具有适应性成本，但这些抗性菌株通过其染色体编码适应在所有其他rif易感(rifs)菌株死亡的条件下确保了它们自身的存活。大多数rifr菌株具有限于rpob基因内的有限序列(即81bprif抗性决定区(rrdr))的单核苷酸多态性(snp)突变。作为一线抗结核药物之一，rif的功效和低成本对于持续使用抵抗药物敏感的临床菌株至关重要。发病率和死亡率的预防因为治疗感染了对方案中的抗生素无反应的抗性菌株的患者而被不利影响。此外，这些患者促成社区中抗性细菌的传播。为了让临床医生做出明智的决定，涂片镜检不再足够。理想情况下，药敏试验(dst)需要与致病因子结核分枝杆菌的鉴定一起进行。具有多药抗药性(mdr)(即不再对rif和inh有反应)的菌株仅用emb和pza治疗有效，并且在该过程中更有可能进一步发展对这些药物的抗性。然后有必要改用替代药物方案以确保持续的功效。抗击mdr-tb的药物治疗要贵得多，需要来自由以下组成的组的至少5种不同的药物：氟喹诺酮类(左氧氟沙星或莫西沙星)，注射药物(阿米卡星，卡那霉素或卷曲霉素)，口服抑菌药物(丙硫脲，乙硫柳胺，环丝氨酸或对氨基水杨酸)和吡嗪酰胺，持续长达2年。患者依从性是主要的风险因素，特别是对于需要临床施用的可注射药物。由于体外结核分枝杆菌的缓慢生长，需要较长的培养时间来获得细菌的生长以进行鉴定，然后在存在或不存在抗生素的情况下进行额外培养以测试抗性。目前通过液体培养进行生长评估的金标准是bactectmmgittm(分枝杆菌生长指示管(mycobacterialgrowthindicatortubes))，其中测试只有在42天后才被认为是阴性的。如果在此之前的任何时间细菌出现，该测试被认为是阳性的。结果，可以再花42天来做出关于感染的决定，并且再过42天以确定该生物体的抗药性。这可能导致患者在此期间接受无效抗生素治疗，在此期间他们的健康状况将恶化并且菌株可能会扩散。分子诊断方法的最新发展在培养方法上有显著改善，因为它们直接探测痰液样品中细菌染色体的存在。正是出于这个原因，2010年who批准了两项针对结核病的核酸扩增(naa)诊断测定。实时pcr平台已经开发用于许多不同的测定。mtb/rif测定利用分子信标技术，允许naa产生实时信号。随着核酸的量随着每轮扩增而增加，更多的荧光信号被释放并且可以检测到高度特异性的序列。该测试完全是自动化的，并且无论是操作还是评估结果几乎不需要临床工作人员的指导或技能。系统依赖于一组固定的基因探针，其可以特异性识别结核分枝杆菌特异性序列，并将其与其他细菌(包括非结核分枝杆菌和相关的土壤细菌)差异区分开来。尽管在分子水平上可辨别，这些差异是非同义的，并且不影响基因的肽序列，也不影响所得rpob蛋白的功能。相同的原理允许鉴定结核分枝杆菌特异性序列，所述序列在不同位置与野生型序列不匹配。然而，在这种情况下，肽序列被改变，导致突变蛋白。这是导致抗生素抗性的表型的原因。分子线探针测定(lpa)(mtbdrplus测定，hain德国)背后的原理的不同之处在于它产生关于在扩增程序的终点处与抗药性相关的核酸含量的存在或不存在的信息。涉及若干个处理步骤，每个步骤都需要许多并行对照，并且该过程需要技术熟练的人员。金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性的圆形细菌，常见于鼻，呼吸道和皮肤上。尽管金黄色葡萄球菌并不总是致病性的，但它是皮肤感染如皮肤脓肿，呼吸道感染如鼻窦炎，以及食物中毒的常见原因。致病菌株通常通过产生毒力因子如有效的蛋白质毒素以及表达结合和灭活抗体的细胞表面蛋白来促进感染。抗生素抗性金黄色葡萄球菌菌株如甲氧西林(methicillin)抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)的出现是临床医学中的一个世界性问题。mrsa被认为是通过从另一物种水平转移获得移动遗传元件葡萄球菌盒式染色体(scc)而进化而来的。sccmec盒带有赋予甲氧西林抗性的meca基因。尽管进行了大量研究和开发，但尚未批准用于金黄色葡萄球菌的疫苗。每年有超过278,000名住院患者感染mrsa，mrsa占美国医院获得性金黄色葡萄球菌感染的60％以上。mrsa菌株特别具有毒性，迅速传播并引起比其他葡萄球菌细菌更严重的感染。mrsa的早期检测以及区分mrsa与甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的能力有助于限制感染的传播，确定治疗方案并减少医疗负担。已经表明，对mrsa感染的主动监测优化对mrsa爆发的有效性和控制程序。mrsa测定靶向开放阅读框orfx区域中的dna序列，在此处葡萄球菌盒式染色体mec(sccmec)整合到金黄色葡萄球菌染色体中。sccmec携带抗性决定簇meca，其编码甲氧西林抗性并且展示至少六种不同的结构类型和多种亚型。和广泛用于mrsa的主动监测。然而，目前没有用于测试应用于监视测试的测试准确性以便减少假阳性和阴性结果的校准或监视标准。在诊断测试中使用活细菌菌株作为阳性对照对于毒性细菌是不期望的，因为它们在实验室中在普通处理中对操作者造成风险。杀死这些细菌以产生阳性对照需要使用具有熟练工作人员的专业实验室。在这项工作中，我们已经产生了土壤细菌耻垢分枝杆菌菌株(结核分枝杆菌的非病原性亲属)以测试是否有可能将这些作为诊断程序的验证标准。测定和hainlpa需要对照以确认测定的准确性。本文报道的耻垢分枝杆菌菌株含有从结核分枝杆菌或金黄色葡萄球菌引入的核苷酸序列，其模拟临床菌株的诊断特征。预计这些菌株将显著降低验证标准物生产中的成本，时间和生物危害风险，并可能适用于其他naa平台。发明概述本发明涉及具有修饰基因组的重组细菌，所述修饰基因组包括目的核酸，所述目的核酸可通过分子诊断测定检测，使得重组细菌模拟测定中目标病原体的诊断特征。根据本发明的第一方面，提供了一种重组细菌，其中所述重组细菌是具有含有来自病原体的目的核酸的修饰的基因组的非病原性细菌，其中所述目的核酸能通过分子诊断测定检测，并且其中所述重组细菌模拟病原体的诊断特征。在本发明的一个优选实施方案中，非病原性细菌是耻垢分枝杆菌。在本发明的第二实施方案中，病原体可以选自由以下组成的组：不动杆菌属物种(acinetobacterspp.)，放线杆菌属物种(actinobacillusspp.)，放线菌属物种(actinomycetesspp.)，气单胞菌属物种(aeromonasspp.)，芽孢杆菌属物种(bacillusspp.)，博德特菌属物种(bordetellaspp.)，疏螺旋体属物种(borreliaspp.)，布鲁杆菌属物种(brucellaspp.)，弯曲杆菌属物种(campylobacterspp.)，衣原体属物种(chlamydiaspp.)，梭菌属物种(clostridiumspp.)，棒状杆菌属物种(corynebacteriumspp.)，肠杆菌属物种(enterobacterspp.)，肠球菌属物种(enterococcusspp.)，欧文氏菌属物种(erwiniaspp.)，丹毒丝菌属物种(erysipelothrixspp.)，埃希氏菌属物种(escherichiaspp.)，弗朗西斯氏菌属物种(francisellaspp.)，克雷伯菌属物种(klebsiellaspp.)，嗜血菌属物种(haemophilusspp.)，军团菌属物种(legionellaspp.)，钩端螺旋体属物种(leptospiraspp.)，李斯特菌属物种(listeriaspp.)，莫拉菌属物种(moraxellaspp.)，分支杆菌属物种(mycobacteriumspp.)，支原体属物种(mycoplasmaspp.)，奈瑟球菌属物种(neisseriaspp.)，诺卡尔菌属物种(nocardiaspp.)，巴氏杆菌属物种(pasturellaspp.)，假单胞菌属物种(pseudomonasspp.)，立克次体属物种(rickettsiaspp.)，沙门氏菌属物种(salmonellaspp.)，志贺氏菌属物种(shigellaspp.)，螺旋菌属物种(spirillumspp.)，葡萄球菌属物种(staphylococcusspp.)，链杆菌属物种(streptobacillusspp.)，链球菌属物种(streptococcusspp.)，链霉菌属物种(streptomycesspp.)，密螺旋体属物种(treponemaspp.)，弧菌属物种(vibriospp.)，耶尔森菌属物种(yersiniaspp.)和黄单胞菌属物种(xanthomonasspp.)。优选病原体是结核分枝杆菌或金黄色葡萄球菌。根据本发明的第三实施方案，目的核酸可以包括来自结核分枝杆菌的利福平(rifampicin)抗性决定区(rrdr)，使得重组细菌模拟分子诊断测定中利福平抗性结核分枝杆菌菌株的诊断特征。包括来自结核分枝杆菌的rrdr区域的目的核酸可具有选自由以下组成的序列：seqidno：1-6或seqidno：9-14。在本发明的另一个实施方案中，目的核酸包括金黄色葡萄球菌的sccmec连接区，使得重组细菌在分子诊断测定中模拟甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株的诊断特征。包括sccmec连接的目的核酸可以具有seqidno：8的序列。在本发明的另一个实施方案中，重组细菌还包括选择标记，以促进菌株在实验室培养基中的生长。在本发明的另一个实施方案中，将目的核酸包含在载体上，并用所述载体转化重组细菌。应当理解，重组细菌被用包含目的核酸的载体稳定或瞬时转化。根据本发明的第二方面，提供了包含本发明的重组细菌的诊断对照组合物，特别是其中所述诊断对照组合物是分子诊断测定的阳性对照。根据本发明的第三方面，提供了一种产生重组细菌的方法，所述重组细菌在分子诊断测定中模拟病原体的诊断特征，所述方法包括：(i)用载体转化非病原性细菌，其中所述载体包含来自病原体的目的核酸、以及选择标记(优选抗生素选择标记)，并且进一步其中所述目的核酸能够通过分子诊断测定检测；和(ii)在选择条件下培养步骤(i)中获得的重组细菌以选择所述重组细菌。在本发明的一个优选实施方案中，非病原性细菌是耻垢分枝杆菌。根据另一个实施方案，病原体选自由以下组成的组：不动杆菌属物种，放线杆菌属物种，放线菌属物种，气单胞菌属物种，芽孢杆菌属物种，博德特菌属物种，疏螺旋体属物种，布鲁杆菌属物种，弯曲杆菌属物种，衣原体属物种，梭菌属物种，棒状杆菌属物种，肠杆菌属物种，肠球菌属物种，欧文氏菌属物种，丹毒丝菌属物种，埃希氏菌属物种，弗朗西斯氏菌属物种，克雷伯菌属物种，嗜血菌属物种，军团菌属物种，钩端螺旋体属物种，李斯特菌属物种，莫拉菌属物种，分支杆菌属物种，支原体属物种，奈瑟球菌属物种，诺卡尔菌属物种，巴氏杆菌属物种，假单胞菌属物种，立克次体属物种，沙门氏菌属物种，志贺氏菌属物种，螺旋菌属物种，葡萄球菌属物种，链杆菌属物种，链球菌属物种，链霉菌属物种，密螺旋体属物种，弧菌属物种，耶尔森菌属物种和黄单胞菌属物种。优选病原体是结核分枝杆菌或金黄色葡萄球菌。在本发明的另一个实施方案中，目的核酸可以包括来自结核分枝杆菌的利福平抗性决定区(rrdr)，使得重组细菌模拟分子诊断测定中利福平抗性结核分枝杆菌菌株的诊断特征。包括来自结核分枝杆菌的rrdr区域的目的核酸可具有选自由以下组成的序列：seqidno：1-6或seqidno：9-14。在本发明的另一个实施方案中，目的核酸包括金黄色葡萄球菌的sccmec连接区，并且重组细菌在分子诊断测定中模拟甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株的诊断特征。包括sccmec连接的目的核酸可以具有seqidno：8的序列。在本发明的又另一个实施方案中，将目的核酸包含在载体上，并用所述载体转化重组细菌。应当理解，重组细菌被用包含目的核酸的载体稳定或瞬时转化。根据本发明的第四方面，提供了试剂盒，所述试剂盒包含本发明的重组细菌或诊断对照组合物和使用说明书。附图简述现在将仅通过实施例并参考以下附图来描述本发明的非限制性实施方案：图1：结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的rif抗性决定区rrdr。rrdr内的核苷酸变化可导致rpob肽序列改变。灰色框表示在rrdrtb内的dreem2至dreem6中的允许mtb/rif将细菌分类为rifr的rifr菌株氨基酸变化的位置。还显示了位置513，516，526，531和533处的snp。由于非同源性，各探针不结合，并且在那些通道中没有获得荧光。星号表示rrdrtb和rrdrsm之间核苷酸差异的位置。在该区域中野生型结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌rpob之间没有氨基酸差异。图2：用于诊断测定的金黄色葡萄球菌基因组元件(未按比例)。基因下面的框表示探针杂交区域的位置。阴影框：荧光信号阳性。空框：缺乏荧光信号。spa表示用于物种形成(speciation)的在染色体远端位点的金黄色葡萄球菌特异性基因(垂直条)。如果orfx引物与野生型基因组区域的引物(灰色框)并置，则不获得信号。探针sccmec专门针对orfx和移动元件处的attl连接(斜纹条)。meca是整合酶基因，其将移动dna元件引导至orfx基因座处的attb位点(水平条)。图a：野生型金黄色葡萄球菌菌株的染色体构型。荧光信号仅从物种形成探针spa获得。图b：甲氧西林抗性菌株的染色体构型。使用的信号获得自所有三个探针spa，meca和sccmec。后两者对mrsa菌株具有特异性。斜线表示spa基因远离attb位点。图c：耻垢分枝杆菌整合突变体dreemx的染色体构型。没有探针与分枝杆菌序列结合。人工引入的sccmec元件允许检测信号。斜线表示spa基因远离attb位点。图3：来自hainlpamtbdrplus测定的结果。在所有耻垢分枝杆菌菌株中均未观察到tub杂交。仅展示针对rif抗性的抗性特征分析而未展示针对inh抗性的。没有获得katg或inha基因座的杂交。黑框表示杂交信号为阳性。白框表示没有杂交信号。菌株dreem4中的单个灰色框表示弱杂交信号。序列表使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的标准三字母缩写显示了所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。本领域技术人员将理解，仅显示每个核酸序列的一条链，但通过提及所展示的链而包括互补链。在所附的序列表中：seqidno：1-结核分枝杆菌野生型菌株h37rv的rrdr的核苷酸序列seqidno：2-具有q513l等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的核苷酸序列seqidno：3-具有d516v等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的核苷酸序列seqidno：4-具有h526y等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的核苷酸序列seqidno：5-具有s531l等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的核苷酸序列seqidno：6-具有l533p等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的核苷酸序列seqidno：7-耻垢分枝杆菌的rrdr的核苷酸序列seqidno：8-用于mrsa测定的包含在耻垢分枝杆菌构建体中的金黄色葡萄球菌衍生的orfx和sccmec区域的核苷酸序列seqidno：9-包含构建体中使用的结核分枝杆菌野生型菌株h37rv的rrdr的插入物的核苷酸序列seqidno：10-包含构建体中使用的具有q513l等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的插入物的核苷酸序列seqidno：11-包含构建体中使用的具有d516v等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的插入物的核苷酸序列seqidno：12-包含构建体中使用的具有h526y等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的插入物的核苷酸序列seqidno：13-包含构建体中使用的具有s531l等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的插入物的核苷酸序列seqidno：14-包含构建体中使用的具有l533p等位基因的结核分枝杆菌菌株的rrdr的插入物的核苷酸序列发明详述现在将在下文中参考附图更全面地描述本发明，附图中示出了本发明的一些但非全部实施方案。所描述的本发明不应限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括在本发明的范围内。尽管本文采用了特定术语，但它们仅用于一般性和描述性意义，而不是用于限制的目的。如在整个说明书和随后的权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。这里使用的术语和措辞是出于描述的目的，不应被视为限制。本文使用的术语“包含”，“含有”，“具有”和“包括”及其变体的使用旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及其他项目。本发明涉及模拟病原体诊断特征的重组细菌。本发明的重组细菌基于非病原性细菌，其具有含有来自病原体的目的核酸的修饰的基因组，其中通过分子诊断测定检测所述目的核酸。术语“重组”意指某些物质已经重组。当参考核酸构建体使用时，该术语是指包含连接在一起或通过分子生物学技术产生的核酸序列的分子。重组核酸构建体可以包括这样的核苷酸序列，其与天然不连接的或者在自然界中在不同位置连接的核酸序列连接或被操作以连接。因此，重组核酸构建体表明核酸分子已经使用基因工程，即通过人为干预进行了操作。可以通过转化并且优选通过用载体转化将重组核酸构建体引入宿主细胞。术语“载体”是指可以将多核苷酸或基因序列引入细胞的工具。本领域已知有各种类型的载体，包括质粒，病毒，噬菌体和粘粒。通常，通过重组dna技术将多核苷酸或基因序列引入载体中。本发明的重组细菌优选是重组耻垢分枝杆菌细菌。耻垢分枝杆菌是优选的，因为该细菌是非病原性的，并且其传播不需要相同水平的生物安全性。应当理解，本发明的重组细菌优选具有含有目的核酸的修饰的基因组，所述目的核酸通过诊断测定检测。然而，由于掺入了目的核酸序列，重组耻垢分枝杆菌模拟被检测病原体(例如rifr结核分枝杆菌或多重抗药性金黄色葡萄球菌)的诊断特征。如本文所用，术语“核酸”，“核酸分子”或“多核苷酸”包括核糖核苷酸(rna)和脱氧核糖核苷酸(dna)(包括cdna，基因组dna和合成dna)。核酸可以是双链或单链的。在核酸是单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。核酸分子可以是两个或更多个共价键合的核苷酸(包括天然存在的或非天然存在的核苷酸，或核苷酸类似物或衍生物)的任何链。术语“dna”是指两个或更多个共价键合的，天然存在或修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。重组耻垢分枝杆菌可用作诊断测定中病原体检测的对照。病原体是选自由以下组成的组的细菌：不动杆菌属物种，放线杆菌属物种，放线菌属物种，气单胞菌属物种，芽孢杆菌属物种，博德特菌属物种，疏螺旋体属物种，布鲁杆菌属物种，弯曲杆菌属物种，衣原体属物种，梭菌属物种，棒状杆菌属物种，肠杆菌属物种，肠球菌属物种，欧文氏菌属物种，丹毒丝菌属物种，埃希氏菌属物种，弗朗西斯氏菌属物种，克雷伯菌属物种，嗜血菌属物种，军团菌属物种，钩端螺旋体属物种，李斯特菌属物种，莫拉菌属物种，分支杆菌属物种，支原体属物种，奈瑟球菌属物种，诺卡尔菌属物种，巴氏杆菌属物种，假单胞菌属物种，立克次体属物种，沙门氏菌属物种，志贺氏菌属物种，螺旋菌属物种，葡萄球菌属物种，链杆菌属物种，链球菌属物种，链霉菌属物种，密螺旋体属物种，弧菌属物种，耶尔森菌属物种和黄单胞菌属物种。优选病原体选自由结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌组成的组。特别地，重组耻垢分枝杆菌可用作检测利福平抗性结核分枝杆菌或多药抗性金黄色葡萄球菌的诊断测定的对照。更具体地，重组耻垢分枝杆菌可用于校准用于诊断受试者中利福平抗性结核分枝杆菌的存在的诊断装置和mrsa感染的主动监测。例如，重组耻垢分枝杆菌分析可用作系统测定(如mtb/rif测定，sanasalcomplete测定，mrsa/sassti测定，mrsa/sabc测定，mrsanxg测定，carba-r测定，c.difficile测定，c.difficile/epi测定，vana测定，ct/ng测定，gbs测定，gbslb测定)中的对照。重组耻垢分枝杆菌也可用作其他诊断测定中的对照，如genotypemdrtbplus线探针测定，anyplextmiimtb/mdr检测测定，anyplextmiimtb/xdr检测测定，anyplextmiimtb/ntm实时检测测定，mtb/ntmace检测测定，mtbnestedace检测测定，magicplextmsepsis实时测定，meningitisace检测测定，anyplextmiirb5检测测定，pneumobacterace检测测定，allplextmsti/bvpanel测定，allplextmsti基本测定，allplextmbacterialvaginosis测定，anyplextmiisti-7检测测定，anyplextmiisti-5检测测定，或anyplextmct/ng实时检测测定。在本发明的一个实施方案中，重组耻垢分枝杆菌用于模块化盒系统的外部质量评估(eqa)目的。简而言之，系统依赖于使用互补核酸探针来检测细菌中mtb/rif测定中rrdr核酸或与其基本相同的核酸的存在与否以及mrsa测定中meca或与其基本相同的核酸的存在与否。术语“互补”是指两个核酸分子，例如dna或rna，其能够形成沃森-克里克碱基对以在两个核酸分子之间产生双链区域。本领域技术人员将理解，不需要核酸分子中的每个核苷酸与相对的互补链中的核苷酸形成匹配的沃森-克里克碱基对以形成双链体。因此，如果核酸分子在高严格条件下与第二核酸分子杂交，则其与所述第二核酸分子“互补”。根据本发明的核酸分子包括两种互补分子。如本文所用，“基本上相同”的序列是在不破坏或不实质上降低一种或多种表达多肽的或由核酸分子编码的多肽的抗原性的序列位置上与参考序列仅有一个或多个保守取代的不同或一个或多个非保守取代，缺失或插入的不同的氨基酸或核苷酸序列。用于确定序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员知识范围内的各种方式实现。这些包括使用例如计算机软件如align，megalign(dnastar)，clustalw或blast软件。本领域技术人员可以容易地确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在本发明的一个实施方案中，提供了多肽或多核苷酸序列，其与本文描述的序列具有至少约80％序列同一性，至少约90％序列同一性或甚至更高序列同一性(如约95％，约96％，约97％，约98％或约99％序列同一性)。备选地/另外地，如果两个核酸序列在高严格条件下杂交，则它们可以是“基本上相同的”。杂交反应的“严格性”可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度，洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度以进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性dna重新退火的能力。这种“严格”杂交条件的典型实例是在65℃下温和振荡进行杂交18小时，在65℃在洗涤缓冲液a(0.5％sds；2×ssc)中第一次洗涤12分钟，和在洗涤缓冲液b(0.1％sds；0.5％ssc)中于65℃第二次洗涤10分钟。本文中，申请人已经产生了结核分枝杆菌的非病原性细菌亲属，耻垢分枝杆菌，其中来自结核分枝杆菌的rrdr已被插入质粒中，所述质粒整合进attb噬菌体附着位点中。检测结核分枝杆菌的任何测定均不识别耻垢分枝杆菌，而将结核分枝杆菌中的rrdr插入该生物体允许其由检测结核分枝杆菌的测定检测。重组菌株可携带rrdr的野生型正常拷贝或与rifr患者中发现的相似的突变形式。此外，中请人已经产生了这样的耻垢分枝杆菌菌株，其携带由sccmec探针识别的序列，所述探针特异性靶向金黄色葡萄球菌的orfx和移动元件处的attl连接。检测金黄色葡萄球菌的任何测定都不识别耻垢分枝杆菌，而在orfx和移动元件处插入attl连接许通过检测金黄色葡萄球菌的测定检测耻垢分枝杆菌。提供以下实施例是为了说明而不是为了限制。实施例1细菌菌株和培养条件所有克隆均在大肠杆菌(escherichiacoli)菌株dh5α中进行。实验在耻垢分枝杆菌菌株mc2155中进行。使用和产生的所有菌株和质粒分别列于表1和表2中。表3中列出了构建体中使用的核酸序列插入物。表1：使用和产生的菌株表2：使用和产生的质粒质粒基因型来源phintorie；bla；hyg；l5-attp-intstover等rrdr-xhoi-claipuc57simple中的h37rv野生型rrdr；blagenscriptrrdr_q513lrrdr-xhoi-clai衍生物；q513l等位基因；blagenscriptrrdr_d516vrrdr-xhoi-clai衍生物；d516v等位基因；blagenscriptrrdr_h526yrrdr-xhoi-clai衍生物；h526y等位基因；blagenscriptrrdr_s531lrrdr-xhoi-clai衍生物；s531l等位基因；blagenscriptrrdr_l533prrdr-xhoi-clai衍生物；l533p等位基因；blagenscriptorfx-scc金黄色葡萄球菌orfx和下游的480bpscc；blagenscriptrrdr-57-hairrdr-xhoi-clai衍生物；hyg；l5-attp-int本工作513-57-hairrdr_q513l衍生物；hyg；l5-attp-int本工作516-57-hairrdr_d516v衍生物；hyg；l5-attp-int本工作526-57-hairrdr_h526y衍生物；hyg；l5-attp-int本工作531-57-hairrdr_s531l衍生物；hyg；l5-attp-int本工作533-57-hairrdr_l533p衍生物；hyg；l5-attp-int本工作orfx-scc-57-haiorfx-scc衍生物；hyg；l5-attp-int本工作表3：研究中使用的核酸序列插入物大肠杆菌菌株在37℃在补充有适当抗生素(浓度为100-200μg/ml氨苄青霉素，200μg/ml潮霉素b(hyg)或50μg/ml卡那霉素(kan))的标准luriabertani(lb)或2yt液体培养基中或固体培养基(la)上生长。耻垢分枝杆菌菌株在37℃在middlebrook7h9液体培养基(difco)(补充有0.085％nacl，0.2％葡萄糖，0.2％甘油和0.05％tween80)中或在middlebrook7h10固体培养基(difco)(补充有0.085％nacl，0.2％葡萄糖和0.5％甘油)上振荡生长。抗生素用浓度50μg/ml潮霉素，200μg/mlrif或25μg/ml卡那霉素。实施例2通过电穿孔将质粒dna引入耻垢分枝杆菌电感受态mc2155的制备如下：使细胞生长至对数期(od6000.5-0.9)并通过离心(3500rpm，10min，4℃)收获。然后将沉淀的细胞通过温和再悬浮于10ml冰冷的10％甘油中洗涤三次，并在洗涤之间通过离心(3500rpm，10min，4℃)沉淀细胞。将细胞重悬于适当体积的冰冷的10％甘油中并立即使用。为了转化，将400μl电感受态细胞与质粒dna一起转移到预先冷却的0.2cm电穿孔小杯(bio-rad)中。使用genepulserxcell(bio-rad)用于设定为2.5kv，25μf和1000ω的电穿孔。立即在37℃下以100rpm振荡用1ml2xty拯救细胞3小时或过夜。在适当的情况下，将拯救的细胞接种在middlebrook7h10(如果需要，补充有hyg)上，并在37℃孵育3天。实施例3克隆穿梭质粒以整合到耻垢分枝杆菌中通过将携带目的序列的基于puc57-simple的载体与来自phint的nrui/scai2709bp片段组合来克隆整合穿梭载体，phint含有来自分枝杆菌噬菌体l5的attp-int片段以及抗性标记基因。得到的载体能够在dh5α中进行质粒复制并且整合到分枝杆菌噬菌体l5的attb位点。外源核苷酸序列是基于结核分枝杆菌，跨rrdr区域(seqidno：1-6)，或来自金黄色匍萄球菌(seqidno：8)。为了检测rifr等位基因，图中表示的snp的集合基于rrdr区域内频繁发生的临床样品，即q513l，d516v，h526y，s531l和l533p。对于mrsa测定，包括sccmec连接两侧的480bp(seqidno：8)。通过限制性定位证实了具有amp和hyg抗性的质粒构建体，并且在通过电穿孔引入耻垢分枝杆菌后，从补充有hyg的固体培养基中选择单菌落。将克隆在-80℃储存在甘油中，并与临床样品一起用于标准诊断分析，其中单位已通过标准方法校准。实施例4通过用于测定的标准实验室诊断分析菌株.挑选野生型或修饰的耻垢分枝杆菌菌株的单菌落，并在适当时在补充有hyg的液体7h9培养基中生长。使细菌生长至静止期，并将300μl的从10-2至10-4的10倍稀释液加入制造商提供3ml裂解缓冲液中。样品在南非国家卫生实验室服务(nationalhealthlaboratoryservicesofsouthafrica，nhls)处理，与临床标本平行进行。用于测试rrdrtb及其变体。分析了测试的数字输出，结果如表4所示。在测定中在野生型耻垢分枝杆菌情况下，荧光信号仅从探针c获得，其位于16bp，在rrdrtb与rrdrsm之间具有100％同源性(图1)。该菌株被标记为“mtb未检测到”。需要来自三个或更多探针的信号进行阳性鉴定(包装说明书)。对于所有5种探针a至e，在菌株dreem1中获得阳性信号。因此将其标记为“mtb检测到”并用不同的稀释度分类为高，中或低。对于其他菌株dreem2至dreem6，对于五种探针中的四种获得信号，再次将它们标记为“mtb检测到”。如预期的那样不同菌株中snp的位置导致探针失败(表4)。例如，对于菌株dreem2(q513l)和dreem3(d516v)中的探针b，对于dreem4(h526y)中的探针d和对于dreem5(s531l)和dreem6(l533p)中的探针e，观察到缺乏信号。随用于的盒提供的定制软件使用固定程序，所述程序根据数值数据计算输出。据此，即使在较少细菌数量情况下从q513l，d516v和l533p的探针获得信号，15个测定中的14个(93％)正确分配rifr。对于以10-4稀释的克隆dreem2(d516v)，ct值为27，超过截止值25。实施例5通过用于测定的标准实验室诊断分析菌株挑选野生型mc2155或修饰的耻垢分枝杆菌菌株dreemx的单菌落，并在适当时在补充有hyg的液体7h9培养基中生长。使细菌生长至静止期，并将10μl纯培养物加入3ml制造商提供的裂解缓冲液中。样品在南非国家卫生实验室服务(nationalhealthlaboratoryservicesofsouthafrica，nhls)处理。用于测试甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌的orfx-scc连接(表5)。表5：来自测定的结果在模块中，如所期望的，探针spa，meca或sccmec都没有产生来自亲本耻垢分枝杆菌的荧光信号(图3)。鉴定是基于来自对金黄色葡萄球菌具有特异性的染色体葡萄球菌蛋白a(spa)基因的信号。在菌株dreemx中(其中orfx-scc连接被引入l5-attp位点)，sccmec探针给出阳性信号，其ct值为25，终点为460。该菌株被标记为“mrsa阴性；sa阴性”。实施例6通过标准hainlifesciencemdrtbplus和genotype分枝杆菌cm线探针测定(lpa)分析菌株.从固体平板中挑取突变菌株的单菌落，并悬浮于500μl分子生物学级水中。样品在nhls与临床样品平行处理。从杂交条目测对结果评分，并记录探针信号的存在或不存在。来自hainmdrtbplus分析的结果标记所有耻垢分枝杆菌衍生的菌株为结核分枝杆菌阴性(表6)。这是预期的，因为结核分枝杆菌复合物(mtbc)的测试探针tub位于16s-23srrna的基因间隔区，并且被设计为高度特异性的。当使用haingenotype分支杆菌cmver2.0分析菌株时，它们一致地被鉴定为mycobacteriumfortuitum/mycobacteriummageritense。对于所有被鉴定为非mtbc的临床样品，该测定在南非的nhls中作为标准程序进行，以对患者中的致病因子进行分类。表6：来自hainlpamtbdrplus测定的结果。仅显示rif抗性分析的结果，而不显示inh抗性分析的结果。katg或inha基因座没有获得杂交在耻垢分枝杆菌的mdrtbplus测定中，三个条带杂交：wt1，wt4和wt5(表5)。这些序列位于rrdrsm和rrdrtb之间具有100％同源性的序列处(图1)。所有八个探针wt1-wt8(表5)在菌株dreem1中结合，dreem1含有rrdrsm和rrdrtb。位于探针wt1，wt4和wt5的snp不能被测定，因为与rrdrtb的缺乏结合被与rrdrsm的结合遮蔽。在菌株dreem2至dreem6中，杂交条带如从菌株dreem4，dreem5和dreem6所预期的那样。菌株dreem2和dreem3难以解释，其中条带的杂交强度是中等的。预期dreem2中的wt2不会杂交，而预期wt4强烈杂交，但这两者都是弱结合。在菌株dreem3，dreem4和dreem5中，通过将条带与各自的snp杂交，如预期的那样，正确鉴定了突变体等位基因的存在：分别为mut1(d516v)，mut2a(h526y)和mut3(s531l)(图3)。在耻垢分枝杆菌菌株中没有获得katg或inha的条带，表明在这些基因座处在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌之间存在差异。在该研究中开发和测试的耻垢分枝杆菌菌株能够模拟结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌起源的基因含量。中请人已经表明，基于测定的naa性质，这些菌株可以如预期产生信号。该方法作为诊断用途的阳性对照的临床适用性具有广泛的影响。它可以对模块进行校准和验证，从而使作为外部标准诊断结果可信，从而消除了实验室之间不同的内部标准的必要性。这种校准和验证系统的一个实例是就地用于测定(其使用smartspot干燥培养点(dcs)作为外部质量对照)。这些目前是基于在bsliii实验室中处理的杀死的分枝杆菌结核菌株产生的。本研究中产生的菌株的优点是它们可用于在bslii设施中产生对照样品，其中：(i)确保所有样品均为非生物危害品；(ii)允许来自表型为rifs的分枝杆菌菌株的rifrrrdrtb等位基因的对照样品；(iii)要求工作人员仅接受bslii级别的培训，而不是bsliii级别；(iv)减少产生各批次对照样品所需的周转时间；以及(iv)与bsliii实验室相比，降低了生产成本。使用和mtbdrplus诊断测定在rifr确定方面确实存在限制。rrdrsm和rrdrtb包含位于用于的探针c和用于mtbdrplus的wt1，wt4和wt5的100％同源性的区域。因此，对于所有测试的耻垢分枝杆菌菌株，在这些基因座处获得阳性信号。这排除了针对位于这些位置的snp使用的两种方法，因为远端rrdrtb内的缺乏结合被与rrdrsm的结合所掩盖，因此将通过使用的或mtbdrplus中阳性杂交的荧光信号检测阳性信号。位于任何其他探针内的snp将通过信号丢失而被检测到，因为这些基因座处的基因组含量有效地恢复为野生型耻垢分枝杆菌rrdrsm。在两种测定的设计中固有的是，信号丢失不能鉴定突变的性质，其中信号丢失是一种指示。在mtbdrplus的情况下，基于其在临床研究中的频率的先验知识，选择了四种特异性snp，即d516v，h526y，h526d和s531l。对于这些序列，新条带分别在mut1，mut2a，mut2b和mut3处杂交。因此，在lpa条中包含这些变体是获得导致抗性的突变snp的阳性指示，并且比由于野生型snp的丢失导致的条带漏失的阴性结果更可靠。因为本研究中整合的rrdrtb序列作为非转录的核苷酸序列存在于远端基因座，所以它不赋予细菌rifr。该突变需要整合到完全转录的必需rpob蛋白中。引入具有snpv146f和i572f(其已经在临床rifr中在rrdr之外被鉴定出来)的全长rpob基因的第二个拷贝已经能够通过显性阳性机制赋予抗性。本文使用的穿梭递送载体的整合性质利用了抗生素抗性的菌株。在这种情况下，可选择的标记hygr且rifs。尽管mtb/rif和mdrtbplus方法本质上都是分子的，但它们的区别在于读数。就而言，分子信标技术在tb鉴定方面具有特异性和定量性。循环阈值ct是模板量的指示，其中由于存在更多基因组等同物的事实，更高数量的细菌在更快的时间点产生荧光信号。较少的细菌导致稍后出现的信号，并且认为高于25的循环阈值接近或低于检测限。物种形成取决于从rrdr基因座本身的不同探针获得的组合荧光信号。为用户无法更改的每个模块提供数学计算机程序。数字输出确定rrdr的身份，其数量和可能的snp的位置(mtb/rif包装说明书)。在mdrtbplus的情况下，将读数作为多重pcr的最终产物。这包括四个基因座，因此有四组引物：针对物种形成(rrna)，rif抗性(rrdrtb)和inh抗性(katg和inha)。杂交后的结果是特定条带的丢失或增加，这不是细菌载量的数值指示。其还允许对作为额外探针单独包括的突变等位基因进行特异性表征。通过在原始基因座处用rrdrtb替换rrdrsm可以避免这个问题。然而，该方法将导致表型为rifr的菌株，因为rpob肽序列将被改变并影响rnap结合。在耻垢分枝杆菌衍生的菌株dreemx上测试测定，并且能够产生由探针sccmec产生的特异性信号，其存在于许多含有scc整合模块的mrsa菌株中。并非所有这些都必然携带meca基因，因此选择sccmec探针用于该研究。结果表明，模块能够使用声波裂解程序成功裂解所提供的盒中的分枝杆菌。金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性，并且其细胞壁仅由细胞膜和厚的肽聚糖壁组成。另外，分枝杆菌具有特别厚的，不可渗透的和富含脂质的细胞壁，但这不会阻止dna作为循环程序的模板释放。分枝杆菌dna的高g+c含量(约67％)受到关注，因为可能干扰针对金黄色葡萄球菌优化的循环和结合参数，其中金黄色葡萄球菌的g+c含量为约33％。用本文测试的sccmec探针未观察到这种情况。对于获得的结果，获得的荧光曲线没有显著的背景信号(数据未显示)，这可能意味着pcr产物和/或探针结合具有足够的特异性，或者可能是因为相比于耻垢分枝杆菌染色体的g+c偏好的金黄色葡萄球菌核苷酸序列的a+t偏好。当前第1页12