用于制备寡聚物的方法与流程

本申请要求2017年5月18日提交的美国临时专利申请no.62/508,256；2016年5月24日提交的美国临时专利申请no.62/341,049；2016年6月30日提交的美国临时专利申请no.62/356,923；2016年6月30日提交的美国临时专利申请no.62/357,072；2016年6月30日提交的美国临时专利申请no.62/357,153；和2016年6月30日提交的美国临时专利申请no.62/357,166的权益；这些美国临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。技术背景反义技术提供了用于调节一种或多种特定基因产物(包括选择性剪接产物)的表达的手段，并且在许多治疗、诊断和研究应用中特别有用。反义技术背后的原理是与靶核酸杂交的反义化合物，例如寡核苷酸，通过许多反义机制中的任一种调节基因表达活动，诸如转录、剪接或翻译。反义化合物的序列特异性使得它们成为有吸引力的用于靶标验证和基因功能化的工具以及用于选择性调节疾病所涉及的基因的表达的治疗剂。杜兴氏肌肉营养不良症(dmd)由蛋白质肌营养不良蛋白表达的缺陷所引起。编码该蛋白质的基因含有79个外显子，这些外显子分布在超过200万个dna核苷酸上。改变外显子的阅读框架，或引入终止密码子，或以删除一个或多个完整框外外显子或复制一个或多个外显子为特征的任何外显子突变都有可能破坏功能性肌营养不良蛋白的产生，从而导致dmd。近来测试剪接转换寡核苷酸(sso)在治疗dmd中的安全性和有效性的临床试验基于sso技术，通过剪接体的空间阻断来诱导前体mrna的选择性剪接(cirak等人，2011；goemans等人，2011；kinali等人，2009；vandeutekom等人，2007)。然而，尽管取得了这些成功，但可用于治疗dmd的药理学选择是有限的。eteplirsen是一种磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)，其设计用于跳过适合进行外显子51跳跃的dmd患者中的人肌营养不良蛋白基因的外显子51，以恢复阅读框并产生功能性较短形式的肌营养不良蛋白。sareptatherapeutics，inc.向美国食品和药品管理局(fda)提交了新药申请(nda)，以寻求批准用于治疗适合进行外显子51跳跃的患者的dmd。sarepta的nda目前正由fda审查中。尽管在反义
技术领域：
已经取得了重大进展，但本领域仍需要制备具有改善的反义或抗原性能的磷酰二胺吗啉代寡聚物的方法。技术实现要素：本文提供了用于制备磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)的方法。本文所述的合成方法实现pmo合成的规模扩大，同时保持合成的pmo的总收率和纯度。在一个方面，本公开提供了一种方法，所述方法用于制备式(b)的寡聚化合物：或其药学上可接受的盐，其中t、x、r2和n如本文所定义。在一些实施方案中，本公开提供了一种方法，所述方法用于制备式(a)的寡聚化合物：或其药学上可接受的盐，其中r2和n如本文所定义。在某些实施方案中，本文提供了一种方法，所述方法用于制备式(e)的寡聚化合物：或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本公开的寡聚化合物，包括例如式(e)的寡聚化合物的一些实施方案，是式(xii)的寡聚化合物：或其药学上可接受的盐。为清楚起见，包括例如式(e)的寡聚化合物和式(xii)所示的eteplirsen的结构式是5’至3’的连续结构式，并且为了方便在上述结构式中以紧凑形式示出整个式子，申请人已纳入标记为“断线a”、“断线b”、“断线c”和“断线d”的各种图解断线(break)。如技术人员将理解的，例如每次指示的“断线a”示出了在这些点处结构式的图解的继续。技术人员应理解，对于上述结构式(包括eteplirsen)中的“断线b”、“断线c”和“断线d”的每个实例，情况也是如此。然而，这些图解断线不旨在指示，且技术人员也不认为它们意味着上述结构式(包括eteplirsen)的实际中断。在本公开的另一个方面，提供了一种方法，所述方法用于制备式(d)的寡聚化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r4-r7、x和n如本文所定义。在一些实施方案中，式(d)的寡聚化合物为式(g)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r2、x和n如本文所定义。在本公开的另一个方面，提供了一种方法，所述方法用于制备式(f)的寡聚化合物：其中：各a在每次出现时独立地选自由以下组成的组：各r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：n是10至40的整数；并且r是h或乙酰基。附图说明图1示出了合成和去保护的eteplirsen(avi-4658)原料药物的代表性分析型高效液相色谱法(hplc)色谱图(参见实施例4)。图2示出了纯化的eteplirsen药物溶液的代表性分析型hplc色谱图(参见实施例5)。图3示出了脱盐和冻干的eteplirsen药物的代表性分析型hplc色谱图(参见实施例5)。具体实施方式本文提供了用于制备吗啉代寡聚物的方法。相对于天然或未修饰的寡核苷酸，本文所述的吗啉代寡聚物对dna和rna显示出更强的亲和力而不损害序列选择性。在一些实施方案中，本公开的吗啉代寡聚物最小化或防止rna酶h的裂解。在一些实施方案中，本公开的吗啉代寡聚物不活化rna酶h。本文所述的方法在工业规模级工艺中是有利的，并且可以应用于以高收率和规模制备一定量的吗啉代寡聚物(例如，约1kg、约1-10kg、约2-10kg、约5-20kg、约10-20kg或约10-50kg)。定义下面列出的是用于描述本公开的各种术语的定义。这些定义适用于在整个说明书和权利要求书中使用的术语，无论是单独的还是作为较大组的一部分，除非在具体情况下另有限制。“碱基保护的”或“碱基保护”是指在吗啉代亚基上用保护基团保护碱基配对基团，例如嘌呤或嘧啶碱基，所述保护基团适于在逐步寡聚物合成期间防止碱基配对基团发生反应或干扰。碱基保护的吗啉代亚基的实例是下文描述的在胞嘧啶氨基上具有cbz保护基团的活化c亚基化合物(c)。“活化的磷酰胺基团”通常是氯磷酰胺基团，其在氮处具有取代，该取代在寡聚物的最终磷酰二胺键中是所需的。一个实例是(二甲基氨基)氯磷酰胺，即-o-p(＝o)(nme2)cl。术语“载体结合”是指与载体介质共价连接的化学实体。术语“载体介质”是指寡聚物可以在其上附接或合成，或者可以被改性以便于寡聚物附接或合成的任何物质，包括例如任何颗粒、珠子或表面。代表性基材包括但不限于无机载体和有机载体，诸如玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸类树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其他物质的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、teflon等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的物质(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光纤束和各种其他聚合物。对于一些实施方案特别有用的载体介质和固体表面位于流动池装置内。在本文所述方法的一些实施方案中，载体介质包括具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。在一些实施方案中，代表性的载体介质至少包含一个用于寡聚物附接或合成的反应性位点。例如，在一些实施方案中，本公开的载体介质包含一个或多个末端氨基或羟基，这些基团能够与进入的亚基或其他活化基团形成化学键以便附接或合成寡聚物。适用于本文所述方法的一些代表性载体介质包括但不限于以下：可控孔度玻璃(cpg)；草酰可控孔度玻璃(参见，例如alul等人，nucleicacidsresearch1991，19，1527)；含二氧化硅的颗粒，诸如多孔玻璃珠和硅胶，诸如通过三氯-[3-(4-氯甲基)苯基]丙基硅烷和多孔玻璃珠的反应形成的那些(参见parr和grohmann，angew.chem.internatl.编1972，11，314，由watersassociates，framingham，mass.，usa商标“porasile”出售)；1，4-二羟甲基苯和二氧化硅的单酯(参见bayer和jung，tetrahedronlett.1970，51，4503，由watersassociates以商标“biopak”出售)；tentagel(参见，例如wright等人，tetrahedronlett.1993，34，3373)；交联的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物珠状基质或poros，即聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物(购自perseptivebiosystems)；可溶性载体介质诸如聚乙二醇peg(参见bonora等人，organicprocessresearch&development2000，4，225-231)；peps载体，它是具有侧长链聚苯乙烯(ps)接枝物的聚乙烯(pe)膜(参见berg等人，j.am.chem.soc.1989，111，8024和国际专利申请wo1990/02749)；二甲基丙烯酰胺与n，n′-双丙烯酰基乙二胺交联的共聚物，包括已知量的n-叔丁氧基羰基-β-丙氨酰基-n′-丙烯酰基六亚甲基二胺(参见atherton等人，j.am.chem.soc.1975，97，6584；atherton等人，bioorg.chem.1979，8，351和atherton等人，j.chem.soc.perkini1981，538)；涂覆有疏水性交联苯乙烯聚合物的玻璃颗粒(参见scott等人，j.chrom.sci.1971，9，577)；已接枝聚苯乙烯的氟化乙烯聚合物(参见kent和merrifield，israelj.chem.1978，17，243和vanrietschoten，peptides1974，y.wolman，编，wileyandsons，newyork，1975，第113-116页)；羟丙基丙烯酸酯涂覆的聚丙烯膜(daniels等人，tetrahedronlett.1989，4345)；丙烯酸接枝聚乙烯棒(geysen等人，proc.natl.acad.sci.usa1984，81，3998)；包含传统使用的聚合物珠的“茶包”(houghten，proc.natl.acad.sci.usa1985，82，5131)；以及它们的组合。术语“流动池装置”是指包括表面(例如固体表面)的腔室，一种或多种流体试剂(例如液体或气体)可以流过该表面。术语“去封闭剂”是指用于除去保护基团的包含化学酸或化学酸组合的组合物(例如溶液)。用于去封闭剂的示例性化学酸包括卤代酸，例如氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在一些实施方案中，去封闭剂从例如寡聚物、载体结合的寡聚物、载体结合的亚基或其他受保护的氮或氧部分除去一个或多个三苯甲基。术语“卤素”和“卤基”是指选自由以下组成的组的原子：氟、氯、溴和碘。术语“封端剂”是指包含酸酐(例如苯甲酸酐、乙酸酐、苯氧基乙酸酐等)的组合物(例如溶液)，其可用于阻断例如载体介质的反应性位点与进入的亚基或其他活化基团形成化学键。术语“裂解剂”是指包含化学碱(例如氨或1，8-二氮杂双环十一碳-7-烯)或化学碱组合的组合物(例如液体溶液或气体混合物)，其可用于将例如载体结合寡聚物从载体介质裂解。术语“去保护剂”是指可用于除去保护基团的包含化学碱(例如氨、1，8-二氮杂双环十一碳-7-烯或碳酸钾)或化学碱组合的组合物(例如液体溶液或气体混合物)。例如，在一些实施方案中，去保护剂可以从例如吗啉代寡聚物的一个或多个吗啉代亚基或其载体结合形式中除去碱保护。术语“溶剂”是指其中溶解有溶质的溶液或混合物的组分。溶剂可以是无机或有机的(例如乙酸、丙酮、乙腈、乙酰丙酮、2-氨基乙醇、苯胺、苯甲醚、苯、苯甲腈、苯甲醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2-丁酮、叔丁醇、二硫化碳、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、环己醇、环己酮、邻苯二甲酸二正丁酯、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、二乙胺、二甘醇、二甘醇二甲醚、二甲氧基乙烷(甘醇二甲醚)、n，n-二甲基苯胺、二甲基甲酰胺、邻苯二甲酸二甲酯、二甲基亚砜、二恶烷、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、1-庚醇、己烷、1-己醇、甲醇、乙酸甲酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1-辛醇、戊烷、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、四氢呋喃、甲苯、水、对二甲苯)。短语“吗啉代寡聚物”和“磷酰二胺吗啉代寡聚物”或“pmo”是指这样的寡聚物：所具有的吗啉代亚基通过磷酰二胺键连接在一起，使一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5′-环外碳连接。每个吗啉代亚基包含核碱基配对部分，该部分有效通过核碱基特异性氢键合与靶标中的核碱基结合。术语“eg3尾”是指缀合至寡聚物的例如3′末端或5′末端的三甘醇部分。例如，在一些实施方案中，缀合至寡聚物的3′末端的“eg3尾”可具有以下结构：在某些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度可为10至50个核苷酸、10至40个核苷酸、10至30个核苷酸、10至25个核苷酸、10至24个核苷酸、10至23个核苷酸、10至22个核苷酸、10至21个核苷酸、10至20个核苷酸、15至30个核苷酸、15至25个核苷酸、15至24个核苷酸、15至23个核苷酸、15至22个核苷酸、15至21个核苷酸、15至20个核苷酸、20至30个核苷酸、20至25个核苷酸、20至24个核苷酸、20至23个核苷酸或20至22个核苷酸，包括这些范围之间的所有整数。优选地，通过本公开的方法制备的寡聚化合物是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为25个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为26个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为27个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为28个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为29个核苷酸。在一些实施方案中，通过本公开的方法制备的寡聚化合物的长度为30个核苷酸。因此，在通过本公开的方法制备的寡聚化合物的一些实施方案，包括例如式(a)、(b)、(d)、(g)、(f)和(s)的寡聚化合物的实施方案中，n为范围为10至50、10至40、10至30、10至25、10至24、10至23、10至22、10至21、10至20、15至30、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、20至30、20至25、20至24、20至23或20至22的整数。在某些实施例中，n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，n为10。在一些实施方案中，n为11。在一些实施方案中，n为12。在一些实施方案中，n为15。在一些实施方案中，n为18。在一些实施方案中，n为20。在一些实施方案中，n为21。在一些实施方案中，n为22。在一些实施方案中，n为23。在一些实施方案中，n为24。在一些实施方案中，n为25。在一些实施方案中，n为26。在一些实施方案中，n为27。在一些实施方案中，n为28。在一些实施方案中，n为29。在一些实施方案中，n为30。术语“约”或“大约”通常为相关主题领域中知识渊博的人所理解，但在某些情况下可表示给定值或范围的±10％或±5％内。用于制备吗啉代寡聚物的方法通常如本文所述在载体介质上准备合成。通常，首先将第一合成子(例如单体，诸如吗啉代亚基)附接至载体介质，然后通过将亚基顺序偶联至载体结合的合成子来合成寡聚物。此重复延伸最后产生最终的寡聚化合物。合适的载体介质可以是可溶的或不溶的，或者可以在不同的溶剂中具有可变的溶解度，以使生长的载体结合的聚合物根据需要处于溶液中或溶液外。传统的载体介质大部分是不溶的，且常规地置于反应容器中，同时试剂和溶剂与生长链反应和/或洗涤生长链，直至寡聚物达到目标长度，之后寡聚物从载体裂解，并且如果需要的话进行进一步后处理以产生最终的聚合化合物。最近的方法引入了可溶性载体，包括可溶性聚合物载体，以允许在合成中的所需点沉淀和溶解重复合成的产物(gravert等人，chem.rev.1997，97，489-510)。本文提供了用于制备吗啉代寡聚物的方法)。因此，在一个方面，本文提供了一种用于制备式(ii)的化合物的方法：其中r1是载体介质；其中所述方法包括使式(a1)的化合物：其中r1是载体介质，并且r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；与去封闭剂接触，以形成式(ii)的化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(a3)的化合物的方法：其中r1是载体介质，并且r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；其中所述方法包括使式(ii)的化合物：其中r1是载体介质；与式(a2)的化合物：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；接触，以形成式(a3)的化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(iv)的化合物的方法：其中r1是载体介质；其中所述方法包括使式(a3)的化合物：其中r1是载体介质，并且r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；与去封闭剂接触，以形成式(iv)的化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(a5)的化合物的方法：其中r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：其中所述方法包括使式(iv)的化合物：其中r1是载体介质；与式(a4)的化合物：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：接触，以形成式(a5)的化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(a9)的化合物的方法：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中所述方法包括以下顺序步骤：(a)使式(iv)的化合物：其中r1是载体介质；与式(a4)的化合物：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：接触，以形成式(a5)的化合物：其中r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：以及(b)执行以下顺序步骤的n-1次重复：(b1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；以及(b2)使前一步骤形成的化合物与式(a8)的化合物接触：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：以形成式(a9)的化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(a10)的化合物的方法：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：其中所述方法包括使式(a9)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且与去封闭剂接触，以形成式(a10)的化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(a11)的化合物的方法：其中n是10至40的整数，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中所述方法包括使式(a10)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：与裂解剂接触，以形成式(a11)的化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(a)的寡聚化合物的方法：其中n是10至40的整数，并且各r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：其中所述方法包括使式(a11)的化合物：其中n是10至40的整数，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：与去保护剂接触，以形成式(a)的寡聚化合物。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(a)的寡聚化合物的方法：其中n是10至40的整数，并且各r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：其中所述方法包括以下顺序步骤：(a)使式(a1)的化合物：其中r1是载体介质，并且r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；与去封闭剂接触，以形成式(ii)的化合物：其中r1是载体介质；(b)使式(ii)的化合物与式(a2)的化合物：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；接触，以形成式(a3)的化合物：其中r1是载体介质，并且r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；(c)使式(a3)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(iv)的化合物：其中r1是载体介质；(d)使式(iv)的化合物与式(a4)的化合物：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：接触，以形成式(a5)的化合物：其中r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：(e)执行以下顺序步骤的n-1次重复：(e1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；以及(e2)使前一步骤形成的化合物与式(a8)的化合物接触：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4对于式(a8)的每种化合物独立地选自由以下组成的组：以形成式(a9)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：(f)使式(a9)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(a10)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：(g)使式(a10)的化合物与裂解剂接触，以形成式(a11)的化合物：其中n是10至40的整数，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：以及(h)使式(a11)的化合物与去保护剂接触，以形成式(a)的寡聚化合物。在一个实施方案中，步骤(d)或步骤(e2)还包括分别使式(iv)的化合物或前一步骤形成的化合物与封端剂接触。在另一个实施方案中，每个步骤均在至少一种溶剂存在下进行。在另一个实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是包含卤代酸的溶液。在另一个实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是氰基乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸选自由以下组成的组：氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸是三氟乙酸。在另一个实施方案中，步骤(a)、(c)、(e1)和(f)中的至少一个还包括使每个步骤中的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在另一个实施方案中，步骤(a)、(c)、(e1)和(f)中的每个还包括使每个步骤中的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在另一个实施方案中，中和剂处于包含二氯甲烷和异丙醇的溶液中。在另一个实施方案中，中和剂是单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。在另一个实施方案中，中和剂是n，n-二异丙基乙胺。在另一个实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是包含4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇和水的溶液。在另一个实施方案中，封端剂处于包含乙基吗啉和甲基吡咯烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，封端剂是酸酐。在另一个实施方案中，酸酐是苯甲酸酐。在另一个实施方案中，式(a4)的化合物和式(a8)的化合物各自独立地处于包含乙基吗啉和二甲基咪唑烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，裂解剂包含二硫苏糖醇和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在另一个实施方案中，裂解剂处于包含n-甲基-2-吡咯烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，去保护剂包含nh3。在另一个实施方案中，去保护剂处于水溶液中。在另一个实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。在另一个实施方案中，式(a4)的化合物具有式(a4a)：其中：r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自：在另一个实施方案中，式(a5)的化合物具有式(a5a)：其中：r1是载体介质r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自：在另一个实施方案中，式(a8)的化合物具有式(a8a)：其中：r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在式(a8a)的化合物每次出现时独立地选自由以下组成的组：在另一个实施方案中，式(a9)的化合物具有式(a9a)：其中：n是10至40的整数，r1是载体介质r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在另一个实施方案中，式(a10)的化合物具有式(a10a)：其中：n是10至40的整数，r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在另一个实施方案中，式(a11)的化合物具有式(a11a)：其中：n是10至40的整数，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在式(a)的寡聚化合物的一个实施方案中，n为30，并且r2在1至30和5’至3’的各位置为：其中式(a)的寡聚化合物是式(e)的化合物：或其药学上可接受的盐。eteplirsen(参见，例如国际专利申请公布no.wo2006/000057，其以引用的方式整体并入本文)已成为临床研究的主题以测试其安全性和功效，并且处于临床开发中。eteplirsen是磷酰二胺吗啉代寡聚物(pmo)。肌营养不良蛋白治疗剂“eteplirsen”，也称为“avi-4658”，是具有碱基序列5’-ctccaacatcaaggaagatggcatttctag-3’(seqidno：1)的pmo。eteplirsen注册在cas登记号1173755-55-9下。化学名称包括：rna，[p-脱氧-p-(二甲基氨基)](2’，3’-二脱氧-2’，3’-亚氨基-2’，3’-断)(2’a→5’)(c-m5u-c-c-a-a-c-a-m5u-c-a-a-g-g-a-a-g-a-m5u-g-g-c-a-m5u-m5u-m5u-c-m5u-a-g)(seqidno：2)，5’-[p-[4-[[2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基]羰基]-1-哌嗪基]-n，n-二甲基膦酰胺]和p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-5′-o-{p-[4-(10-羟基-2，5，8-三氧杂癸酰基)哌嗪-1-基]-n，n-二甲基膦酰胺基}-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胞苷酰基-(2′a→5′)-p，3′-二脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胸苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胞苷酰基-(2′a→5′)-p，，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胞苷酰基-(2′a→5′)-p，，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胞苷酰基-(2′a→5′)-p，，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，3′-二脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胸苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胞苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断鸟苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断鸟苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断鸟苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，3′-二脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胸苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断鸟苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断鸟苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胞苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-p，3′-二脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胸苷酰基-(2′a→5′)-p，3′-二脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胸苷酰基-(2′a→5′)-p，3′-二脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胸苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胞苷酰基-(2′a→5′)-p，3′-二脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断胸苷酰基-(2′a→5′)-p，2′，3′-三脱氧-p-(二甲基氨基)-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断腺苷酰基-(2′a→5′)-2′，3′-二脱氧-2′，3′-亚氨基-2′，3′-断鸟苷。eteplirsen具有以下结构：eteplirsen也可以通过式(xii)的结构来示出：因此，在上述方法的一个实施方案中，式(a)的寡聚化合物是式(e)的化合物：或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，式(e)的寡聚化合物是式(xii)的寡聚化合物：或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，r3在每次出现时是三苯甲基。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(s)的寡聚化合物的方法：其中n是10至40的整数，并且各r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：其中所述方法包括以下顺序步骤：(a)使式(ii)的化合物：其中r1是载体介质；与式(s2)的化合物：其中r4选自由以下组成的组：并且其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；接触，以形成式(s3)的化合物：其中r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：(b)使式(s3)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(iv-s)的化合物：其中r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：(c)使式(iv-s)的化合物与式(a4)的化合物：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：接触，以形成式(s5)的化合物：其中r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：(d)执行以下顺序步骤的n-2次重复：(d1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；以及(d2)使前一步骤形成的化合物与式(a8)的化合物接触：其中r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4对于式(a8)的每种化合物独立地选自由以下组成的组：以形成式(s9)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：(e)使式(s9)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(s10)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：(f)使式(s10)的化合物与裂解剂接触，以形成式(s11)的化合物：其中n是10至40的整数，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：以及(g)使式(s11)的化合物与去保护剂接触，以形成式(s)的寡聚化合物。用于制备eteplirsen的方法本文提供了用于制备eteplirsen的方法。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(e)的寡聚化合物的方法：其中所述方法包括以下顺序步骤：(a)使式(i)的化合物：其中r1是载体介质，与去封闭剂接触，以形成式(ii)的化合物：其中r1是载体介质；(b)使式(ii)的化合物与化合物(b)：接触，以形成式(iii)的化合物：其中r1是载体介质；(c)使式(iii)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(iv)的化合物：其中r1是载体介质；(d)使式(iv)的化合物与式(c)的化合物：接触，以形成式(v)的化合物：其中r1是载体介质；(e)使式(v)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(vi)的化合物：其中r1是载体介质；(f)使式(vi)的化合物与式(f)的化合物：接触，以形成式(vii)的化合物：其中r1是载体介质；(g)执行以下顺序步骤的28次重复：(g1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；以及(g2)使前一步骤形成的化合物与式(viii)的化合物接触：其中r2对于式(viii)的每种化合物，独立地选自由以下组成的组：其中，对于从1至28的每次重复，r2是：重复编号r2重复编号r2重复编号r21pc11dpg21pa2pc12dpg22t3pa13pa23t4pa14pa24t5pc15dpg25pc6pa16pa26t7t17t27pa8pc18dpg28dpg9pa19dpg10pa20pc以形成式(ix)的化合物：其中r1是载体介质，其中r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：(h)使式(ix)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(x)的化合物：其中r1是载体介质，其中r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：(i)使式(x)的化合物与裂解剂接触，以形成式(xi)的化合物：其中r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：以及(j)使式(xi)的化合物与去保护剂接触，以形成式(e)的寡聚化合物。在一个实施方案中，步骤(d)、步骤(f)、步骤g(2)或它们的组合还包括分别使式(iv)的化合物、式(vi)的化合物或前一步骤所形成的化合物与封端剂接触。在某些实施方案中，步骤(d)、步骤(f)和步骤g(2)中的每个步骤还包括分别使式(iv)的化合物、式(vi)的化合物或前一步骤所形成的化合物与封端剂接触。在另一个实施方案中，每个步骤均在至少一种溶剂存在下进行。在另一个实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是包含卤代酸的溶液。在另一个实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是氰基乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸选自由以下组成的组：氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在另一个实施方案中，卤代酸是三氟乙酸。在另一个实施方案中，步骤(c)、(e1)和(f)中的至少一个还包括使每个步骤中的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在另一个实施方案中，步骤(c)、(e1)和(f)中的每个还包括使每个步骤中的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在另一个实施方案中，中和剂处于包含二氯甲烷和异丙醇的溶液中。在另一个实施方案中，中和剂是单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。在另一个实施方案中，中和剂是n，n-二异丙基乙胺。在另一个实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是包含4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇和水的溶液。在另一个实施方案中，封端剂处于包含乙基吗啉和甲基吡咯烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，封端剂是酸酐。在另一个实施方案中，酸酐是苯甲酸酐。在另一个实施方案中，式(viii)的化合物、化合物(c)和化合物(f)各自独立地处于包含乙基吗啉和二甲基咪唑烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，裂解剂包含二硫苏糖醇和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在另一个实施方案中，裂解剂处于包含n-甲基-2-吡咯烷酮的溶液中。在另一个实施方案中，去保护剂包含nh3。在另一个实施方案中，去保护剂处于水溶液中。在另一个实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。在另一个实施方案中，式(c)的化合物具有式(c1)：在另一个实施方案中，式(v)的化合物具有式(va)：其中r1是载体介质。在另一个实施方案中，式(f)的化合物具有式(f1)：在另一个实施方案中，式(vii)的化合物具有式(viia)：其中r1是载体介质。在另一个实施方案中，式(viii)的化合物具有式(viiia)：其中r2对于式(viiia)的每种化合物，独立地选自由以下组成的组：在另一个实施方案中，式(ix)的化合物为式(ixa)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在另一个实施方案中，式(x)的化合物为式(xa)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在另一个实施方案中，式(xi)的化合物为式(xia)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在另一个实施方案中，式(vi)的化合物具有式(via)：其中r1是载体介质。在另一个实施方案中，式(e)的寡聚化合物是式(xii)的寡聚化合物：在另一个方面，本文提供了一种式(ix)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在一个实施方案中，式(ix)的化合物为式(ixa)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在另一个方面，本文提供了一种式(a9)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数；r1是载体介质；r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在一个实施方案中，式(a9)的化合物为式(a9a)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数；r1是载体介质；r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在另一个方面，本文提供了一种式(x)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在一个实施方案中，式(x)的化合物为式(xa)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中r1是载体介质，并且r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在另一个方面，本文提供了一种式(a10)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数；r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在一个实施方案中，式(a10)的化合物为式(a10a)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数；r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在这些化合物的另一个实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。另一个方面，本文提供了一种式(xi)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在一个实施方案中，式(xi)的化合物为式(xia)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且其中r2在1至30和5’至3’的各位置为：在另一个方面，本文提供了一种式(a11)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数；r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：在一个实施方案中，式(a11)的化合物为式(a11a)的化合物：或其药学上可接受的盐，其中：n是10至40的整数；r1是载体介质，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：寡聚物通过本公开的方法制备的寡聚物可含有多种核苷酸类似物亚基。在本公开的另一个方面，提供了一种方法，所述方法用于制备式(d)的寡聚化合物：或其药学上可接受的盐，其中：r1选自-o(c1-c6烷基)、卤基、-o(c1-c6烷基)-o(c1-c6烷基)和-o(c1-c6烷基)-c(o)-nh-c1-c6烷基；r2是h，或r1和r2连接形成任选含有氧的具有4至7个环原子的环烷基或杂环；r5、r6和r7各自为氢，或r5和r7连接形成具有4至7个环原子的环烷基环，并且r6和r7连接形成具有3至4个环原子的环烷基环；r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：r8在每次出现时独立地选自由以下组成的组：h、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；n是10至40；并且x是o或s。在一些实施方案中，式(d)的寡聚化合物具有式(g)：其中r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且n是10至40。式d的化合物和式g的化合物的实施方案包括例如：1.锁核酸(lna)修饰的反义寡聚物化合物还可含有“锁核酸”亚基(lna)。“lna”是称为桥接核酸(bna)的修饰类别的成员。bna的特征在于将核糖环的构象锁定在c30-内切(northern)糖褶中的共价键。对于lna，桥由2′-o和4′-c位置之间的亚甲基组成。lna增强骨架预组织和碱基堆积以增加杂交和热稳定性。lna的结构可以参见例如singh等人，chem.commun.1998，455；wengel，tetrahedron1998，54，3607；wengel，acc.chem.res.1999，32，301；obika等人，tetrahedronlett.1997，38，8735；obika等人，tetrahedronlett.1998，39，5401；和obika等人，bioorg.med.chem.2008，16，9230，这些文献据此以引用方式整体并入。包含lna亚基和磷酸二酯核苷间键的lna寡聚物的非限制性实例示出如下：本公开的化合物可以结合一个或多个lna；在某些情况下，化合物可以完全由lna组成。用于合成个体lna核苷亚基并将其结合到寡聚物中的方法描述于例如美国专利no.7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499和6,670,461中，这些专利据此以引用方式整体并入。典型的核苷间接头包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；另选地，可以采用不含磷的接头。另外的实施方案包括含lna的化合物，其中每个lna亚基被dna亚基分开。某些化合物由交替的lna和dna亚基组成，其中核苷间接头是硫代磷酸酯。2′o，4′c-乙烯-桥接核酸(ena)是bna类的另一成员。ena亚基和磷酸二酯核苷间键的非限制性实例描述如下：ena寡聚物及其制备描述于obika等人，tetrahedronlett.1997，38，8735，其据此以引用方式整体并入。本公开的化合物可以结合一个或多个ena亚基。2.硫代磷酸酯“硫代磷酸酯”(或s-寡聚物)是天然dna或rna的变体，其中磷酸二酯核苷间键的非桥接氧之一被硫替代。包含脱氧核糖亚基和硫代磷酸酯核苷间键的硫代磷酸酯dna(左)以及包含核糖亚基和硫代磷酸酯核苷间键的硫代磷酸酯rna(右)的非限制性实例示出如下：核苷间键的硫化降低了内切核酸酶和外切核酸酶，包括5’至3’和3’至5’dnapol1外切核酸酶、核酸酶s1和p1、rna酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶的作用。硫代磷酸酯可通过两种主要途径来制备：借助元素硫的二硫化碳溶液对氢膦酸酯的作用，或借助用二硫化四乙基秋兰姆(tetd)或3h-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物(bdtd)硫化亚磷酸三酯的方法(参见，例如iyer等人，j.org.chem.1990，55，4693-4699，其据此以引用方式整体并入)。后一种方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中不可溶以及二硫化碳的毒性问题。tetd和bdtd方法还产生更高纯度的硫代磷酸酯。3.三环-dna和三环-硫代磷酸酯核苷酸三环-dna(tc-dna)是一类受约束的dna类似物，其中通过引入环丙烷环来修饰每个核苷酸以限制骨架的构象灵活性并优化扭转角γ的骨架几何形状。含同碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶的tc-dna与互补rna形成非常稳定的a-t碱基对。三环-dna及其合成描述于pct公布no.wo2010/115993中，该文献据此以引用方式整体并入。本公开的化合物可以结合一个或多个三环-dna亚基；在一些情况下，化合物可以完全由三环-dna亚基组成。三环-硫代磷酸酯核苷酸是具有硫代磷酸酯核苷间键的三环-dna亚基。三环-硫代磷酸酯核苷酸及其合成描述于pct公布no.wo2013/053928中，该文献据此以引用方式整体并入。本公开的化合物可以结合一个或多个三环-dna亚基；在一些情况下，化合物可以完全由三环-dna核苷酸组成。三环-dna/三环亚基和磷酸二酯核苷间键的非限制性实例示出如下：4.2’o-甲基寡聚物、2’o-moe寡聚物和2’-f寡聚物“2’o-me寡聚物”分子包含在核糖分子的2’-oh残基处携带甲基的亚基。2’-o-me-rna显示出与dna相同(或相似)的行为，但受保护免受核酸酶降解。2’-o-me-rna也可以与硫代磷酸酯寡聚物(pto)组合以进一步稳定化。可以根据本领域的常规技术合成2’o-me寡聚物(其中2’-ome亚基通过磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷间键连接)(参见，例如yoo等人，nucleicacidsres.2004，32，2008-16，其据此以引用方式整体并入)。包含2’-ome亚基和磷酸二酯亚基间键的2’o-me寡聚物的非限制性实例示出如下：2’o-me寡聚物还可包含硫代磷酸酯键(2’o-me磷酸酯寡聚物)。2’o-甲氧基乙基寡聚物(2’-omoe)，如2’o-me寡聚物，包含在核糖分子的2’-oh残基处携带甲氧基乙基的亚基，并在martin等人，helv.chim.acta1995，78，486-504中有所论述，该文献据此以引用方式整体并入。2’o-moe亚基的非限制性实例示出如下：与前述烷基化的2’oh核糖衍生物相比，2’-氟寡聚物包含在2’位置处有氟基团替代2’oh的亚基。包含2’-f亚基和磷酸二酯核苷间键的2’-f寡聚物的非限制性实例示出如下：2’-氟寡聚物进一步描述于wo2004/043977，其据此以引用方式整体并入。本发明的化合物可以结合一个或多个2’o-甲基、2’o-moe和2’-f亚基，并且可以利用本文所述的任何核苷间键。在一些情况下，本公开的化合物可以完全由2’o-甲基、2’o-moe或2’-f亚基组成。本公开化合物的一个实施方案完全由2’o-甲基亚基组成。5.2′-o-[2-(n-甲基氨基甲酰基)乙基]寡聚物(mce)mce是可用于本公开化合物的2’o修饰的核糖核苷酸的另一个实例。此处，2’oh衍生为2-(n-甲基氨基甲酰基)乙基部分以增加核酸酶抗性。包含mce亚基和磷酸二酯核苷间键的mce寡聚物的非限制性实例示出如下：mce及其合成描述于yamada等人，j.org.chem.2011，76(9)，3042-53，其据此以引用方式整体并入。本公开的化合物可以结合一个或多个mce亚基。在另一个方面，本文提供了一种用于制备式(f)的寡聚化合物的方法：其中：各a在每次出现时独立地选自由以下组成的组：其中各r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：n是10至40的整数，并且r是h或乙酰基，其中所述方法包括以下顺序步骤：(a)使式(ii)的化合物：其中r1是载体介质，与式(f2)的化合物：其中a选自由以下组成的组：其中r4选自由以下组成的组：并且r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且pg是保护基团；接触，以形成式(f3)的化合物：其中r1是载体介质，a选自由以下组成的组：其中r4选自由以下组成的组：r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且pg是保护基团；(b)使式(f3)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(iv-f)的化合物：其中r1是载体介质，a选自由以下组成的组：其中r4选自由以下组成的组：并且pg是保护基团；(c)使式(iv-f)的化合物与式(f4)的化合物：其中r5是-och2ch2cn或-ch2c(＝o)oc(ch3)2ch2cn，a选自由以下组成的组：其中r4选自由以下组成的组：r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且pg是保护基团，接触，以形成式(f5)的化合物：其中r1是载体介质，各a在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且各r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，x是o或s，并且r5是-och2ch2cn或-ch2c(＝o)oc(ch3)2ch2cn，其中当x为s时，则步骤(d)还包括硫化步骤，或当x为o时，则步骤(d)还包括氧化步骤；(e)执行以下顺序步骤的n-2次重复：(e1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；以及(e2)使前一步骤形成的化合物与式(f8)的化合物接触：其中r5是-och2ch2cn或-ch2c(＝o)oc(ch3)2ch2cn，各a对于(f8)的每次重复，独立地选自由以下组成的组：其中r4对于(f8)的每次重复，独立地选自由以下组成的组：并且r3对于(f8)的每次重复，独立地选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且pg是保护基团，以形成式(f9)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，x是o或s，r5是-och2ch2cn或-ch2c(＝o)oc(ch3)2ch2cn，各a在每次出现时独立地选自由以下组成的组：r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：其中当x为s时，则每次重复还包括硫化步骤，或当x为o时，则每次重复还包括氧化步骤；以及(f)使式(f9)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(f10)的化合物：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，x是o或s，r5是-och2ch2cn或-ch2c(＝o)oc(ch3)2ch2cn，各a在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：(g)使式(f10)的化合物与裂解剂接触，以形成式(f11)的化合物：其中n是10至40的整数，x是o或s，r5是-och2ch2cn或-ch2c(＝o)oc(ch3)2ch2cn，各a在每次出现时独立地选自由以下组成的组：并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：以及(h)使式(f11)的化合物与去保护剂接触，以形成式(f)的寡聚化合物。本公开还提供了一种化合物，所述化合物选自：其中n是10至40的整数，r1是载体介质，x是o或s，r5是-och2ch2cn或-ch2c(＝o)oc(ch3)2ch2cn，各a在每次出现时独立地选自由以下组成的组：r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：吗啉代寡聚物基于吗啉代的亚基的重要特性包括：1)能够通过稳定的、不带电荷或带正电荷的骨架键以寡聚物形式连接；2)能够支持核苷酸碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、尿嘧啶、5-甲基-胞嘧啶和次黄嘌呤)，使得形成的聚合物可以与互补碱基靶核酸(包括靶rna)杂交；3)寡聚物能够被主动或被动地转运到哺乳动物细胞中；以及4)寡聚物和寡聚物：rna异源双链体能够分别抵抗rna酶和rna酶h降解。在一些实施方案中，反义寡聚物含有碱基修饰或取代。例如，可以选择某些核碱基以增加本文所述的反义寡聚物的结合亲和力。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃，并且可以结合到本文所述的反义寡聚物中。在一个实施方案中，寡聚物的至少一个嘧啶碱基包含5-取代的嘧啶碱基，其中嘧啶碱基选自由以下组成的组：胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。在一个实施方案中，5-取代的嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。在另一个实施方案中，寡聚物的至少一个嘌呤碱基包含次黄嘌呤。基于吗啉代的寡聚物(包括反义寡聚物)详细描述于例如美国专利no.5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,521,063、5,506,337、8,299,206和8,076,476；国际专利申请公布no.wo/2009/064471和wo/2012/043730；以及summerton等人，antisensenucleicaciddrugdev.1997，7，187-195，这些文献各自据此以引用方式整体并入。在一些实施方案中，本公开提供了一种方法，所述方法用于制备式(b)的寡聚化合物：其中n是10至40的整数，t选自x在每次出现时独立地选自h、oh、-och2ch2cn、n(r17)2、其中r17在每次出现时独立地为h或c1-6-烷基；r18选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、-c(＝nh)nh2、-c(o)(ch2)qnr20c(＝nh)nh2和-c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr20c(＝nh)nh2；q是1、2、3、4或5；r19在每次出现时独立地为h或甲基；r20是h或c1-6-烷基；r21选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、c(＝nh)nh2、c(o)(ch2)rnr23c(＝nh)nh2、c(o)ch(nh2)(ch2)3nhc(＝nh)nh2、c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr23c(＝nh)nh2和c(o)ch(nh2)(ch2)4nh2；r22是h或c1-6-烷基；r23是h或c1-6-烷基；并且r是1、2、3、4或5；各r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：其中所述方法包括以下顺序步骤：(a)使式(b1)的化合物：其中r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；r12是c1-6-烷基；r13是h或c1-6-烷基；并且r14是与载体介质结合的第一接头，r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；与去封闭剂接触，以形成式(ii-b)的化合物：其中r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；r12是c1-6-烷基；r13是h或c1-6-烷基；并且r14是与载体介质结合的第一接头；(b)使式(ii)的化合物与式(iii)的化合物：其中w选自o或c；t是1、2、3、4或5；r8选自：其中r4选自由以下组成的组：r3在每次出现时独立地选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；r9和r10独立地是c1-6-烷基，或r9和r10与它们所连接的原子一起形成包含4-10个碳原子的环或多环，以形成式(b3)的化合物：其中w选自o或c；t是1、2、3、4或5；r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；r12是c1-6-烷基；r13是h或c1-6-烷基；r14是与载体介质结合的第一接头；r8选自：其中r4选自由以下组成的组：并且r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基；(c)使式(a3)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(iv-b)的化合物：其中w选自o或c；t是1、2、3、4或5；r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；r12是c1-6-烷基；r13是h或c1-6-烷基；r14是与载体介质结合的第一接头；并且r8选自：其中r4选自由以下组成的组：(d)使式(iv-b)的化合物与式(b4)的化合物：其中x在每次出现时独立地选自h、oh、-och2ch2cn、n(r17)2、r17在每次出现时独立地为h或c1-6-烷基；r18选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、-c(＝nh)nh2、-c(o)(ch2)qnr20c(＝nh)nh2和-c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr20c(＝nh)nh2；q是1、2、3、4或5；r19在每次出现时独立地为h或甲基；r20是h或c1-6-烷基；r21选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、c(＝nh)nh2、c(o)(ch2)rnr23c(＝nh)nh2、c(o)ch(nh2)(ch2)3nhc(＝nh)nh2、c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr23c(＝nh)nh2和c(o)ch(nh2)(ch2)4nh2；r22是h或c1-6-烷基；r23是h或c1-6-烷基；并且r是1、2、3、4或5；r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4选自由以下组成的组：接触，以形成式(b5)的化合物：其中：w选自o或c；t是1、2、3、4或5；r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；r12是c1-6-烷基；r13是h或c1-6-烷基；r14是与载体介质结合的第一接头；x在每次出现时独立地选自h、oh、-och2ch2cn、n(r17)2、其中：r17在每次出现时独立地为h或c1-6-烷基；r18选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、-c(＝nh)nh2、-c(o)(ch2)qnr20c(＝nh)nh2和-c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr20c(＝nh)nh2；q是1、2、3、4或5；r19在每次出现时独立地为h或甲基；r20是h或c1-6-烷基；r21选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、c(＝nh)nh2、c(o)(ch2)rnr23c(＝nh)nh2、c(o)ch(nh2)(ch2)3nhc(＝nh)nh2、c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr23c(＝nh)nh2和c(o)ch(nh2)(ch2)4nh2；r22是h或c1-6-烷基；r23是h或c1-6-烷基；并且r是1、2、3、4或5；r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，r8选自：并且r4在每次出现时独立地选自：(e)执行以下顺序步骤的n-1次重复：(e1)使前一步骤形成的产物与去封闭剂接触；以及(e2)使前一步骤形成的化合物与式(b8)的化合物接触：其中：x选自h、oh、-och2ch2cn、n(r17)2、其中r17在每次出现时独立地为h或c1-6-烷基；r18选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、-c(＝nh)nh2、-c(o)(ch2)qnr20c(＝nh)nh2和-c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr20c(＝nh)nh2；q是1、2、3、4或5；r19在每次出现时独立地为h或甲基；r20是h或c1-6-烷基；r21选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、c(＝nh)nh2、c(o)(ch2)rnr23c(＝nh)nh2、c(o)ch(nh2)(ch2)3nhc(＝nh)nh2、c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr23c(＝nh)nh2和c(o)ch(nh2)(ch2)4nh2；r22是h或c1-6-烷基；r23是h或c1-6-烷基；r是1、2、3、4或5；r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，并且r4对于式(a8)的每种化合物，独立地选自由以下组成的组：以形成式(b9)的化合物：其中：w选自o或c；t是1、2、3、4或5；r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；r12是c1-6-烷基；r13是h或c1-6-烷基；r14是与载体介质结合的第一接头；n是10至40的整数，x在每次出现时独立地选自h、oh、-och2ch2cn、n(r17)2、其中：r17在每次出现时独立地为h或c1-6-烷基；r18选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、-c(＝nh)nh2、-c(o)(ch2)qnr20c(＝nh)nh2和-c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr20c(＝nh)nh2；q是1、2、3、4或5；r19在每次出现时独立地为h或甲基；r20是h或c1-6-烷基；r21选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、c(＝nh)nh2、c(o)(ch2)rnr23c(＝nh)nh2、c(o)ch(nh2)(ch2)3nhc(＝nh)nh2、c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr23c(＝nh)nh2和c(o)ch(nh2)(ch2)4nh2；r22是h或c1-6-烷基；r23是h或c1-6-烷基；并且r是1、2、3、4或5；r3选自由以下组成的组：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基，r8选自：并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：以及(f)使式(a9)的化合物与去封闭剂接触，以形成式(b10)的化合物：其中：w选自o或c；t是1、2、3、4或5；r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；r12是c1-6-烷基；r13是h或c1-6-烷基；r14是与载体介质结合的第一接头；n是10至40的整数，x在每次出现时独立地选自h、oh、-och2ch2cn、n(r17)2、其中：r17在每次出现时独立地为h或c1-6-烷基；r18选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、-c(＝nh)nh2、-c(o)(ch2)qnr20c(＝nh)nh2和-c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr20c(＝nh)nh2；q是1、2、3、4或5；r19在每次出现时独立地为h或甲基；r20是h或c1-6-烷基；r21选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、c(＝nh)nh2、c(o)(ch2)rnr23c(＝nh)nh2、c(o)ch(nh2)(ch2)3nhc(＝nh)nh2、c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr23c(＝nh)nh2和c(o)ch(nh2)(ch2)4nh2；r22是h或c1-6-烷基；r23是h或c1-6-烷基；并且r是1、2、3、4或5；r8选自：并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：(g)使式(b10)的化合物与裂解剂接触，以形成式(b11)的化合物：其中：w选自o或c；t是1、2、3、4或5；r11选自由以下组成的组：卤基、cn和no2；n是10至40的整数，x在每次出现时独立地选自h、oh、-och2ch2cn、n(r17)2、其中：r17在每次出现时独立地为h或c1-6-烷基；r18选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、-c(＝nh)nh2、-c(o)(ch2)qnr20c(＝nh)nh2和-c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr20c(＝nh)nh2；q是1、2、3、4或5；r19在每次出现时独立地为h或甲基；r20是h或c1-6-烷基；r21选自由以下组成的组：h、c1-6-烷基、c(＝nh)nh2、c(o)(ch2)rnr23c(＝nh)nh2、c(o)ch(nh2)(ch2)3nhc(＝nh)nh2、c(o)(ch2)2nhc(o)(ch2)5nr23c(＝nh)nh2和c(o)ch(nh2)(ch2)4nh2；r22是h或c1-6-烷基；r23是h或c1-6-烷基；并且r是1、2、3、4或5；r8选自：并且r4在每次出现时独立地选自由以下组成的组：以及(j)使式(b11)的化合物与去保护剂接触，以形成式(b)的寡聚化合物。在一些实施方案中，步骤(d)或步骤(e2)还包括分别使式(iv-b)的化合物或前一步骤形成的化合物与封端剂接触。在一些实施方案中，每个步骤均在至少一种溶剂存在下进行。在一些实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是包含卤代酸的溶液。在一些实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是氰基乙酸。在一些实施方案中，卤代酸选自由以下组成的组：氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸。在一些实施方案中，卤代酸是三氟乙酸。在一些实施方案中，步骤(a)、(c)、(e1)和(f)中的至少一个还包括使每个步骤中的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在一些实施方案中，步骤(a)、(c)、(e1)和(f)中的每个还包括使每个步骤中的去封闭的化合物与中和剂接触的步骤。在一些实施方案中，中和剂处于包含二氯甲烷和异丙醇的溶液中。在一些实施方案中，中和剂是单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。在一些实施方案中，中和剂是n，n-二异丙基乙胺。在一些实施方案中，在每个步骤中所使用的去封闭剂是包含4-氰基吡啶、二氯甲烷、三氟乙酸、三氟乙醇和水的溶液。在一些实施方案中，封端剂处于包含乙基吗啉和甲基吡咯烷酮的溶液中。在一些实施方案中，封端剂是酸酐。在一些实施方案中，酸酐是苯甲酸酐。在一些实施方案中，式(b4)的化合物和式(b8)的化合物各自独立地处于包含乙基吗啉和二甲基咪唑烷酮的溶液中。在一些实施方案中，裂解剂包含二硫苏糖醇和1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在一些实施方案中，裂解剂处于包含n-甲基-2-吡咯烷酮的溶液中。在一些实施方案中，去保护剂包含nh3。在一些实施方案中，去保护剂处于水溶液中。在一些实施方案中，载体介质包含具有1％交联二乙烯基苯的聚苯乙烯。本公开的寡聚化合物可具有不对称中心、手性轴和手性平面(如在例如以下文献中所述：e.l.eliel和s.h.wilen，stereo-chemistryofcarboncompounds，johnwiley&sons，newyork，1994，第1119-1190页；和march，j.，advancedorganicchemistry，第3版，第4章，johnwiley&sons，newyork(1985))，并且可以外消旋物、外消旋的混合物和单独的非对映体，以及所有可能的异构体及其混合物，包括光学异构体的形式出现。本文具体提及的本公开寡聚化合物并未进行任何立体化学指示，它们旨在代表所有可能的异构体及其混合物。具体地，不希望受任何特定理论的束缚，本公开的寡聚化合物如本文所讨论的那样由活化的吗啉代亚基制备，所述亚基包括这些非限制性实例，诸如式(viii)的化合物：其中r2对于式(viii)的每种化合物，独立地选自由以下组成的组：上述式(viii)的化合物各自可以由例如下面所示出的对应β-d-呋喃核糖基制备：参见summerton等人，antisensenucleicaciddrugdev.1997，7，187-195。不受任何特定理论的束缚，两种手性碳的立体化学在合成条件下得以保留，使得可以基于例如α-l-呋喃核糖基、α-d-呋喃核糖基、β-l-呋喃核糖基或β-d-呋喃核糖基起始物质的选择产生各吗啉代亚基的许多可能的立体异构体。例如，在一些实施方案中，本公开的式(viii)的化合物可以具有式(viiia)：其中r2对于式(viiia)的每种化合物，独立地选自由以下组成的组：不受任何特定理论的束缚，例如，将10至40种式(viii)的化合物结合到本公开的寡聚化合物中可产生许多可能的立体异构体。不希望受任何特定理论的束缚，本公开的寡聚化合物包含一个或多个含磷亚基间键，这些键在每个磷处产生手性中心，这些手性中心各自被指示为如本领域所理解的“sp”或“rp”构型。不希望受任何特定理论的束缚，这种手性产生立体异构体，这些立体异构体具有相同的化学组成但其原子的三维排列不同。不希望受任何特定理论的束缚，各含磷亚基间键的构型在例如本公开的寡聚化合物合成期间随机出现。不希望受任何特定理论的束缚，合成过程产生指数级大量的本公开寡聚化合物的立体异构体，因为本公开的寡聚化合物由许多含磷亚基间键-每个含磷亚基间键具有随机手性构型-组成。具体地，不希望受任何特定理论的束缚，其他吗啉代亚基的各亚基间键使产物的立体异构体的数量加倍，使得本公开的寡聚化合物的常规制备得到的实际上是2n立体异构体的高度非均质混合物，其中n表示含磷亚基间键的数目。表1示出了本文所述方法中提供的吗啉代亚基的各种实施方案。表1：吗啉代亚基的各种实施方案。实施例为了说明和描述本公开的某些具体实施方案，下文阐述了实施例。然而，权利要求的范围不以任何方式受本文阐述的实施例的限制。对所公开的实施方案的各种改变和修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在不脱离本公开的精神和所附权利要求的范围的情况下做出此类改变和修改，包括但不限于涉及本公开的化学结构、取代基、衍生物、制剂或方法的那些改变和修改。本文方案中结构中变量的定义与本文提供的式中对应位置的变量的定义相当。实施例1：ncp2锚合成1.4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(1)的制备向100l烧瓶中加入12.7kg的4-氟-3-硝基苯甲酸，加入40kg甲醇和2.82kg浓硫酸。将混合物在回流(65℃)下搅拌36小时。将反应混合物冷却至0℃。在38℃下形成晶体。将混合物在0℃下保持4小时，然后在氮气下过滤。将100l烧瓶洗涤，并将滤饼用10kg已冷却至0℃的甲醇洗涤。将固体滤饼在漏斗上干燥1小时，转移至托盘，并在室温下在真空烘箱中干燥，得到恒重13.695kg的4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(100％收率；hplc99％)。2.3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸的制备a.(z)-4-(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丁-2-烯-2-基)-3-硝基苯甲酸甲酯(2)向100l烧瓶中加入3.98kg来自前一步骤的4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(1)、9.8kgdmf、2.81kg乙酰乙酸甲酯。将混合物搅拌并冷却至0℃。在约4小时内向其中加入3.66kgdbu，同时将温度保持在5℃或5℃以下。将混合物再搅拌1小时。向反应烧瓶中添加8.15kg柠檬酸在37.5kg纯化水中的溶液，同时将反应温度保持在15℃或15℃以下。添加后，将反应混合物再搅拌30分钟，然后在氮气下过滤。将湿滤饼与14.8kg纯化水一起放回100l烧瓶中。将浆液搅拌10分钟，然后过滤。将湿滤饼再次放回100l烧瓶中，用14.8kg纯化水浆化10分钟，并过滤得到粗(z)-4-(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丁-2-烯-甲酯)吡啶-2-基)-3-硝基苯甲酸甲酯。b.3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸在氮气下，将粗(z)-4-(3-羟基-1-甲氧基-1-氧代丁-2-烯-2-基)-3-硝基苯甲酸甲酯加入100l反应烧瓶中。向其中添加14.2kg的1，4-二恶烷并搅拌。在2小时内向混合物中添加16.655kg浓hcl和13.33kg纯化水(6mhcl)的溶液，同时将反应混合物的温度保持在15℃以下。添加完成后，将反应混合物在回流(80℃)下加热24小时，冷却至室温，并在氮气下过滤。将固体滤饼与14.8kg纯化水一起研磨，过滤，再次用14.8kg纯化水研磨，并过滤。将固体放回具有39.9kgdcm的100l烧瓶中并在搅拌下回流1小时。添加1.5kg纯化水以溶解剩余的固体。将底部有机层分到预热的72l烧瓶中，然后放回洁净干燥的100l烧瓶中。将溶液冷却至0℃，保持1小时，然后过滤。将固体滤饼各用9.8kgdcm和5kg庚烷的溶液洗涤两次，然后在漏斗上干燥。将固体转移到托盘中并干燥，得到恒重1.855kg的3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸。从化合物1的总收率为42％。hplc99.45％。3.n-三苯甲基哌嗪琥珀酸酯(ntp)的制备在氮气下，向72l带夹套的烧瓶中加入1.805kg三苯甲基氯和8.3kg甲苯(tpc溶液)。搅拌混合物直至固体溶解。在氮气下，向100l带夹套的反应烧瓶中加入5.61kg哌嗪、19.9kg甲苯和3.72kg甲醇。将混合物搅拌并冷却至0℃。在4小时内将tpc溶液分批缓慢添加到此混合物中，同时将反应温度维持在10℃或10℃以下。将混合物在10℃下搅拌1.5小时，然后使其温热至14℃。将32.6kg纯化水加入72l烧瓶中，然后转移到100l烧瓶中，同时将内部批料温度维持在20+/-5℃。使各层分开并分离底部水层并储存。用32kg纯水各萃取有机层三次，分离水层并将其与储存的水溶液合并。将剩余的有机层冷却至18℃，并将847g琥珀酸在10.87kg纯化水中的溶液分批缓慢添加到有机层中。将混合物在20+/-5℃下搅拌1.75小时。过滤混合物，用2kgtbme和2kg丙酮洗涤固体，然后在漏斗上干燥。将滤饼用各5.7kg丙酮研磨两次，过滤并在研磨之间用1kg丙酮洗涤。将固体在漏斗上干燥，然后转移到托盘中并在室温下在真空烘箱中干燥，得到恒重2.32kg的ntp。收率80％。4.(4-(2-羟丙基)-3-硝基苯基)(4-三苯甲基哌嗪-1-基)甲酮的制备a.1-(2-硝基-4(4-三苯甲基哌嗪-1-羰基)苯基)丙-2-酮的制备在氮气下向100l带夹套的烧瓶中加入2kg3-硝基-4-(2-氧代丙基)苯甲酸(3)、18.3kgdcm、1.845kgn-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)。搅拌溶液直至形成均质混合物。在室温下在30分钟内添加3.048kgntp并搅拌8小时。将5.44kg纯化水添加到反应混合物中并搅拌30分钟。使各层分离，将含有产物的底部有机层排出并储存。用5.65kgdcm萃取水层两次。将合并的有机层用1.08kg氯化钠在4.08kg纯化水中的溶液洗涤。将有机层用1.068kg硫酸钠干燥并过滤。用1.3kgdcm洗涤硫酸钠。将合并的有机层用252g硅胶浆化，并通过含有252g硅胶床的过滤漏斗过滤。用2kgdcm洗涤硅胶床。将合并的有机层在旋转蒸发器上蒸发。向残余物中添加4.8kgthf，然后在旋转蒸发器上蒸发，直至达到2.5体积的在thf中的粗1-(2-硝基-4-(4-三苯甲基哌嗪-1-羰基)苯基)丙-2-酮。b.(4-(2-羟丙基)-3-硝基苯基)(4-三苯甲基哌嗪-1-基)甲酮(5)的制备在氮气下，向100l带夹套的烧瓶中加入3600g来自前一步骤的4和9800gthf。将搅拌的溶液冷却至≤5℃。将溶液用11525g乙醇稀释，并在≤5℃下在约2小时内添加194g硼氢化钠。将反应混合物在≤5℃下另外搅拌2小时。通过缓慢加入，用约1.1kg氯化铵在约3kg水中的溶液淬灭反应，以将温度维持在≤10℃。将反应混合物再搅拌30分钟，过滤除去无机物，再充入100l带夹套烧瓶中并用23kgdcm萃取。分离有机层，再各自用4.7kgdcm萃取水相两次。将合并的有机层用约800g氯化钠在约3kg水中的溶液洗涤，然后用2.7kg硫酸钠干燥。过滤悬浮液，滤饼用2kgdcm洗涤。将合并的滤液浓缩至2.0体积，用约360g乙酸乙酯稀释，并蒸发。在氮气下，将粗产物加载到填充有dcm的4kg二氧化硅的硅胶柱上，并用含2.3kg乙酸乙酯的7.2kgdcm洗脱。蒸发合并的级分，将残余物溶于11.7kg甲苯中。过滤甲苯溶液，滤饼各自用2kg甲苯洗涤两次。将滤饼干燥得到恒重2.275kf的化合物5(从化合物3的收率为46％)hplc96.99％。5.2，5-二氧代吡咯烷-1-基(1-(2-硝基-4-(4-三苯基甲基哌嗪-1-羰基)苯基)丙-2-基)碳酸酯(ncp2锚)的制备在氮气下，向100l带夹套的烧瓶中加入4.3kg化合物5(通过h1nmr基于残余甲苯调整的重量；此后所有试剂均相应地缩放)和12.7kg吡啶。向其中加入3.160kgdsc(通过h1nmr分析为78.91重量％)，同时将内部温度维持在≤35℃。将反应混合物在环境下老化约22小时，然后过滤。滤饼用200g吡啶洗涤。在分别包含1/2滤液体积的两个批次中，将洗涤滤液缓慢加入到含有约11kg柠檬酸在约50kg水中的溶液的100l带夹套烧瓶中，并搅拌30分钟以进行固体沉淀。用过滤漏斗收集固体，每次用4.3kg水洗涤，洗涤两次，并在真空下在过滤漏斗上干燥。将合并的固体装入100l带夹套烧瓶中并溶于28kgdcm中，并用900g碳酸钾在4.3kg水中的溶液洗涤。1小时后，使各层分离，并除去水层。用10kg水洗涤有机层，分离，用3.5kg硫酸钠干燥。将dcm过滤，蒸发，并在真空下干燥，得到6.16kgncp2锚(收率114％)。实施例2：锚负载树脂合成向带有特氟隆锁闭开关的75l固相合成反应器中加入约52lnmp和2300g氨基甲基聚苯乙烯树脂。将树脂在nmp中搅拌以溶胀约2小时，然后排干。每次用约4ldcm洗涤树脂，洗涤两次，然后每次用39l中和溶液洗涤，洗涤两次，然后每次用39ldcm洗涤，洗涤两次。将ncp2锚溶液缓慢添加到搅拌的树脂溶液中，在室温下搅拌24小时，并排干。每次用39lnmp洗涤树脂，洗涤四次，并每次用39ldcm洗涤，洗涤六次。用1/2dedc封端溶液处理树脂并搅拌30分钟，排干，然后用第2份1/2dedc封端溶液处理并搅拌30分钟，并排干。每次用39ldcm洗涤树脂，洗涤六次，然后在烘箱中干燥，得到恒重3573.71g的锚负载树脂。实施例3：活化eg3尾的制备(参见图2)1.三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯35的制备向冷却的ntp在二氯甲烷中的悬浮液(6ml/gntp)中添加碳酸钾(3.2当量)在水中的溶液(4ml/g碳酸钾)。向此两相混合物中缓慢添加氯甲酸苯酯(1.03当量)在二氯甲烷中的溶液(2g/g氯甲酸苯酯)。将反应混合物温热至20℃。反应完成(1-2小时)后，分离各层。用水洗涤有机层，并用无水碳酸钾干燥。通过从乙腈中结晶分离产物35。收率＝80％。2.氨基甲酸酯醇36的制备将氢化钠(1.2当量)悬浮在1-甲基-2-吡咯烷酮(32ml/g氢化钠)中。向该悬浮液中添加三甘醇(10.0当量)和化合物35(1.0当量)。将所得浆料加热至95℃。反应完成(1-2小时)后，将混合物冷却至20℃。向该混合物中添加30％二氯甲烷/甲基叔丁基醚(v∶v)和水。依次用naoh水溶液、琥珀酸水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤含产物的有机层。通过从二氯甲烷/甲基叔丁基醚/庚烷中结晶分离产物36。收率＝90％。3.eg3尾酸37的制备向化合物36在四氢呋喃中的溶液(7ml/g36)中添加琥珀酸酐(2.0当量)和dmap(0.5当量)。将混合物加热至50℃。反应完成(5小时)后，将混合物冷却至20℃并用nahco3水溶液调整至ph8.5。添加甲基叔丁基醚，并将产物萃取到水层中。添加二氯甲烷，并用柠檬酸水溶液将混合物调整至ph3。将含有产物的有机层用ph＝3的柠檬酸盐缓冲液和饱和氯化钠水溶液的混合物洗涤。在制备化合物38时，不经分离使用该37的二氯甲烷溶液。4.活化eg3尾38的制备向化合物37的溶液中添加n-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酸酰亚胺(honb)(1.02当量)、4-二甲基氨基吡啶(dmap)(0.34当量)，然后添加1-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)(1.1当量)。将混合物加热至55℃。反应完成(4-5小时)后，将混合物冷却至20℃并依次用1∶10.2m柠檬酸/盐水和盐水洗涤。将二氯甲烷溶液与丙酮进行溶剂交换，然后与n，n-二甲基甲酰胺进行溶剂交换，通过从丙酮/n，n-二甲基甲酰胺中沉淀到饱和氯化钠水溶液中分离产物。将粗产物在水中重新浆化数次，以除去残余的n，n-二甲基甲酰胺和盐。从化合物36得到活化eg3尾38的收率＝70％。实施例4：eteplirsen[寡聚化合物(xii)]原料药物的50l固相合成1.物质表2：起始物质起始物质的化学结构：a.活化的eg3尾b.活化的c亚基(用于制备，参见美国专利no.8,067,571)c.活化的a亚基(用于制备，参见美国专利no.8,067,571)d.活化的dpg亚基(用于制备，参见wo2009/064471)e.活化的t亚基(用于制备，参见wo2013/082551)f.锚负载树脂其中r1是载体介质。表3：用于eteplirsen原料药物固相寡聚物合成的溶液的描述2.eteplirsen原料药物的合成a.树脂溶胀将750g锚负载树脂和10.5lnmp加入50l硅烷化反应器中并搅拌3小时。排出nmp并将锚负载树脂用dcm各5.5l洗涤两次，并用30％tfe/dcm各5.5l洗涤两次。b.循环0：eg3尾偶联将锚负载树脂用30％tfe/dcm各5.5l洗涤三次并排干，用5.5lcytfa溶液洗涤15分钟并排干，再用5.5lcytfa溶液洗涤15分钟而不排干，向其中加入122ml的1∶1nem/dcm并将悬浮液搅拌2分钟并排干。将树脂用5.5l中和溶液洗涤5分钟，洗涤两次并排干，然后用dcm各5.5l洗涤两次并排干。将706.2g活化的eg3尾(mw765.85)和234ml的nem在3ldmi中的溶液加入到树脂中并在室温下搅拌3小时并排干。将树脂每次用5.5l中和溶液洗涤5分钟，洗涤两次，并用5.5ldcm洗涤一次并排干。加入374.8g苯甲酸酐和195mlnem在2680mlnmp中的溶液并搅拌15分钟并排干。将树脂与5.5l中和溶液一起搅拌5分钟，然后用5.5ldcm洗涤一次并用30％tfe/dcm各5.5l洗涤两次。将树脂悬浮在5.5l的30％tfe/dcm中并保持14小时。c.亚基偶联循环1-30i.偶联前处理在如表4中所述的各偶联循环之前，对树脂进行以下处理：1)用30％tfe/dcm洗涤；2)a)用cytfa溶液处理15分钟并排干，且b)用cytfa溶液处理15分钟，向其中添加1∶1nem/dcm，搅拌并排干；3)与中和溶液一起搅拌三次；并且4)用dcm洗涤两次。参见表4。ii.偶联后处理在如表4中所述排出各亚基溶液后，对树脂进行以下处理：1)用dcm洗涤；2)用30％tfe/dcm洗涤两次。如果在下一个偶联循环之前树脂要保持一段时间，则不排出第二tfe/dcm洗涤液并将树脂保留在所述tfe/dcm洗涤溶液中。参见表4。iii.活化亚基偶联循环如表4中所述进行偶联循环。iv.最终的ipa洗涤在如表4中所述进行最终偶联步骤后，将树脂用ipa各19.5l洗涤8次，并在室温下真空干燥约63.5小时，达到干重为5,579.8g。d.裂解将上述树脂结合的eteplirsen原料药物分成两批，每批如下处理。一批2,789.9g的树脂进行以下处理：1)用10lnmp搅拌2小时，然后排出nmp；2)用30％tfe/dcm各10l洗涤三次；3)用10lcytfa溶液处理15分钟；并且4)用10lcytfa溶液处理15分钟，然后向其中添加130ml1∶1nem/dcm并搅拌2分钟并排干。将树脂用中和溶液各10l处理三次，用10ldcm洗涤六次，并用nmp各10l洗涤八次。将树脂用1530.4gdtt和2980dbu在6.96lnmp中的裂解溶液处理2小时，以从树脂中分离出eteplisen原料药物。将裂解溶液排出并保留在单独的容器中。用与裂解溶液合并的4.97lnmp洗涤反应器和树脂。表4：表4续表4续表4续表4续e.去保护将合并的裂解溶液和nmp洗涤液转移到压力容器中，向其中添加已在冰箱中冷冻至-10℃至-25℃温度的39.8lnh4oh(nh3·h2o)。将压力容器密封并加热至45℃持续16小时，然后使之冷却至25℃。将含有eteplirsen原料药物的此去保护溶液用纯化水3∶1稀释，并用2m磷酸将ph调整至3.0，然后用nh4oh将ph调整至8.03。hplc(c18)73-74％(图1)。表5.图1的数据实施例5：eteplirsen原料药物的纯化将含有eteplirsen原料药物的实施例2部分d中的去保护溶液上样到toyopearlsuper-q650s阴离子交换树脂(tosohbioscience)柱上，以17倍柱体积的0-35％b梯度洗脱(缓冲液a：10mm氢氧化钠；缓冲液b：含1m氯化钠的10mm氢氧化钠)并且将可接受纯度(c18和scxhplc)的级分合并到纯化的药物产物溶液中。hplc(图2)：97.74％(c18)94.58％(scx)。将纯化的药物溶液脱盐并冻干至1959g纯化的eteplirsen药物。收率61.4％；hplc(图3)：97.7％(c18)94.6％(scx)。表6.图2的数据表7.图3的数据实施例6：通过本公开的方法制备的其他寡聚物根据实施例4和实施例5的方法制备以下序列的以下寡聚物：其中r2在每次出现时独立地选自由以下组成的组：表8.从1至n和5’至3’各位置处的寡聚物r2在上表8中，“+”表示其中x是否则x是-n(ch3)2。表9.缩写以引用的方式并入本申请通篇所引用的所有参考文献(包括文学参考文献、授权专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请)的内容在此明确地以其整体并入本文。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均符合本领域普通技术人员通常已知的含义。等同物本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由以下权利要求涵盖。当前第1页12