优化的CLN1基因和表达盒以及它们的应用的制作方法

本申请要求2016年6月13日提交的美国临时申请序列号62/349,411的权益，其全部内容通过引用并入本文。

本发明涉及包含优化的cln1开放阅读框(orf)序列的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体(病毒或非病毒载体)、使用所述多核苷酸将cln1orf递送至细胞或受试者的方法以及使用该多核苷酸治疗婴儿神经元脂褐质沉积症(婴儿巴登氏病(infantilebattendisease)的方法。

背景技术：

神经元蜡样质脂褐质沉积症(ncl)是指至少八种遗传上不同的神经变性疾病的家族，所述疾病由体内组织中脂质色素(脂褐素)的过度积累引起。这些脂质色素由脂肪和蛋白质组成。所述脂褐素材料在神经细胞和许多器官(包括肝脏、脾脏、心肌和肾脏)中积聚。

该疾病的婴儿形式称为婴儿神经元蜡样质脂褐质沉积症(incl)或婴儿巴登氏病，其是由cln1基因突变引起，并且是常染色体隐性遗传病。一些发生cln1突变的儿童症状发作较晚并且疾病进展较慢，其类似于幼年发病型疾病，并且更典型地是与cln3基因的突变相关。位于1p32的cln1基因编码称为棕榈酰蛋白硫酯酶1(ppt1)的溶酶体酶。ppt1的缺乏导致神经元和其他细胞中蛋白质和脂质的异常储存并导致细胞功能受损。

尽管已经尝试过用酶替代疗法(参见例如美国专利号7,442,372)和基因疗法，但没有有效的incl治疗方法。还试验了施用神经干细胞和其他试剂(参见，例如，美国专利号8,242,086、美国公开号2015/0313863)，但是这些方法的临床功效仍在研究中。

因此，需要一种新的有效疗法来治疗与cln1表达相关的病症，比如incl。

技术实现要素：

本发明至少部分上是基于研发的优化的cln1基因、表达盒和能够提供治疗水平的cln1表达以治疗与cln1表达相关的病症(比如incl)的载体。

因此，本发明的一个方面涉及编码ppt1多肽或其片段的多核苷酸，其中所述核苷酸序列经密码子优化以在人细胞中表达。在一个实施例中，所述多核苷酸包含人cln1开放阅读框。

本发明的另一方面涉及表达盒，其包含编码ppt1多肽或其片段的多核苷酸和包含本发明多核苷酸的载体、转化细胞和转基因动物。在一个实施例中，所述多核苷酸包含人cln1开放阅读框。

本发明的另一方面涉及药物制剂，其包含在药学上可接受的载体中的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞。

本发明的另一方面涉及在细胞中表达编码ppt1或其片段的多核苷酸的方法，包括使细胞与本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体接触，从而在细胞中表达多核苷酸或其片段。在一个实施例中，所述多核苷酸包含cln1开放阅读框。在另一个实施例中，所述cln1开放阅读框是人cln1开放阅读框。在另一个实施例中，所述cln1开放阅读框经密码子优化以在人细胞中表达。

本发明的另一方面涉及在受试者中表达ppt1多肽或其片段的方法，包括向受试者递送本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞，从而在受试者中表达ppt1多肽或其片段。在一个实施例中，所述多核苷酸包含cln1开放阅读框。在另一个实施例中，所述cln1开放阅读框是人cln1开放阅读框。

本发明的又一方面涉及治疗与有需要的受试者的cln1基因或ppt1多肽的异常表达或者cln1基因产物的异常活动相关的病症的方法，包括向受试者递送治疗有效量的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞，从而治疗与受试者的cln1基因或ppt1多肽的异常表达相关的病症。

本发明的另一方面涉及本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞在治疗与有需要的受试者的cln1基因的异常表达相关的病症的方法中的用途。

在本发明下面的的文描述中将更详细地阐述本发明的这些和其他方面。

附图说明

图1示出了cln1表达盒的图谱。

图2显示了用本发明的cln1aav载体处理的所有cln1敲除小鼠群的存活曲线。niv＝新生小鼠iv；it＝腰椎鞘内注射；iv＝静脉注射；icm＝小脑延髓池注射；d.o.＝日龄；w.o.＝周龄；ko＝敲除。年龄是他们注射时的年龄。重量减少20％或具有需要安乐死的显著发病率获得“死亡”得分。

图3显示了在4周大用本发明的cln1aav载体治疗的cln1敲除小鼠群的存活曲线。

图4显示了在26周大用本发明的cln1aav载体治疗的cln1敲除小鼠群的存活曲线。

图5显示了用本发明的cln1aav载体治疗的cln1敲除小鼠静脉注射群的存活曲线。

图6显示了用本发明的cln1aav载体治疗的cln1敲除小鼠鞘内注射群的存活曲线。

图7a-7b显示scaav9/cln1疗法增加了血清ppt1水平并增大了存活率。a.在指定年龄通过腰椎鞘内注射对cln1小鼠进行治疗，3个月后或在人道结束终点时采集血清。数据报告为每小时每ml血清处理的nmol底物。未经治疗的ko小鼠不在范围内(值<1)，因此未显示。b.kaplan-meier(开普兰-迈耶)图比较了在不同年龄用低剂量疗法(上图)和高剂量疗法(下图)治疗的小鼠。未经治疗的ko小鼠在两个小组中显示为参考。

图8a-8b示出了加速旋转杆性能。每个点代表给定小鼠在给定测试年龄的两次试验中下降的平均等待时间。a.在<1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。b.在>1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。使用单向anova与tukey’spost-hoc多重比较来评估与未处理的het(*)或未处理的ko(#)相比的组均值的差异：*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001。

图9a-9b显示了morris水迷宫中的游泳速度评估。每个点代表在测试年龄进行的平均2-3天、每天4次试验测得的给定小鼠的游泳速度。a.在<1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。使用单向anova与tukey’spost-hoc多重比较来评估与未处理的het(*)或未处理的ko(#)相比的组均值的差异：*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001。b.在>1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。采用非配对学生t检验确定组均值的差异：**p<0.01。

图10a-10b示出了在morris水迷宫中找到平台的时间。每个点代表在测试年龄进行的平均2-3天、每天4次试验测得的给定小鼠找到平台的时间。a.在<1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。使用单向anova与tukey’spost-hoc多重比较来评估与未处理的het(*)或未处理的ko(#)相比的组均值的差异：*/#p<0.05，**/##p<0.01，***/###p<0.001。b.在>1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。采用非配对学生t检验确定组均值的差异：**p<0.01，***p<0.001。

图11a-11b示出了在morris水迷宫中的游泳距离。每个点代表在测试年龄进行的平均2-3天、每天4次试验测得的给定小鼠的游泳距离。a.在<1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。使用单向anova与tukey’spost-hoc多重比较来评估与未处理的het(*)或未处理的ko(#)相比的组均值的差异：**/##p<0.01，***/###p<0.001。b.在>1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。采用非配对学生t检验确定组均值的差异：**p<0.01。

图12a-12b示出了从倒置悬挂线上落下的时间。每个点代表给定测试年龄的单个小鼠的数据。a.在<1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。使用单向anova与tukey’spost-hoc多重比较来评估与未处理的het(*)或未处理的ko(#)相比的组均值的差异：***/###p<0.001。b.在>1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。采用非配对学生t检验确定组均值的差异。

图13a-13b示出了倒置悬挂线的协调性分数。每个点代表给定测试年龄的单个小鼠的数据。a.在<1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。使用单向anova与tukey’spost-hoc多重比较来评估与未处理的het(*)或未处理的ko(#)相比的组均值的差异：***/###p<0.001。b.在>1岁龄开始进行行为测试的小鼠群。采用非配对学生t检验确定组均值的差异。

图14a-14h显示了新生儿期静脉内治疗的clnko和het小鼠具有正常的寿命和行为。所有图都是对在新生儿期接受治疗的小鼠进行的检查。a.kaplan-meier(开普兰-迈耶)图§表明niv治疗的het动物是健康的，但在18个月处死以进行分析。b.血清ppt1活性分析显示与未处理的het相比的niv治疗的het小鼠。c.加速旋转杆性能。d.在morris水迷宫中寻找平台的时间。e.在morris水迷宫中的游泳速度评估。f.在morris水迷宫中的游泳距离。g.从倒置悬挂线上落下的时间。h.倒置悬挂线的协调性分数。采用非配对学生t检验确定治疗组和未治疗het的平均值之间的差异：*p<0.05。

具体实施方式

下面更详细地解释本发明。该描述并非旨在作为可以实现本发明的所有不同方式的详细目录，或者可以添加到本发明的所有特征。例如，关于一个实施例示出的特征可以结合到其他实施例中，并且关于一个特定实施例示出的特征可以从该实施例中删除。另外，在本公开的启示下，本文中提出的对各实施例的许多变化和添加对本领域技术人员来说是显而易见的，其不脱离本发明的范围。因此，以下说明旨在说明本发明的一些特定实施例，而不是穷举地列出其所有排列、组合和变化。

除非上下文另有说明，其具体意图是指本文所述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明还设想了在本发明的一些实施例中，可排除或省略本文所述的任何特征或特征组合。为了说明目的，若说明书指出复合体包含组分a、b和c，则其具体意图是指a、b或c中的任一个或其组合可以被单独或组合省略及放弃。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。这里在本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制本发明。

除非另外特别指出，否则本文仅通过单链，从5’至3’方向，从左至右呈现核苷酸序列。核苷酸和氨基酸在本文中以iupac-iub生物化学命名委员会推荐的方式表示，或(对于氨基酸)由单字母代码或三字母代码表示，两者均符合37c.f.r.§1.822和惯用法。

除非另有说明，否则本领域技术人员已知的标准方法可用于生产重组和合成多肽、抗体或其抗原结合片段，用于操纵核酸序列，产生转化细胞，构建raav构建体、修饰的衣壳蛋白、表达aavrep和/或cap序列的包装载体以及瞬时和稳定转染的包装细胞。这些技术是本领域技术人员已知的。参见，例如，sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual2nded.(coldspringharbor,ny,1989)；f.m.ausubeletal.currentprotocolsinmolecularbiology(greenpublishingassociates,inc.和johnwiley&sons,inc.，纽约)。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利，核苷酸序列、氨基酸序列和其他参考文献都通过引用整体并入本文。

定义

如在本发明的说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述”也包括复数形式，除非上下文另外明确指出。

如本文所使用的，“和/或”是指并且包括一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当在替代方式(“或”)中解释时缺少的组合。

此外，本发明还设想了在本发明的一些实施例中，可排除或省略本文所述的任何特征或特征组合。

此外，当提及可测量的值(例如本发明的化合物或药剂的量、剂量、时间、温度等)时，术语“约”意指包括±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或者甚至±0.1％的规定值。

如本文所使用的，过渡性短语“基本上由……组成”应被解释为涵盖所列举的材料或步骤以及不会实质上影响本发明的基本和新颖性特征的那些材料或步骤。因此，本文使用的术语“基本上由……组成”不应被解释为等同于“包括”。

当应用于本发明的多核苷酸或多肽序列时，术语“基本上由……组成”(和语法变体)是指由所述序列(例如，seqidno)和在所述序列的5’和/或3’端或n端和/或c端上或者两末端之间(例如，结构域之间)不会实质上改变多核苷酸或多肽功能的总共10个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)其它核苷酸或氨基酸两者组成的多核苷酸或多肽。总共10个或更少其它核苷酸或氨基酸包括其它核苷酸或氨基酸加和在一起的总数。用于本发明多核苷酸的术语“实质上改变”是指与由所述序列组成的多核苷酸的表达水平相比，表达编码多肽的能力增加或降低至少约50％或更多。用于本发明多肽的术语“实质上改变”是指与由所述序列组成的多肽的活性相比，其生物活性增加或降低至少约50％或更多。

本文使用的术语“细小病毒”包括细小病毒科，包括自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括细小病毒属、红细胞病毒、浓核病毒属、重复病毒属(iteravirus)和康特拉病毒属(contravirus)。示例性的自主细小病毒包括但不限于小鼠的细小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、h1细小病毒、美洲家鸭细小病毒、蛇细小病毒和b19病毒。其他自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见，例如，fieldsetal.,virology,volume2,chapter69(4thed.,lippincott-ravenpublishers)。

依赖病毒属包含腺相关病毒(aav)，包括但不限于aav1型、aav2型、aav3型(包括3a型和3b型)、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型、aav10型、aav11型、aav12型、aav13型、鸟aav、牛aav、犬aav、山羊aav、蛇aav、马aav和绵羊aav。参见，例如，fieldsetal.,virology,volume2,chapter69(4thed.,lippincott-ravenpublishers)；以及表1。

在本发明的上下文中，术语“腺相关病毒”(aav)包括但不限于aav1型、aav2型、aav3型(包括3a型和3b型)、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型、aav10型、aav11型、鸟aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav以及现在已知或以后发现的任何其他aav。参见，例如，bernardn.fieldsetal.,virology,volume2,chapter69(4thed.,lippincott-ravenpublishers)。已经鉴定了许多其他aav血清型和分化枝(参见，例如，gaoetal.,(2004)j.virol.78:6381-6388和表1)，其也包括在术语“aav”中。

本发明的细小病毒颗粒和基因组可以来自但不限于aav。各种血清型aav和自主细小病毒的基因组序列以及天然itr、rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。这些序列可以在文献中或在诸如genbank的公共数据库中找到。参见，例如，genbank登记号nc_002077、nc_001401、nc_001729、nc_001863、nc_001829、nc_001862、nc_000883、nc_001701、nc_001510、nc_006152、nc_006261、af063497、u89790、af043303、af028705、af028704、j02275、j01901、j02275、x01457、af288061、ah009962、ay028226、ay028223、ay631966、ax753250、eu285562、nc_001358、nc_001540、af513851、af513852和ay530579，其公开内容通过用于并入本文，用于教导细小病毒、aav核酸和氨基酸序列。同样参见，例如，bantel-schaaletal.,(1999)j.virol.73:939；chiorinietal.,(1997)j.virol.71:6823；chiorinietal.,(1999)j.virol.73:1309；gaoetal.,(2002)proc.nat.acad.sci.usa99:11854；morisetal.,(2004)virol.33-:375-383；morietal.,(2004)virol.330:375；muramatsuetal.,(1996)virol.221:208；ruffingetal.,(1994)j.gen.virol.75:3385；rutledgeetal.,(1998)j.virol.72:309；schmidtetal.,(2008)j.virol.82:8911；shadeetal.,(1986)j.virol.58:921；srivastavaetal.,(1983)j.virol.45:555；xiaoetal.,(1999)j.virol.73:3994；国际专利公开wo00/28061、wo99/61601、wo98/11244；以及美国专利号6,156,303；其公开内容通过用于并入本文，用于教导细小病毒、aav核酸和氨基酸序列。同样参见表1。aav1、aav2和aav3itr序列的早期描述记载于xiao,x.,(1996),“characterizationofadeno-associatedvirus(aav)dnareplicationandintegration,”，宾夕法尼亚州匹兹堡匹兹堡大学博士论文论文(其全文并入本文)。

“嵌合”aav核酸衣壳编码序列或aav衣壳蛋白是结合了两个或更多个衣壳序列的部分的蛋白。“嵌合”aav病毒粒子或颗粒包括嵌合aav衣壳蛋白。

本文所用的术语“向性”是指病毒优先进入某些细胞或组织类型和/或优先与细胞表面相互作用，以促进进入某些细胞或组织类型，任选地并且优选地接着表达(例如，转录以及任选地翻译)细胞中病毒基因组携带的序列，例如对于重组病毒，表达异源核苷酸序列。本领域技术人员将理解，在不存在反式作用因子的情况下，例如对于诱导型启动子或其他调节的核酸序列，不能启动来自病毒基因组的异源核酸序列的转录。在raav基因组的情况下，来自病毒基因组的基因表达可以来自稳定整合的原病毒和/或来自非整合的附加体，以及病毒核酸可以在细胞内获取的任何其他形式。

表1

术语“向性分布”是指一种或多种靶细胞、组织和/或器官的转导模式。嵌合aav衣壳的代表性示例具有向性分布，其特征在于能有效转导cns细胞，而对外周器官仅具有较低转导。

本文所用的术语“与cln1基因的异常表达相关的病症”是指与正常受试者或群体中的表达水平或活性相关的由受试者cln1基因表达降低或改变引起的或具有其症状的疾病、病症、综合征或病况。

如本文所用的，由病毒载体(例如，aav载体)进行的细胞“转导”是指载体进入细胞，并通过将核酸结合到病毒载体中，然后通过病毒载体将转移到细胞中，以将遗传物质转移到细胞中。

除非另有说明，“有效转导”或“有效向性”或类似术语可通过参考合适的阳性或阴性对照(例如，分别有至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的阳性对照的转导或向性，或者分别有至少约110％、120％、150％、200％、300％、500％、1000％或更多的阴性对照的转导或向性)来确定。

类似地，通过参考合适的对照，可以确定对于靶组织，病毒是否“不能有效地转导”或“不具有有效的向性”或类似术语。在特定的实施例中，病毒载体不能有效地转导(即，不具有有效的向性)cns外的组织，例如肝、肾、性腺和/或生殖细胞。在特定实施例中，不期望的组织(例如，肝脏)转导是所期望的靶组织(例如，cns细胞)的转导水平的20％或更低、10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.1％或更低。

术语“5’部分”和“3’部分”是用于定义两个或更多个元素之间的空间关系的相对术语。因此，例如，多核苷酸的“3’部分”表示多核苷酸的一段在另一段的下游。术语“3’部分”并不旨在表示该片段必须位于多核苷酸的3’末端，或者甚至必须位于多核苷酸的3’端半序列上，但是它可以位于其上。同样地，多核苷酸的“5’部分”表示多核苷酸的一段在另一段的上游。术语“5’部分”并不旨在表示该片段必须位于多核苷酸的5’末端，或者甚至必须位于多核苷酸的5’端半序列上，但是它可以位于其上。

除非另有说明，如本文所用的，术语“多肽”包括肽和蛋白质两者。如本文所用的，术语给定肽的“片段”意指肽的任何肽亚组。在一个实施例中，一个片段包括肽序列的至少2个连续氨基酸。在另一个实施例中，所述片段包含至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个肽的连续氨基酸。在一些实施例中，所述片段具有给定肽的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列。

“多核苷酸”、“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基的序列，并且可以是rna、dna或dna-rna杂合序列(包括天然存在的和非天然存在的核苷酸)，但优选地是单链或双链dna序列。

如本文所用的，术语“开放阅读框(orf)”是指编码多肽的多核苷酸的部分，例如基因。

如本文所用的，术语“密码子优化的”是指相对于野生型编码序列(例如，ppt1的编码序列)得到优化的编码序列，以通过使用用于相同(同义)氨基酸的密码子取代一个或多个通常存在于编码序列中的密码子来提高编码序列的表达。在一些实施例中，所述取代将稀有密码子(例如人密码子)降至最少，增加总gc含量，降低cpg含量，去除隐蔽剪接供体或受体位点，和/或添加或去除核糖体进入位点，例如kozak序列。

如本文所用的，术语“序列同一性”具有本领域的标准含义。如本领域所知的，许多不同的程序可用于鉴定多核苷酸或多肽是否与已知序列具有序列同一性或相似性。可以使用本领域已知的标准技术确定序列同一性或相似性，包括但不限于smith&waterman的局部序列一致性算法(adv.appl.math.2:482(1981))，needleman&wunsch的序列一致性比对算法(j.mol.biol.48:443(1970))，pearson&lipman的搜索相似性方法(proc.natl.acad.sci.usa85:2444(1988))，这些算法的计算机化执行(wisconsin遗传软件包(thewisconsingeneticssoftwarepackage)中的gap、bestfit、fasta和tfasta,geneticscomputergroup,575sciencedrive,麦迪逊,wi)，devereux等描述的最佳拟合序列程序(nucl.acidres.12:387(1984))，优选地使用默认设置，或根据检查。

有用的算法的示例是pileup。pileup使用渐进的成对比对从一组相关序列创建多序列比对。它还可以绘制显示用于创建对齐的聚类关系的树。pileup使用简化的feng&doolittle的渐进比对方法(j.mol.evol.35:351(1987))；该方法类似于higgins&sharp描述的方法(cabios5:151(1989))。

有用算法的另一个例子是在altschuletal.,j.mol.biol.215:403(1990)和karlinetal.,proc.natl.acad.sci.usa90:5873(1993)描述的blast算法。一种特别有用的blast程序是wu-blast-2程序，该程序得自altschuletal.,meth.enzymol.,266:460(1996)；blast.wustl/edu/blast/readme.html。wu-blast-2使用多个搜索参数，优选地将其设置为默认值。所述参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和正在搜索目标序列的特定数据库的组成来建立；但是，可以调整这些值以增加灵敏度。

另一种有用的算法是依据altschuletal.,nucleicacidsres.25:3389(1997)的有缺口的blast。

氨基酸序列同一性百分比值由匹配的相同残基的数量除以比对区域中“较长”序列的残基总数确定。所述“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(忽略由wu-blast-2引入的以最大化比对得分的缺口)。

以类似的方式，核酸序列同一性百分比定义为候选序列中核苷酸残基与本文具体公开的多核苷酸中的核苷酸相同的百分比。

比对可以包括在待比对的序列中引入的缺口。另外，对于含有比本文具体公开的多核苷酸更多或更少的核苷酸的序列，应当理解，在一个实施例中，序列同一性的百分比将基于相对于核苷酸总数的相同核苷酸的数目来确定。因此，例如，在一个实施例中，将使用较短序列中的核苷酸数目确定比本文具体公开的序列短的序列的序列同一性。在同一性百分比计算中，相对权重未分配给序列变异的各种表现形式，例如插入、删除、替换等。

在一个实施例中，仅对同一性进行肯定评分(+1)，包括缺口在内的所有形式的序列变化被赋予值“0”，这免去了对如下所述的用于序列相似性计算的加权标度或参数的需要。例如，可以通过将匹配的相同残基的数量除以比对区域中“较短”序列的残基总数并乘以100来计算序列同一性百分比。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列。

如本文所用的，“分离的”核酸或核苷酸序列(例如，“分离的dna”或“分离的rna”)是指分离的或基本上不含天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分的核酸或核苷酸序列，例如，通常发现的与所述核酸或核苷酸序列相关的细胞或病毒结构组分或其他多肽或核酸。

同样，“分离的”多肽是指分离的或基本上不含天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分的多肽，例如，通常发现的与所述多肽相关的细胞或病毒结构组分或其他多肽或核酸。

如本文所用的，应用于多核苷酸或多肽序列的术语“经修饰的”是指由于一个或多个缺失、添加、取代或其任意组合而与野生型序列不同的序列。

如本文所用的，“分离”或“纯化”(或语法等价表示)病毒载体，是指病毒载体至少部分与起始材料中的至少一些其他组分分离。

术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“的治疗(treatmentof)”(或其语法等价术语)是指受试者病情的严重程度降低或至少部分得到改善或减轻，和/或是指部分缓解、减轻或者减少至少一种临床症状和/或延缓疾病的发展。

如本文所用的，术语“预防(prevent)”，“预防(prevents)”或“预防(prevention)”(及其语法等同物)是指疾病或病症发作的延迟或疾病或病症发作时症状的减轻。该术语并不意味着完全消除疾病，并且包括任何类型的预防性治疗，其降低病症的发生率或延迟病症的发作和/或进展。

如本文所用的,“治疗有效”量是足以为受试者提供一些改善或益处的量。或者说，“治疗有效”量是对受试者的至少一种临床症状提供一些缓解、减轻或者减弱或稳定的量。本领域技术人员将理解，治疗效果不需要是彻底的或治愈的，只要对受试者有一些益处即可。

本文所用的“预防有效”量是相对于在没有本发明方法的情况下足以预防和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状的发作和/或减少和/或延迟受试者的疾病、病症和/或临床症状的发病严重程度的量。本领域技术人员将理解，预防水平不需要是彻底的，只要对受试者有一些益处即可。

“异源核苷酸序列”或“异源核酸”是非天然存在于病毒中的序列。通常，异源核酸或核苷酸序列包含编码多肽和/或非翻译rna的开放阅读框。

如本文所用的，术语“载体”或“递送载体”(和类似术语)是指能够递送至细胞或受试者的dna片段、核苷酸分子或颗粒。所述载体包括病毒或非病毒载体。在一个实施例中，所述载体包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒载体或其他载体。在另一个实施例中，所述载体包括纳米颗粒。术语“病毒载体”或“病毒性载体”通常是指作为核酸递送载体工作的病毒颗粒，其包括包装在病毒粒子内的病毒核酸(即载体基因组)。根据本发明的病毒载体包括但不限于根据本发明的嵌合aav衣壳，并且其可以包装aav或raav基因组或包含病毒核酸的任何其他核酸。或者，在某些情况下，术语“载体”、“病毒载体”、“递送载体”(和类似术语)可用于指没有病毒粒子的载体基因组(例如，vdna)和/或指可作为转运体以递送拴系在衣壳上或包裹在衣壳内的分子的病毒衣壳。术语“非病毒载体”是指不包含病毒元件的载体、质粒、构建体、分子或颗粒。在一些实施例中，非病毒颗粒包括细菌质粒、酵母质粒、重组载体、纳米颗粒或其他载体，基本上由或由上述物质组成。在一个实施例中，非病毒颗粒包括纳米颗粒。可以用各种方法将非病毒载体递送至细胞或受试者，所述方法包括但不限于注射、电穿孔、基因枪、声波穿孔、磁力转染、流体动力学导入或其他物理或化学方法。

本发明的病毒载体还可以是双链体细小病毒颗粒，如国际专利公开wo01/92551(其公开内容通过引用整体并入本文)中所描述的。因此，在一些实施例中，可以包装双链(双链体)基因组。

“重组aav载体基因组”或“raav基因组”是包含至少一个反向末端重复(例如，一个、两个或三个反向末端重复)和一个或多个异源核苷酸的aav基因组(即，vdna)。raav载体通常以顺式保有145个碱基末端重复(tr)，以产生病毒；但是，包含部分或完全合成序列的修饰aavtr和非aavtr也可用于此目的。所有其他病毒序列都是非必要的并且可以反式提供(muzyczka,(1992)curr.topicsmicrobiol.immunol.158:97)。raav载体任选地包含两个tr(例如，aavtr)，其通常位于异源核苷酸序列的5'端和3'端，但不需要与其邻接。tr可以彼此相同或不同。所述载体基因组也可在其3'端或5'端含有单个itr。

术语“末端重复”或“tr”包括形成发夹结构并起到反向末端重复作用(即，介导所需的功能，例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等)的任何病毒末端重复序列或合成序列。tr可以是aavtr或非aavtr。例如，非aavtr序列，比如那些其他细小病毒(例如，犬细小病毒(cpv)、鼠细小病毒(mvm)、人细小病毒b-19)或作为sv40复制起点的sv40发夹的序列，可以用作tr，其可以通过截短、取代、缺失、插入和/或添加进一步修饰。此外，tr可以是部分或完全合成的，例如samulski等人的美国专利第5,478,745号中所描述的“双d序列”。

细小病毒基因组在其5’端和3’端都具有回文序列。所述序列的回文性质导致发夹结构的形成，其通过在互补碱基对之间形成氢键而稳定。该发夹结构被认为是“y”形或“t”形。参见，例如，fieldsetal.,virology,volume2,chapters69&70(4thed.,lippincott-ravenpublishers)。

“aav末端重复”或“aavtr”可以来自任何aav，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或任何其他现在已知或以后发现的aav(参见，例如，表1)。在一些实施例中，当末端重复介导所需功能时，例如，复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等，aav末端重复不具有天然末端重复序列(例如，天然aavtr序列可通过插入、缺失、截短和/或错义突变来改变)。在另一个实施例中，aav末端重复具有天然末端重复序列。

术语“raav颗粒”和“raav病毒粒子”在本文中可互换使用。“raav颗粒”或“raav病毒粒子”包括包装在aav衣壳内的raav载体基因组。

本发明的病毒载体还可以是“靶向的”病毒载体(例如，具有定向向性)和/或“杂合”细小病毒(即，其中病毒itr和病毒衣壳来自不同的细小病毒)，如在国际专利公开wo00/28004和chaoetal.,(2000)mol.therapy2:619中描述的。

此外，所述病毒衣壳或基因组元件可包含其他修饰，包括插入、缺失和/或取代。

如本文所用的，术语“氨基酸”包括任何天然存在的氨基酸和其修饰形式以及合成氨基酸。

表2中示出了天然存在的左旋(l-)氨基酸。

表2

作为替换，所述氨基酸可以是修饰的氨基酸残基(表3中示出了非限制性示例)或者可以是通过翻译后修饰(例如，乙酰化，酰胺化、甲酰化、羟基化、甲基化、磷酸化或硫酸化)进行修饰的氨基酸。

表3：氨基酸残基衍生物

此外，非天然存在的氨基酸可以是wangetal.,(2006)annu.rev.biophys.biomol.struct.35:225-49中描述的“非天然”氨基酸。这些非天然氨基酸能有利地用于将目标分子化学连接至aav衣壳蛋白。

本文使用的术语“模板”或“底物”是指可以复制以产生细小病毒dna的多核苷酸序列。为了产生载体，所述模板通常嵌入较大的核苷酸序列或构建体中，包括但不限于质粒、裸dna载体、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或病毒载体(例如，腺病毒、疱疹病毒、埃-巴二氏病毒、aav、杆状病毒、逆转录病毒载体等)。或者，可以将模板稳定地掺入包装细胞的染色体中。

如本文所用的，细小病毒或aav“rep编码序列”表示编码介导病毒复制和新病毒颗粒产生的细小病毒或aav非结构蛋白的核酸序列。所述细小病毒、aav复制基因和蛋白质已描述于例如,fieldsetal.,virology,volume2,chapters69&70(4thed.,lippincott-ravenpublishers)中。

所述“rep编码序列”不需要编码所有的细小病毒或aavrep蛋白。例如，对于aav，rep编码序列不需要编码所有四种aavrep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)，事实上，一般认为aav5仅表达剪接的rep68和rep40蛋白。在代表性实施例中，rep编码序列至少编码病毒基因组复制和包装成新病毒粒子所必需的那些复制蛋白。rep编码序列通常编码至少一种大rep蛋白(即rep78/68)和一种小rep蛋白(即rep52/40)。在特定实施例中，rep编码序列编码aavrep78蛋白、aavrep52和/或rep40蛋白。在其他实施例中，rep编码序列编码rep68、rep52和/或rep40蛋白。在又一个实施例中，rep编码序列编码rep68和rep52蛋白、rep68和rep40蛋白、rep78和rep52蛋白，或rep78和rep40蛋白。

如本文所用的，术语“大rep蛋白”是指rep68和/或rep78。要求保护的本发明的大rep蛋白可以是野生型或合成的。野生型大rep蛋白可以来自任何细小病毒或aav，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13或任何其他现在已知或以后发现的aav(参见，例如，表1)。合成的大rep蛋白可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变而改变。

本领域技术人员将进一步理解，复制蛋白不必由相同的多核苷酸编码。例如，对于mvm，ns-1和ns-2蛋白(它们是剪接变体)可以彼此独立地表达。同样地，对于aav，p19启动子可以是灭活的，并且是从一种多核苷酸表达的大rep蛋白以及是从不同的多核苷酸表达的小rep蛋白。然而，通常，从单一构建体表达复制蛋白将更方便。在一些系统中，病毒启动子(例如，aavp19启动子)可能不被细胞识别，因此有必要从单独的表达盒表达大rep蛋白和小rep蛋白。在其他情况下，可能需要分别表达大rep和小rep蛋白，即在单独的转录控制元件和/或翻译控制元件的控制下。例如，需要控制大rep蛋白的表达，以降低大rep蛋白与小rep蛋白的比例。在昆虫细胞的情况下，下调大rep蛋白(例如rep78/68)的表达以避免对细胞的毒性是有利的(参见，例如，urabeetal.,(2002)humangenetherapy13:1935)。

如本文所用的，细小病毒或aav“cap编码序列”编码形成功能性细小病毒或aav衣壳的结构蛋白(即，能包装dna并感染靶细胞)。通常，cap编码序列将编码所有细小病毒或aav衣壳亚基，但是只要产生功能性衣壳，可以不编码所有衣壳亚基。通常但非必要地，cap编码序列将存在于单个核酸分子上。

bernardn.fieldsetal.,virology,volume2,chapters69&70(4thed.,lippincott-ravenpublishers)中更详细地描述了自主细小病毒和aav的衣壳结构。

“基本上保留”性质是指至少约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的性质(例如，活性或其他可测量特性)得到保留。

cln1表达盒及载体

本发明涉及cln1表达盒的设计，以提供棕榈酰基蛋白硫酯酶1(ppt1)(由cln1基因编码的酶)的最大表达，以及该表达盒在受试者中达到治疗水平的ppt1的用途。

因此，本发明的一个方面涉及一种多核苷酸，其包含编码棕榈酰基蛋白硫酯酶1(ppt1)多肽或其片段的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列经密码子优化以在人细胞中表达。在一个实施例中，所述多核苷酸包含含有seqidno：1的序列(或其互补序列)或与其具有至少约90％序列同一性的序列或其互补序列的核苷酸序列。在另一个实施例中，所述核苷酸序列编码ppt1多肽或其片段。所述ppt1多肽序列可在genbank中找到，包括但不限于登记号：np_071947.1、np_776579.1、np_032943.2、aam49613.1和aah08426.1。在另一个实施例中，所述核苷酸序列经密码子优化以在细胞中表达。所述细胞包括但不限于人细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、犬细胞或任何哺乳动物或植物细胞。在一个实施例中，所述细胞是人细胞。在另一个实施例中，所述多核苷酸包含人、大鼠、小鼠、牛或任何其他物种的cln1开放阅读框。在另一个实施例中，所述多核苷酸包含人cln1开放阅读框。所述开放阅读框是编码ppt1的cln1基因部分。

在一些实施例中，所述密码子优化的cln1开放阅读框包含seqidno:1或与其具有至少约70％同一性(例如，与其具有至少约70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性)的序列的核苷酸序列，基本上由或由seqidno：1或与其具有至少约70％同一性(例如，与其具有至少约70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性)的序列的核苷酸序列组成。

seqidno:1:人密码子优化的cln1开放阅读框(加下划线的是添加的终止密码子)

atggcttctccggggtgtctgtggctgctggcagtggcactccttccctggacttgcgccagccgggctctgcagcacctcgaccctccagcccctcttccactggtgatttggcacggaatgggtgattcctgctgtaatcccctgtcaatgggagccatcaagaagatggtggagaagaagatccctggaatctacgtgctgtcactggagattggaaagaccctgatggaggacgtcgagaactccttcttcctcaatgtcaactctcaagtgaccaccgtctgccaggccctggccaaggacccgaagctgcagcaggggtataatgctatggggttcagccagggaggacagttccttcgggctgtggcccaacgctgccctagcccacccatgatcaacctgatctcagtgggtggccagcatcagggcgtgttcggacttccccggtgtcccggggaatcctctcatatctgcgacttcatccgcaaaactctcaatgcaggcgcttattcaaaggtcgtccaagagaggctggtgcaagccgagtactggcacgatcccattaaggaggacgtgtacagaaatcactcaatctttctggccgacattaaccaggagaggggaattaacgaatcatataagaagaatctcatggccctcaaaaagttcgtcatggtgaagttccttaacgatagcattgtggacccagtggacagcgaatggttcggattttaccgctcaggccaggcaaaagaaaccatccctctccaagagacttctctttacacccaagacagacttgggcttaaggaaatggataacgctggtcagctggtgttcctcgccaccgaaggtgaccatctgcagctcagcgaagagtggttctacgctcatatcatcccgtttcttggttgataa

本发明的另一方面涉及表达盒，其包含编码ppt1多肽或其片段的多核苷酸。在一个实施例中，所述多核苷酸包含任何物种的cln1开放阅读框。在另一个实施例中，所述多核苷酸包含人cln1开放阅读框。在某些实施例中，所述多核苷酸是人密码子优化的序列，例如，一种多核苷酸，其包含seqidno:1或与其具有至少约70％同一性(例如，与其具有至少约70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性)的序列的核苷酸序列。

所述表达盒中的多核苷酸可以与一种或多种能提高编码多肽的表达的表达元件可操作地连接。在一个实施例中，所述表达盒中的cln1多核苷酸与一种或多种可提高cln1表达的表达元件可操作地连接。在一些实施例中，所述多核苷酸与启动子可操作地连接，例如鸡β-肌动蛋白启动子，例如包含seqidno：2的核苷酸序列的启动子，基本上由或由seqidno：2的核苷酸序列组成的启动子。在一些实施例中，所述启动子还包含鸡β-肌动蛋白外显子1和内含子1，例如，包含seqidno：3的核苷酸序列，基本上由或由seqidno：3的核苷酸序列组成。

seqidno:2:鸡β-肌动蛋白启动子

tacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcg

seqidno:3:鸡β-肌动蛋白外显子1和内含子1

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在一些实施例中，所述多核苷酸可操作地连接至增强子，例如巨细胞病毒增强子，例如包含seqidno：4的核苷酸序列的增强子，基本上由或由seqidno：4的核苷酸序列组成的增强子。

seqidno:4:巨细胞病毒增强子

tacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatc

在一些实施例中，所述多核苷酸可操作地连接至内含子，例如杂合/修饰的mvm内含子，例如包含seqidno：5的核苷酸序列的内含子，基本上由或由seqidno：5的核苷酸序列组成的内含子。所述内含子可以位于能有效提高表达的表达盒的任何部分，例如在orf之前，在orf内，或在orf和多腺苷酸化位点之间。

seqidno:5:杂合/修饰的mvm内含子

aagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttgg

在一些实施例中，所述多核苷酸可操作地连接至多腺苷酸化信号，例如牛生长激素多腺苷酸化信号，例如包含seqidno：6的核苷酸序列的内含子，基本上由或由seqidno：6的核苷酸序列组成的多腺苷酸化信号。

seqidno:6:牛生长激素多腺苷酸化信号

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本领域技术人员将进一步认识到，根据所期望的水平和组织特异性表达，可以使用各种启动子/增强子元件。如本文所用的术语“启动子”表示rna聚合酶结合以启动与启动子可操作连接的核酸序列(例如基因)的转录的dna区域。所述启动子可以是病毒或非病毒启动子。病毒启动子包括但不限于pcmv、sv40、mmtv启动子。非病毒启动子包括但不限于ubc、ef或pgk启动子。术语“增强子”是指顺式作用转录调节元件。在一个实施例中，所述增强子用于整体调节基因表达。在另一个实施例中，所述增强子元件结合dna结合蛋白和/或影响dna拓扑结构，产生能选择性地允许或限制rna聚合酶进入dna模板或促进转录起始位点的双螺旋的选择性打开的局部构象。所述增强子的非限制性列表可以在vistaenhancerbrowser(其可在enhancer.lbl.gov/获取到)中找到。术语“内含子”是指外显子之间的非翻译dna序列，以及与遗传基因座相关的5'和3'非翻译区。根据所期望的表达模式，启动子/增强子可以是组成型或诱导型的。启动子/增强子可以是天然的或外源的，可以是天然的或合成的序列。采用外源的时，这表示在引入转录起始区的野生型宿主中不存在引入转录起始区。

启动子/增强子元件对于靶细胞或待处理对象是天然的，和/或对于异源核酸序列是天然的。启动子/增强子元件通常是经过选择的，使其可以在目标靶细胞中起作用。在代表性实施例中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强元件可以是组成型或诱导型的。

诱导型表达控制元件通常用于希望对异源核酸序列过表达进行调控的那些应用中。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性的或组织优选的启动子/增强子元件，包括肌肉特异性的或优选的(包括心脏、骨骼和/或平滑肌)启动子/增强子元件、神经组织特异性的或优选的(包括脑特异性的)启动子/增强子元件、眼(包括视网膜特异性的和角膜特异性的)启动子/增强子元件、肝特异性的或优选的启动子/增强子元件、骨髓特异性的或优选的启动子/增强子元件、胰特异性的或优选的启动子/增强子元件、脾特异性或优选的启动子/增强子元件，以及肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其他诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于tet开/关元件、ru486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。

在其中cln1orf被转录然后在靶细胞中被翻译的实施例中，通常使用特异性起始信号来有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些外源翻译控制序列(包括atg起始密码子和邻近序列)可以有多种来源，天然的和合成的都可以。

在某些实施例中，所述表达盒还包含至少一种腺相关病毒(aav)反向末端重复(itr)，例如两种aavitr。所述两个itr可以具有相同的核苷酸序列或不同的核苷酸序列。所述aavitr可以来自任何aav血清型，例如aav2。每个itr可以独立地是野生型序列或修饰序列。在一些实施例中，所述表达盒是aav基因组，例如自身互补的aav基因组。

在某些实施例中，所述表达盒包含编码ppt1多肽或其片段的多核苷酸。在一个实施例中，所述表达盒包含人cln1开放阅读框和启动子、外显子、内含子、增强子和多腺苷酸化信号中的一种或多种的任何组合。在某些实施例中，所述表达盒包含多核苷酸，该多核苷酸包含人cln1开放阅读框和启动子、外显子、内含子、增强子和多腺苷酸化信号中的一种或多种的任何组合。在某些实施例中，所述表达盒包含增强子、启动子、内含子、人cln1开放阅读框和多腺苷酸化位点，任选地按所述顺序排列。在某些实施例中，所述表达盒包含aavitr、增强子、启动子、内含子、人cln1开放阅读框、多腺苷酸化位点和aavitr，任选地按所述顺序排列。在某些实施例中，所述表达盒包含cmv增强子、鸡β肌动蛋白启动子、杂合/修饰的mvm内含子、人cln1开放阅读框和牛生长激素多腺苷酸化位点，任选地按所述顺序排列。在某些实施例中，所述表达盒包含突变体aavitr、cmv增强子、鸡β肌动蛋白启动子、杂合/修饰的mvm内含子、人cln1开放阅读框、牛生长激素多腺苷酸化位点和野生型aavitr，任选地按所述顺序排列。

在一些实施例中，所述表达盒包含seqidno:7或与其具有至少约70％同一性(例如，与其具有至少约70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性)的序列的核苷酸序列，基本上由或由seqidno：1或与其具有至少约70％同一性(例如，与其具有至少约70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性)的序列的核苷酸序列组成。

seqidno:7:cln1表达盒

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggggttcggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtcgccaccatggcttctccggggtgtctgtggctgctggcagtggcactccttccctggacttgcgccagccgggctctgcagcacctcgaccctccagcccctcttccactggtgatttggcacggaatgggtgattcctgctgtaatcccctgtcaatgggagccatcaagaagatggtggagaagaagatccctggaatctacgtgctgtcactggagattggaaagaccctgatggaggacgtcgagaactccttcttcctcaatgtcaactctcaagtgaccaccgtctgccaggccctggccaaggacccgaagctgcagcaggggtataatgctatggggttcagccagggaggacagttccttcgggctgtggcccaacgctgccctagcccacccatgatcaacctgatctcagtgggtggccagcatcagggcgtgttcggacttccccggtgtcccggggaatcctctcatatctgcgacttcatccgcaaaactctcaatgcaggcgcttattcaaaggtcgtccaagagaggctggtgcaagccgagtactggcacgatcccattaaggaggacgtgtacagaaatcactcaatctttctggccgacattaaccaggagaggggaattaacgaatcatataagaagaatctcatggccctcaaaaagttcgtcatggtgaagttccttaacgatagcattgtggacccagtggacagcgaatggttcggattttaccgctcaggccaggcaaaagaaaccatccctctccaagagacttctctttacacccaagacagacttgggcttaaggaaatggataacgctggtcagctggtgttcctcgccaccgaaggtgaccatctgcagctcagcgaagagtggttctacgctcatatcatcccgtttcttggttgataagcggccgcggggatccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaacagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctttggacgcgtaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttc

本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸或表达盒的载体。合适的载体包括但不限于质粒、噬菌体、病毒载体(例如，aav载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒属载体或杆状病毒载体)、细菌人工染色体(bac)或酵母人工染色体(yac)。例如，所述核酸可包含含有5’和/或3’末端重复(例如，5’和/或3’aav末端重复)的aav载体，由或基本上由含有5’和/或3’末端重复(例如，5’和/或3’aav末端重复)的aav载体组成。

在一些实施例中，所述载体是病毒载体，例如aav载体。所述aav载体可以是任何aav血清型，例如aav9。在一些实施例中，所述aav载体可包含野生型衣壳蛋白。在其他实施例中，与野生型衣壳蛋白相比，所述aav载体可包含具有改变的向性的修饰的衣壳蛋白，例如经肝脏去靶向或具有增强的神经系统细胞向性的修饰衣壳蛋白。具有神经系统细胞向性的修饰衣壳蛋白的示例包括但不限于美国专利第9,636,370号(例如，第48栏，第54-65行；表2)和国际公开号wo2016/081811(例如，在第[0144]段和第[0287]段)，两者均以引用的方式全文并入本文。

在一些实施例中，所述载体是自身互补或双链aav(scaav)载体。所述scaav载体描述于国际专利公布wo01/92551(其公开内容通过引用全文并入本文)。使用scaav表达cln1orf可以增加转导的细胞数量，增加每个转导细胞的拷贝数或增加两者。

本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体的转化细胞。在一些实施例中，所述多核苷酸、表达盒和/或载体稳定掺入细胞基因组中。所述转化细胞可以是体外、离体或体内细胞。在一些实施例中，所述转化细胞是适合产生如下所述的aav载体的细胞。

本发明的另一方面涉及包含本发明的多核苷酸、表达盒、载体、多肽和/或转化细胞的转基因动物。在一些实施例中，所述转基因动物是实验动物，例如小鼠、大鼠、狗或猴。在一些实施例中，所述动物是疾病的模型。

本发明的另一方面涉及药物制剂，其包含如下所述的在药学上可接受的载体中的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞。

产生病毒载体的方法

本发明还提供了生成病毒载体的方法。在一个具体实施例中，本发明提供了一种产生重组aav颗粒的方法，包括向允许aav复制的细胞提供：(a)重组aav模板，其包含(i)本发明的多核苷酸或表达盒，和(ii)itr；(b)包含rep编码序列和cap编码序列的多核苷酸；在足以复制和包装重组aav模板的条件下；由此在细胞中产生重组aav颗粒。足以复制和包装重组aav模板的条件可以是，例如，存在足以复制aav模板并衣壳化成aav衣壳的aav序列(例如，aavrep序列和aavcap序列)和来自腺病毒和/或疱疹病毒的辅助序列。在特定实施例中，所述aav模板包含两个aavitr序列，其位于本发明的多核苷酸的5’和3’，但它们不需要与其直接邻接。

在一些实施例中，所述重组aav模板包含如国际专利公开wo01/92551中所述的不会被rep解析以制备双链aav载体的itr。

在一定条件下提供aav模板、aavrep和cap序列，使得包含包装在aav衣壳内的aav模板的病毒载体能在细胞中产生。该方法可以进一步包括从细胞中收集病毒载体的步骤。可以从培养基中和/或通过裂解细胞收集病毒载体。

所述细胞可以是能自由进行aav病毒复制的细胞。可以使用本领域已知的任何合适的细胞。在特定实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞(例如，灵长类动物或人类细胞)。作为替换，所述细胞可以是提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其他e1a反式互补细胞。

可以通过本领域已知的任何方法提供aav复制和衣壳序列。现有的方案通常在单个质粒上表达aavrep/cap基因。aav复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能很方便。aavrep和/或cap序列可以由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂合腺病毒或疱疹病毒载体提供(例如，插入缺失的腺病毒载体的e1a或e3区)。ebv载体也可用于表达aavcap和rep基因。该方法的一个优点是ebv载体是附加型的，但在整个连续细胞分裂过程中将保持高拷贝数(即作为染色体外元件稳定整合到细胞中)，称为“基于ebv的核附加体”，参见margolski,(1992)curr.top.microbiol.immun.158:67)。

作为进一步的替换方案，rep/cap序列可以稳定地掺入细胞内。

一般来说，aavrep/cap序列不会侧接tr，以防止这些序列的拯救和/或包装。

可以使用本领域已知的任何方法将aav模板提供给细胞。例如，模板可以由非病毒(例如质粒)或病毒载体提供。在特定实施例中，所述aav模板由疱疹病毒或腺病毒载体提供(例如，插入缺失的腺病毒的e1a或e3区)。作为另一个例子，palomboetal.,(1998)j.virology72:5025描述了携带侧翼为aavtr的报告基因的杆状病毒载体。ebv载体也可用于递送模板，如上面关于rep/cap基因的描述。

在另一个代表性实施例中，所述aav模板由复制型raav病毒提供。在其他实施例中，包含aav模版的aav原病毒能稳定整合到细胞的染色体中。

为了提高病毒滴度，通常向细胞提供能促进生产性aav感染的辅助病毒功能(例如，腺病毒或疱疹病毒)。aav复制所需的辅助病毒序列是本领域已知的。通常，这些序列由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。作为替换，所述腺病毒或疱疹病毒序列可由另一种非病毒或病毒载体提供，例如作为携带了能促进有效aav生产的所有辅助基因的非感染性腺病毒小质粒，如ferrarietal.,(1997)naturemed.3:1295和美国专利第6,040,183号和第6,093,570号所描述的。

此外，所述辅助病毒功能可由具有嵌入到染色体中或作为稳定的染色体外元件维持的辅助序列的包装细胞提供。一般来说，所述辅助病毒序列不能被包装进aav病毒粒子中，例如不能被itr侧接。

本领域技术人员将会理解，在单个辅助构建体上提供aav复制和衣壳序列以及辅助病毒序列(例如腺病毒序列)是有利的。该辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性说明，所述辅助构建体可以是包含aavrep/cap基因的杂合腺病毒或杂合疱疹病毒。

在一个特定实施例中，aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。该载体还包含aav模板。可将aavrep/cap序列和/或aav模板插入腺病毒的缺失区(例如e1a或e3区)。

在另一个实施例中，aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供。根据该实施例，所述aav模板可以作为质粒模板提供。

在另一个说明性实施例中，aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且所述aav模板作为原病毒被整合到细胞中。或者，所述aav模板由作为染色体外元件维持在细胞内的ebv载体提供(例如，作为基于ebv的核附加体)。

在进一步的示例性实施例中，所述aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助体提供。所述aav模板作为单独的复制型病毒载体提供。例如，所述aav模板可以由aav颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。

根据前述方法，杂合腺病毒载体通常包含足以用于腺病毒复制和包装(即，腺病毒末端重复序列和pac序列)的腺病毒5'和3'顺式序列。所述aavrep/cap序列和aav模板(如果存在的话)嵌入腺病毒骨架中，并且侧接5'和3'顺式序列，从而可以将这些序列包装进腺病毒衣壳中。如上所述，所述腺病毒辅助序列和aavrep/cap序列通常不被itr侧接，使得这些序列未被包装到aav病毒粒子中。

zhangetal.,((2001)genether.18:704-12)描述了包含腺病毒和aavrep和cap基因的嵌合辅助子。

疱疹病毒也可以在aav包装方法中用作辅助病毒。编码aavrep蛋白的杂合疱疹病毒可以有利地促进可扩大的aav载体生产方案。已经描述了表达aav-2rep和cap基因的杂合单纯疱疹病毒i型(hsv-1)载体(conwayetal.,(1999)genether.6:986和wo00/17377)。

作为进一步的替换方案，可以使用杆状病毒载体在昆虫细胞中生成本发明的病毒载体，以递送rep/cap基因和aav模板，例如urabeetal.,(2002)humangenether.13:1935-43所描述的。

可通过本领域已知的任何方法获得不含污染辅助病毒的aav载体原种。例如，aav和辅助病毒能够很容易地根据大小进行区分。根据对肝素底物的亲和力，aav也可以与辅助病毒分离(zolotukhinetal.(1999)genetherapy6:973)。可使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，这样任何污染性辅助病毒不具有复制能力。作为进一步的替换方案，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助体，因为仅需要腺病毒早期基因表达来介导aav的包装。晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的(例如，ts100k和ts149腺病毒突变体)。

使用cln1载体的方法

本发明还涉及将cln1orf递送至细胞或受试者以增加ppt1产生的方法，例如用于体外、离体或体内的治疗或研究目的。因此，本发明的一方面涉及在细胞中表达编码ppt1多肽或cln1开放阅读框的方法，包括使细胞与本发明的多核苷酸、表达盒和/或载体接触，从而在细胞中表达ppt1多肽或cln1开放阅读框。在一些实施例中，所述细胞是体外细胞、离体细胞或体内细胞。

本发明的另一方面涉及在受试者中表达编码ppt1多肽或cln1开放阅读框的方法，包括将本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞递送至受试者，从而在受试者中表达ppt1多肽或cln1开放阅读框。在一些实施例中，受试者是神经元蜡样脂褐质沉积症或与异常cln1基因表达相关的其他病症的动物模型。

本发明的又一方面涉及治疗与有需要的受试者的cln1基因的异常表达或者cln1基因产物的异常活动相关的病症的方法，包括向受试者递送治疗有效量的本发明的多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞，从而治疗与受试者的cln1基因的异常表达相关的病症。在一些实施例中，与cln1基因表达相关的病症是婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症或神经元蜡样脂褐质沉积症的晚期发作形式，包括但不限于晚期婴儿、青少年或成人发作的神经元蜡样脂褐质沉积症。

在某些实施例中，将多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞递送至受试者的神经系统，例如，直接递送至受试者的神经系统。在一些实施例中，通过鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内或眼周递送或其任何组合递送多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞。在一些实施例中，静脉内递送多核苷酸、表达盒、载体和/或转化细胞。在另一个实施例中，通过注射、电穿孔、基因枪、声孔效应、磁力转染、流体动力学递送或其他物理或化学方法递送多核苷酸、表达盒和/或载体。

根据本发明的重组病毒载体可用于兽医和医学应用。合适的受试者包括禽类和哺乳动物。本文所用的术语“禽类”包括但不限于鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、野鸡、鹦鹉、长尾小鹦鹉。本文使用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、灵长类非人灵长类动物(例如，猴子和狒狒)、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠等等。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。任选地，所述受试者“需要”本发明的方法，例如，因为受试者患有包括本文所述的那些病症或被认为有患包括本文所述的那些病症的风险，或者是将受益于递送包括本文所述那些物质的多核苷酸。作为进一步的选择，所述受试者可以是实验动物和/或疾病的动物模型。

在某些实施例中，本发明的多核苷酸在受试者的生命中尽可能早的施用给有需要的受试者，例如，受试者一被诊断出具有异常的cln1表达和/或异常的ppt1活性就施用。在一些实施例中，例如在新生儿筛查后被鉴定出异常cln1表达和/或异常ppt1活性后，将所述多核苷酸施用给新生受试者。在一些实施例中，例如在产前筛查后被鉴定出异常cln1表达和/或异常ppt1活性后，将所述多核苷酸施用给子宫中的胎儿。在一些实施例中，一旦受试者出现与异常cln1表达和/或异常ppt1活性相关的症状或者疑似具有或被诊断为具有异常cln1表达和/或异常ppt1活性，就将所述多核苷酸施用给受试者。在一些实施例中，在受试者出现与异常cln1表达和/或异常ppt1活性相关的症状之前将所述多核苷酸施用给受试者，例如，疑似具有或被诊断为具有异常cln1表达和/或异常ppt1活性但尚未开始出现症状的受试者。

在特定实施例中，本发明提供了药物组合物或药物制剂，其包含在药学上可接受的载体中的本发明的病毒载体以及任选的其他药用制剂、药物制剂、稳定剂、缓冲液、载体、佐剂、稀释剂等。用于注射时，载体通常是液体。对于其他给药方法，载体可以是固体或液体。对于吸入给药，载体将是可吸入的，并且将优选为固体或液体颗粒形式。

“药学上可接受的”是指没有毒性或其他不良效应的材料，即该材料可以施用给受试者而不会引起任何不希望的生物学效应。

本发明的一个方面是将编码ppt1多肽或cln1orf的多核苷酸转移至体外细胞的方法。根据适用于特定靶细胞的标准转导方法，可以以合适的感染复数将病毒载体引入细胞。根据靶细胞类型和数量以及特定的病毒载体或衣壳，施用病毒载体或衣壳的滴度可以不同，并且可以由本领域技术人员确定而无需过多实验。在特定实施例中，将至少约10³个感染单位，更优选至少约10⁵个感染单位引入细胞。

可引入载体(例如，病毒或非病毒载体)的细胞可以是任何类型，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞，如神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞)、肺细胞、眼细胞(包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞)、上皮细胞(例如消化道和呼吸道上皮细胞)、骨骼肌细胞(包括成肌细胞、肌管和肌纤维)、隔膜细胞、树突细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、胃肠道细胞(包括平滑肌细胞、上皮细胞)、心脏细胞(包括心肌细胞)、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、关节细胞(包括例如软骨、半月板、滑膜和骨髓)、生殖细胞等。作为替换方案，所述细胞可以是任何祖细胞。作为另一种替换方案，所述细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为另一种替换方案，所述细胞可以是癌症或肿瘤细胞(癌症和肿瘤如上所述)。此外，所述细胞可以来自任何来源的物种，如上所述。

为了将修饰的细胞施用给受试者，可将病毒或非病毒载体在体外引入细胞。在具体的实施例中，所述细胞已经从受试者体内移出，所述载体被引入其中，然后将细胞重新放回受试者体内。从受试者体内移出细胞以进行离体处理，接着将其放回受试者体内的方法是本领域已知的(参见例如美国专利第5,399,346号)。作为替换方案，可以将重组病毒载体引入来自另一个受试者的细胞中，引入培养的细胞中或者引入来自任何其他合适来源的细胞中，并将所述细胞施用给有需要的受试者。

用于离体基因治疗的合适细胞如上文所述。施用给受试者的细胞剂量将随受试者的年龄、状况和种族以及细胞类型、细胞表达的核酸、施用模式等有所变化。通常，施用在药学上可接受的载体中的每一剂量时将有至少约10²至约10⁸或约10³至约10⁶个细胞被施用。在具体的实施方案中，用病毒载体转导的细胞以有效含量与药物载体组合施用给受试者。

本发明的又一方面是将本发明的病毒载体施用给受试者的方法。在具体的实施例中，所述方法包括将编码ppt1多肽或其片段或cln1orf的多核苷酸递送至动物受试者的方法，该方法包括：将有效量的本发明的病毒载体施用给动物受试者。可以采用本领域已知的任何手段将本发明的病毒载体施用给有需要的人类受试者或有需要的动物。任选地，所述病毒载体是在药学上可接受的载体中以有效剂量递送。

待施用给受试者的病毒载体的剂量取决于施用模式、待治疗的疾病或病症、个体受试者的状况、具体的病毒载体和待递送的核酸，并且它们可以以常规方式确定。达到治疗效果的示例性剂量是病毒滴度为至少约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶、10¹⁷、10¹⁸个转导单位或更多，例如约10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶个转导单位，例如约10¹²至约10¹⁴个转导单位。

在具体的实施方案中，所述施用可以超过一次(例如，2次、3次、4次或更多次施用)，以在各种时间间隔的时间段(例如每小时、每天、每周、每月、每年等等)实现期望的基因表达水平。每次给药可以是相同或不同的途径，例如，通过不同途径间隔1小时进行两次给药。

示例性的施用模式包括口服、直肠、经粘膜、局部、鼻内、吸入(例如采用气雾剂)、含服(例如舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内[包括施用至骨骼、隔膜和/或心肌]、皮内、胸膜内、大脑内和关节内)、局部(例如，施用至皮肤和粘膜表面，包括气道表面，和经皮施用)、淋巴内等，以及直接组织或器官注射(例如，施用至肝、骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。也可以施用至肿瘤(例如，在肿瘤或淋巴结内或附近)。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗疾病的性质和严重程度以及所使用的具体载体的性质。

在一些实施例中，将病毒载体施用于cns、外周神经系统或两者。

在一些实施例中，将病毒载体直接施用于cns，例如大脑或脊髓。直接施用会使cns细胞转导具有高度特异性，例如，其中转导细胞的至少80％、85％、90％、95％或更多是cns细胞。可以使用本领域已知的任何方法将载体直接施用于cns。所述载体可以被引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、脑下垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、包括枕骨、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底神经节、海马和杏仁核的大脑)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。所述载体还可以施用于眼睛的不同区域，例如视网膜、角膜或视神经。所述载体可以被递送到脑脊髓液中(例如，通过腰椎穿刺)，以更多地分散施用载体。

可以通过本领域已知的任何途径将递送载体施用于期望的cns区域，包括但不限于鞘内、脑内、心室内、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如，眼球筋膜下区)递送或其任何组合。

所述递送载体可以以产生更广泛、扩散转导组织(包括cns、外周神经系统和/或其他组织)的方式施用。

通常，所述病毒载体将在液体制剂中通过直接注射(例如，立体定向注射)施用至cns和/或其他组织中的所需区域或区室。在一些实施例中，所述载体可以通过储库和/或泵递送。在其他实施例中，所述载体可以通过局部施用至所需区域或通过鼻内施用气溶胶制剂来提供。向眼睛或耳朵施用可以通过局部施用液滴。作为另一种选择，所述载体可以作为固体缓释制剂施用。国际专利公开wo01/91803描述了细小病毒和aav载体的控制释放。

注射剂可以制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液，适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者是乳液。作为替换方案，可以以局部而不是全身方式施用病毒载体，例如以储库或缓释制剂施用。此外，病毒载体可以被干燥的递送至可手术植入的基质，例如骨移植替代物、缝合线、支架等(例如，如美国专利7,201,898所描述的)。

术语“药物组合物”是指任何剂型，其包括但不限于片剂、包衣片剂、粉末剂、重构粉剂、丸剂、珠粒剂、迷你片剂、多层片剂、双层片剂、双层片片剂、药丸、微丸、小片剂、mups(多单位丸剂系统)、崩解片剂、分散片剂、颗粒剂、微球剂、多颗粒剂、胶囊剂(以粉剂、重构粉剂、丸剂、珠粒剂、迷你片剂、药丸、微丸、小片剂、mups、口腔崩解mups、崩解片、分散片剂、颗粒剂、喷雾剂、微球剂和多颗粒剂填充)、小药囊(以粉末剂、重构粉剂、丸剂、珠粒剂、迷你片剂、药丸、小丸剂、小片剂、mups、崩解片剂、分散片剂、改良释放片剂或胶囊剂、泡腾颗粒剂、颗粒剂、喷雾剂、微球剂和多颗粒剂填充)，或喷雾剂。适于口服施用的药物组合物可以以离散单元存在，比如胶囊、扁囊剂、锭剂或片剂，每个含有预定量的本发明组合物；作为粉末或颗粒；作为水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或者作为水包油或油包水型乳剂。口服给药可以通过将本发明的病毒载体与能够经受动物肠道消化酶降解的载体复合来进行。如本领域已知的，这种载体的示例包括塑料胶囊或片剂。这类制剂通过任何合适的制药方法制备，其包括使组合物和合适的载体(其可以包含一种或多种如上所述的助剂)结合的步骤。通常，根据本发明实施例的药物组合物按如下步骤制备：将组合物与液体或精细粉碎的固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后如果需要，使所得混合物成型。例如，可以通过压制或模制含有所述组合物的粉末或颗粒(任选地，含有一种或多种助剂)制备片剂。通过在合适的机器中压缩自由流动形式的组合物(比如任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合的粉末或颗粒)来制备压制片剂。通过在合适的机器中模制用惰性液体粘合剂润湿的粉状化合物来制备模制片剂。在一个实施例中，药物组合物包含药物制剂，其是指含有治疗有效量的活性药物成分的混合物或溶液。所述活性药物成分包括但不限于化学品、多肽、核苷酸、抗体或脂质。

适于含服(舌下)给药的药物组合物包括含有在调味基料(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的本发明组合物的的锭剂；和含有在惰性基质(如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的组合物的软锭剂。

适用于肠胃外给药的药物组合物可以包含本发明组合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制剂任选地与预期的接受者的血液等渗。这些制剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，它们使组合物与预期的接受者的血液等渗。水性和非水性无菌混悬剂、溶液剂和乳剂可以包括悬浮剂和增稠剂。非水溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。含水载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。也可以含有防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

所述组合物可以以单位/剂量容器或多剂量容器存在，例如在密封的安瓿和小瓶中，并且可以以冷冻干燥(冻干)条件存储，仅需要在使用前即时添加无菌液体载体，例如，盐水或注射用水。

即时注射溶液和混悬剂可以由前文所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，可以提供在密封容器中的单位剂量形式的本发明可注射的、稳定的无菌组合物。所述组合物可以以冻干物的形式提供，其可以用合适的药学上可接受的载体重构，以形成适于向受试者注射的液体组合物。单位剂型可以含约1μg至约10g的本发明组合物。当所述组合物基本上不溶于水时，其可以包含足够量的生理上可接受的乳化剂，足以使所述组合物在含水载体中乳化。一种这样的有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。

适合于直肠给药的药物组合物可以以单位剂量栓剂形式提供。它们可以通过将所述组合物与一种或多种常规固体载体(例如，可可脂)混合然后使所得混合物成型来制备。

适用于局部施用于皮肤的本发明药物组合物可以采用软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油的形式。可以使用的载体包括但不限于凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、透皮增强剂以及它们中两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，局部递送可以通过将本发明的药物组合物与能够通过皮肤的亲脂性试剂(例如，dmso)混合来进行。

适于透皮施用的药物组合物可以是适于与受试者的表皮长时间紧密接触的离散贴剂的形式。适于透皮施用的组合物也可以通过离子电渗疗法递送(参见例如pharm.res.3:318(1986))，并且通常采取本发明组合物的任选缓冲水溶液的形式。合适的制剂可以包含柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(ph6)或乙醇/水，并且可以含有0.1至0.2m活性成分。

本文公开的病毒载体可以通过任何合适的手段施用至受试者的肺，例如通过施用受试者吸入的包含病毒载体的可吸入颗粒的气雾剂混悬剂。可吸入颗粒可以是液体或固体。如本领域技术人员已知的，包含病毒载体的液体颗粒的气雾剂可采用任何合适的手段生产，比如使用压力驱动的气雾剂雾化器或超声波雾化器。参见例如美国专利第4,501,729号。采用制药领域已知的技术，同样可以用任何固体颗粒药物气雾剂发生器生产包含病毒载体的固体颗粒的气雾剂。

上文已经描述了本发明，其将在下面的实施例中得到更详细地解释，包含在本发明中的这些实施例仅用于说明目的，它们不用于对本发明进行限制。

实施例1

包含优化的cln1的aav载体

开发aav载体基因组盒以表达cln1orf。所述盒设计用于提供将包装在多个aav衣壳内的自身互补的aav基因组的最大表达。所述盒按顺序由下述组成：突变体aav2itr、cmv增强子、鸡β肌动蛋白启动子、杂合/修饰的mvm内含子、密码子优化的人cln1orf、牛生长激素多腺苷酸化位点和野生型(wt)aav2itr(图1)。通过将所述表达盒转染到hek293细胞中来验证cln1的表达，并通过蛋白质印迹检测在细胞和培养基中表达的蛋白质。

将cln1表达盒包装在aav9衣壳内，并将所得载体经鞘内、静脉内或通过脑池注射给cln1敲除小鼠。野生型aav9衣壳用于鞘内注射，肝脏去靶向aav9衣壳(aav9.47)用于静脉内注射。所述aav9载体以7x10¹⁰、2.2x10¹¹或7x10¹¹个载体基因组的剂量鞘内施用，或者以2.8x10¹¹个载体基因组的剂量在出生时静脉内施用。以1x10¹²个载体基因组的剂量施用aav9.47载体。载体在出生时、7-10天、4周、20周或26周施用。所有群组的结果显示在图2中，不同群组的结果显示在图3-6中。

这些研究表明，当鞘内施用7x10¹⁰vg的scaav9/cln1时，小鼠的寿命加倍，从8个月增加到16个月。当静脉内施用时，还发现载体是治疗性的。

图7a显示施用scaav9/cln1疗法的小鼠中血清ppt1水平增加。在年龄4周、20周和26周将载体以7x10¹⁰和7x10¹¹vg的剂量鞘内注射到野生型异源cln1敲除小鼠中。在施用后3个月或在人道终点测量血清ppt1水平。在所有时间点和剂量观察到超生理ppt1水平。图7b示出了在7x10¹⁰和7x10¹¹vg的剂量下在不同年龄施用scaav9/cln1的小鼠组的生存曲线。两种剂量的早期施用都使存活率增加。

对经治疗的小鼠进行行为分析，以检测载体施用后行为的改善。

在运动协调性试验中，将小鼠(异源未治疗小鼠，敲除未治疗小鼠，在不同年龄以低剂量(7x10¹⁰vg)、中等剂量(2.2x10¹¹vg)或高剂量(7x10¹¹vg)治疗的敲除小鼠)置于旋转棒的顶部，初始速度为3rpm。在整个300秒的试验过程中，速度逐渐增加到30rpm。测量从杆顶部落下的等待时间。测试在不同年龄进行。结果显示在图8a(行为测试在<1岁开始)和图8b(行为测试在>1岁开始)中。通过aav载体进行cln1表达盒的基因转移在所示的所有剂量和治疗年龄中为敲除小鼠提供了一些在运动功能方面的益处，其中较高剂量的早期干预具有最大益处。

在游泳能力和视觉功能的测试中，将小鼠(异源未治疗小鼠，敲除未治疗小鼠，在不同年龄以低剂量(7x10¹⁰vg)、中等剂量(2.2x10¹¹vg)或高剂量(7x10¹¹vg)治疗的敲除小鼠)放入morris水迷宫中，该morris水迷宫由位于室内、具有许多视觉信号的直径122cm、水深45cm的水池组成。每天每只小鼠进行4次试验，持续2-3天，游泳到逃生平台，由延伸到水面上方的有图案的圆柱体给予提示。对于每次试验，将小鼠置于池中4个可能位置中的1个(随机排序)，然后给予60秒以找到可见平台。如果小鼠找到平台，则试验结束，并且在下一次试验开始之前让动物在平台上停留10秒。如果没有找到平台，则将小鼠放在平台上10秒，然后进行下一次试验。在不同年龄进行测试。测量游泳速度(图9a-9b)、到达平台时间(图10a-10b)和游泳距离(图11a-11b)。与未治疗的对照敲除小鼠相比，经处理的敲除小鼠在这些任务上表现更好，以更高剂量进行早期干预具有最大益处。

在握力测试中，将小鼠(异源未治疗小鼠，敲除未治疗小鼠，在不同年龄以低剂量(7x10¹⁰vg)、中等剂量(2.2x10¹¹vg)或高剂量(7x10¹¹vg)治疗的敲除小鼠)放在一个大的金属笼盖上。轻轻摇动盖子以诱导小鼠抓住金属网格。然后翻转笼顶，记录小鼠从盖子上落下的等待时间。最大试验长度为60秒。还测量了握抓的评分，其中-6＝小鼠立即跌落或在15秒内跌落(如果小鼠是由于最初没有稳定放置在盖子上而落下，则进行第二次试验)；-4＝小鼠前爪或后爪表现出笨拙抓握的能力，爪子错过线，在线上非常不稳定(通常在30秒内掉落)；-2＝小鼠主要用四肢而不是爪子抓线，转弯能力差，在线上非常不稳定；并且0＝小鼠表现正常，用前肢和后肢抓握协调性良好，良好的转弯能力。在不同年龄进行测试。测量掉落时间(图12a-12b)和协调性得分(图13a-13b)。与未治疗的对照敲除小鼠相比，经处理的敲除小鼠在这些任务上表现更好，以更高剂量进行早期干预具有最大益处。

测试scaav9/cln1治疗在新生儿中的作用。将异源和cln1敲除小鼠在新生儿期静脉内施用载体(2.8x10¹¹vg)。在不同年龄测量存活时间(图14a)、血清ppt1水平(图14b)、加速旋转棒性能(图14c)、掉落时间(图14d)、协调性评分(图14e)、游泳速度(图14f)、到达平台的时间(图14g)和距离游泳(图14h)。与未治疗的对照敲除小鼠相比，在所有评估的区域，包括延长的存活时间，这些测试的结果显示处理的敲除小鼠的功能显著更大。尽管血清ppt1酶活性的超生理水平长期表达，但通过评估的任何测量结果均未显示对处理的杂合小鼠的任何有害影响。

以上内容是对本发明的说明，而不应被解释为对其进行限制。

权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但是本公开支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。

本发明由以下权利要求以及其中包含的权利要求的等同体限定。

序列表

<110>北卡罗来纳大学教堂山分校

s·格雷

<120>优化的cln1基因和表达盒以及它们的应用

<130>5470-788cn

<150>pct/us2017/037118

<151>2017-06-13

<150>us62/349,411

<151>2016-06-13

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>924

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(924)

<223>人密码子优化的cln1开放阅读框

<400>1

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<210>2

<211>306

<212>dna

<213>鸡β-肌动蛋白启动子(chickenbeta-actinpromoter)

<400>2

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cgggcg306

<210>3

<211>137

<212>dna

<213>鸡β-肌动蛋白外显子1和内含子1(chickenbeta-actinexon1andintron1)

<400>3

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tccgggctgtaattagc137

<210>4

<211>256

<212>dna

<213>巨细胞病毒增强子(cytomegalovirusenhancer)

<400>4

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gtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggta120

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<210>5

<211>92

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>intron

<222>(1)..(92)

<223>杂合/修饰的mvm内含子

<400>5

aagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggag60

cacctgcctgaaatcactttttttcaggttgg92

<210>6

<211>254

<212>dna

<213>牛生长激素多腺苷酸化位点(bovinegrowthhormonepolyadenylationsignal)

<400>6

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<210>7

<211>2302

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>intron

<222>(825)..(916)

<223>cln1表达盒

<400>7

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