球形核酸TLR9激动剂的制作方法

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发明背景

toll样受体(tlr)9是识别dna中非甲基化cg基序(cpg)的内涵体受体，刺激th1型免疫应答。此前所鉴定到的合成寡核苷酸tlr9激动剂是线性或分支的寡核苷酸。根据序列性质和生物学效应将线性寡核苷酸tlr9激动剂分成三个主要类别。a类cpg寡核苷酸具有含磷酸二酯(po)主链的中部自身互补区域和含硫代磷酸酯(ps)连接的≥3个g的5’和3’末端重复，并刺激高水平ifnα产生但是低的nf-κb活化。b类cpg寡核苷酸具有ps主链和最低自身互补性，并刺激低水平ifnα但是高的nf-κb活化。c类cpg寡核苷酸具有ps主链和高自身互补性，并诱导中等水平的ifnα和nf-κb。线性寡核苷酸tlr9激动剂具有序列基序和长度的严格要求来活化tlr9，通常需要24个核苷酸的长度，对b和c类寡核苷酸而言需要5’tcg来最佳活化人tlr9。

发明概述

在一些方面，本发明是球形核酸(sna)，其包括具有寡核苷酸壳的脂质体或lipoplex复合物，该寡核苷酸壳包含位于脂质体或lipoplex外部的b类cpg寡核苷酸，其中b类cpg寡核苷酸为4-16个核苷酸长度和/或不含5’tcg基序。

在一个实施方案中，cpg寡核苷酸长度为8-14个核苷酸。在另一实施方案中，cpg寡核苷酸不含5’tcg基序。

在一些实施方案中，cpg寡核苷酸通过锚定基团连接到脂质体或lipoplex上。在一个实施方案中，锚定基团是脂质锚定基团。在另一实施方案中，锚定基团是胆固醇。在另一实施方案中，锚定基团是生育酚，其可以是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚或δ-生育酚。在另一实施方案中，锚定基团可选自固醇、棕榈酰基、二棕榈酰基、硬脂酰基、二硬脂酰基、c16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸盐、油酰石胆酸、油酰胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、诸如类固醇之类的类异戊二烯、诸如维生素e之类的维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、诸如甘油三酯之类的脂肪酸酯、芘、卟啉、德克萨卟啉(texaphyrine)、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、地高辛、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、花青染料(例如cy3或cy5)、hoechst33258染料、补骨脂素和布洛芬或者其他亲脂性部分。

在其他实施方案中，寡核苷酸壳的寡核苷酸是放射状朝向外部的。在一些实施方案中，寡核苷酸壳具有5-1,000个寡核苷酸/sna的密度。在另一实施方案中，寡核苷酸壳具有100-1,000个寡核苷酸/sna的密度。在又一实施方案中，寡核苷酸壳具有500-1,000个寡核苷酸/sna的密度。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有至少一个核苷间硫代磷酸酯连接。在其他实施方案中，寡核苷酸不含核苷间硫代磷酸酯连接。在另一实施方案中，寡核苷酸全部核苷间具有硫代磷酸酯连接。在另一实施方案中，寡核苷酸具有至少一个核苷间多立体性(stereo-enriched)硫代磷酸酯连接。在另一实施方案中，寡核苷酸全部核苷间具有多立体性硫代磷酸酯连接。多立体性硫代磷酸酯连接可以是rp非对映体或sp非对映体。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有10到12个核苷酸的长度。

在另一实施方案中，至少25％的寡核苷酸具有暴露到sna外表面的5’末端。在其他实施方案中，寡核苷酸壳的所有寡核苷酸具有暴露到sna外表面的5’末端。在一些实施方案中，寡核苷酸壳至少25％的寡核苷酸具有暴露到sna外表面的3’末端。

在其他方面，本发明是包括球形核酸(sna)的组合物，该球形核酸包含具有寡核苷酸壳的脂质体或lipoplex复合物，该寡核苷酸壳包含位于脂质体或lipoplex外部的cpg寡核苷酸，其中该组合物与相同序列的摩尔当量线性cpg寡核苷酸相比，刺激了明显更多细胞因子的产生。

在其他方面，本发明是包括球形核酸(sna)的组合物，该球形核酸包含具有寡核苷酸壳的脂质体或lipoplex复合物，该寡核苷酸壳包含位于脂质体或lipoplex外部的非传统cpg寡核苷酸。

在一些实施方案中，细胞因子是il-6。在另一实施方案中，细胞因子是il-12。在另一实施方案中，细胞因子可以是一种或更多种的干扰素α(ifn-α)、干扰素γ(ifn-γ)、白介素8(il8)、il18、肿瘤坏死因子(tnf)以及已知作为th1型或th2型免疫应答的一部分表达的其他细胞因子。

在一个实施方案中，细胞因子是体外产生的。在另一实施方案中，细胞因子是体内产生的。

在一些实施方案中，cpg寡核苷酸是b类cpg寡核苷酸。cpg寡核苷酸在另一实施方案中是c类cpg寡核苷酸。在其他实施方案中，cpg寡核苷酸是a类cpg寡核苷酸。在更多实施方案中，cpg寡核苷酸是a类cpg寡核苷酸、b类cpg寡核苷酸和c类cpg寡核苷酸的混合物。

在一个实施方案中，cpg寡核苷酸为4-16个核苷酸长度。在一些实施方案中，cpg寡核苷酸不含5’tcg基序。

在另一实施方案中，cpg寡核苷酸是放射状朝向外部的。在一些实施方案中，寡核苷酸壳具有5-1,000个寡核苷酸/sna的密度。在其他实施方案中，寡核苷酸壳具有100-1,000个寡核苷酸/sna的密度。在另一实施方案中，寡核苷酸壳具有500-1,000个寡核苷酸/sna的密度。

在一些实施方案中，cpg寡核苷酸具有至少一个核苷间硫代磷酸酯连接。在另一实施方案中，cpg寡核苷酸不含核苷间硫代磷酸酯连接。在其他实施方案中，cpg寡核苷酸全部核苷间具有硫代磷酸酯连接。

在另一实施方案中，cpg寡核苷酸具有10到16个核苷酸的长度。

在更多实施方案中，至少25％的cpg寡核苷酸具有暴露到sna外表面的5’末端。在一些实施方案中，至少25％所述的cpg寡核苷酸具有暴露到sna外表面的3’末端。

本公开的另一方面包括包含球形核酸(sna)的组合物，该球形核酸包含具有寡核苷酸壳的脂质体或lipoplex复合物，该寡核苷酸壳包含位于脂质体或lipoplex外部的a类cpg寡核苷酸。

在其他方面，本发明包括诱导受试者细胞因子表达的方法，其包括：给予受试者对诱导il-6或il-12表达有效的量的组合物，该组合物包含具有寡核苷酸壳的脂质体或lipoplex复合物的球形核酸(sna)，该寡核苷酸壳包含位于脂质体或lipoplex外部的cpg寡核苷酸。在一些实施方案中，sna是上述sna或组合物。

本发明在另一方面包括治疗受试者的方法，其包括：给予受试者对治疗受试者有效的量的组合物，该组合物包含具有寡核苷酸壳的脂质体或lipoplex复合物的球形核酸(sna)，该寡核苷酸壳包含位于脂质体或lipoplex外部的cpg寡核苷酸。在一些实施方案中，sna是上述sna或组合物。在一个实施方案中，受试者患有癌症。在另一实施方案中，受试者患有感染性疾病。在其他实施方案中，受试者患有变应性病症或炎症性病症。

本发明的每一限定都能涵盖本发明的各个实施方案。因此，可以预期的是，涉及任一要素或要素组合的本发明每一限定都能在本发明每一方面中被包括。本发明并不限于其在以下描述中所阐述的或在附图中所显示的组件结构和排列细节中的应用。本发明能够是其他实施方案并以各种方式实施或执行。

附图简述

附图并不打算按比例绘制。在附图中，各图所图示的每个相同或近似相同的组件都通过同样的数字表示。为了清楚目的，可以不在每幅附图中都标记出每个组件。在附图中：

图1包括两幅图表，描述了人外周血单核细胞(pmbc)中的寡核苷酸摄取。上图显示了摄取寡核苷酸的hpbmc的百分比，下图显示了hpbmc中每个细胞的寡核苷酸摄取。

图2包括两幅图表，显示了小鼠在皮下注射cpg寡核苷酸后的体内细胞因子应答。上图显示了il-12p70水平，下图显示了il-6水平。

发明详述

尽管已发现cpg寡核苷酸是免疫刺激性的，但具有体内治疗益处的具体寡核苷酸限于具有优选长度和具体结构的相对窄范围的寡核苷酸。具有更低体外活性的cpg寡核苷酸通常没有足以产生有治疗意义的体内免疫应答的活性。这些次优cpg寡核苷酸通常少于24个核苷酸长度且不包括诸如5’tcg之类的关键基序。根据本发明已发现，当将次优cpg寡核苷酸配成球形核酸(sna)时，就能够产生治疗性体内免疫应答。

球形核酸(sna)是由紧密包装的放射状朝向的核酸组成的。这种结构赋予它们独特性能，使得能够通过清道夫受体来介导sna的细胞摄取。sna的细胞摄取是迅速且有效的，并产生内涵体积累。已发现配成sna的cpg寡核苷酸具有更好的细胞摄取，与单独的寡核苷酸相比，更多sna-寡核苷酸被摄取到细胞中了。

本发明的sna包括cpg寡核苷酸。在一些实施方案中，那些cpg寡核苷酸是次优的或非传统的cpg寡核苷酸。“非传统”cpg寡核苷酸是包含非甲基化cpg基序的寡核苷酸，而其体外免疫刺激性不会产生足以具有治疗益处的体内免疫应答。在一些实施方案中，非传统cpg寡核苷酸具有少于24个核苷酸的长度。在其他实施方案中，非传统cpg寡核苷酸具有一个或多个传统a类、b类或c类cpg寡核苷酸所缺少的结构特征。

一些实施方案中的cpg寡核苷酸短于已知治疗性寡核苷酸的24个核苷酸长度。寡核苷酸优选4到20个核苷酸长度的范围。优选地，寡核苷酸在6到16个核苷酸范围内，在一些实施方案中，在8到12个、8到10个、10到12个、6到12个、4到14个或者6到10个核苷酸范围内。

cpg寡核苷酸包括例如a类、b类和c类免疫刺激性cpg寡核苷酸。如本文所使用的术语“免疫刺激性cpg核酸”或“免疫刺激性cpg寡核苷酸”是指能够激活免疫细胞的任何包含cpg的寡核苷酸。cpg二核苷酸中的至少c一般是非甲基化的。免疫刺激性cpg寡核苷酸描述于许多已授权专利和已公开专利申请中，包括美国专利号6,194,388；6,207,646；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705和6,429,199，通过引用将其并入本文。

在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有硫代磷酸酯(ps)主链之类的修饰主链。在其他实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有磷酸二酯(po)主链。在还有的其他实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有混合的po和ps主链。

cpg寡核苷酸可以是a类寡核苷酸、b类寡核苷酸或c类寡核苷酸。“a类”cpg免疫刺激性核酸已描述于所公布的pct申请wo01/22990中。这些核酸的特征在于诱导高水平干扰素-α而对b细胞活化影响极小的能力。a类cpg免疫刺激性核酸可包含yamamoto和同事所描述的六聚体回文gacgtc、agcgct或aacgtt。yamamotos等.jimmunol148:4072-6(1992)。传统a类寡核苷酸具有富含多聚g的5’和3’末端以及回文中部区域。典型地，5’和3’末端的核苷酸具有稳定的核苷酸间连接，中部回文区域具有磷酸二酯连接(嵌合体)。非传统的a类寡核苷酸可以缺少一个或多个多聚g末端和回文中部。另外，非传统的a类寡核苷酸可以全部具有硫代磷酸酯或全部具有磷酸二酯核苷酸间连接。

b类cpg免疫刺激性核酸强力活化人b细胞但对诱导干扰素-α影响极小而无需另外的修饰。传统上而言，b类寡核苷酸包括序列5'tcn1tx1x2cgx3x43'(seqidno:77)，其中x1是g或a；其中x2是t、g或a；x3是t或c；x4是t或c；以及n是任意核苷酸，n1和n2是每个约0-25个n的核酸序列。通常完全硫代磷酸酯化且在某些优选碱基范围内包括非甲基化cpg二核苷酸的b类cpg寡核苷酸在活化b细胞和浆细胞样树突状细胞(pdc)方面是强大的，但是在诱导ifn-α和nk细胞活化方面是相对弱的。参见例如美国专利nos.6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068。

在一个实施方案中，非传统的b类cpg寡核苷酸由至少以下通式表示：

5'x1x2cgx3x43'

其中x1、x2、x3和x4是核苷酸。在一个实施方案中，x2是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在另一实施方案中，x3是胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。在一些实施方案中，非传统的b类cpg寡核苷酸缺少5’tcg。

在另一实施方案中，本发明提供了分离的b类cpg寡核苷酸，由至少以下通式表示：

5'n1x1x2cgx3x4n23'(seqidno:78)

其中x1、x2、x3和x4是核苷酸，n是任意核苷酸，n1和n2是每个约0-25个n的核酸序列。在一个实施方案中，x1x2是选自gpt、gpg、gpa、apa、apt、apg、cpt、cpa、cpg、tpa、tpt和tpg的二核苷酸；x3x4是选自tpt、apt、tpg、apg、cpg、tpc、apc、cpc、tpa、apa和cpa的二核苷酸。优选地，x1x2是gpa或gpt且x3x4是tpt。在其他实施方案中，x1或x2或两者都是嘌呤且x3或x4或两者都是嘧啶，或者x1x2是gpa且x3或x4或两者都是嘧啶。在另一优选实施方案中，x1x2是选自tpa、apa、apc、apg和gpg的二核苷酸。在还有的另一实施方案中，x3x4是选自tpt、tpa、tpg、apa、apg、gpa和cpa的二核苷酸。x1x2在另一实施方案中是选自tpt、tpg、apt、gpc、cpc、cpt、tpc、gpt和cpg的二核苷酸；x3是选自a和t的核苷酸且x4是核苷酸，但是其中当x1x2是tpc、gpt或cpg时，x3x4不是tpc、apt或apc。在一些实施方案中，非传统的b类cpg寡核苷酸缺少5’tcg。

在另一优选实施方案中，cpg寡核苷酸具有序列5'tcn1tx1x2cgx3x43'(seqidno:77)且长度小于24个核苷酸。本发明一些实施方案中的cpg寡核苷酸包括x1x2选自gpt、gpg、gpa和apa且x3x4选自tpt、cpt和tpc。

在一些实施方案中，一个或多个b类cpg寡核苷酸是2-20、5-20、10-20、15-20、2-20、5-30、10-30、15-30、20-30、25-30、2-40、5-40、10-40、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、2-50、5-50、10-50、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、2-100、5-100、10-100、15-100、20-100、25-100、30-100、35-100个核苷酸长度。在一些实施方案中，一个或多个b类cpg寡核苷酸是4-16个核苷酸长度。

c类免疫刺激性核酸包含至少两个不同基序并具有对免疫系统细胞独特且希望的刺激性效应。这些odn中的一些同时具有传统“刺激性”cpg序列和“富含gc的”或“b细胞中和性”基序。这些组合基序核酸具有介于与传统“b类”cpgodn相关联的效应和与a类cpgodn相关联的效应两者之间的免疫刺激性效应，“b类”cpgodn是b细胞活化和树突状细胞(dc)活化的强诱导剂，a类cpgodn是ifn-α和自然杀伤(nk)细胞活化的强诱导剂但是b细胞和dc活化的相对弱的诱导剂。参见kriegam等.(1995)nature374:546-9；ballaszk等.(1996)jimmunol157:1840-5；yamamotos等.(1992)jimmunol148:4072-6。尽管优选的b类cpgodn通常具有硫代磷酸酯主链以及优选的a类cpgodn具有混合的或嵌合的主链，但c类组合基序免疫刺激性核酸可以具有稳定的例如硫代磷酸酯主链、嵌合主链或磷酸二酯主链，在优选实施方案中，它们具有半软主链，例如c和g核苷酸之间的核苷酸间磷酸二酯连接以及具有硫代磷酸酯连接的其他核苷酸间连接。

刺激性结构域或基序由通式：5'x1dcghx23'定义。d是除c之外的核苷酸。c是胞嘧啶。g是鸟嘌呤。h是除g之外的核苷酸。

x1和x2是0到10个核苷酸长的任意核酸序列。x1可包括cg，在这种情况下，优选在该cg之前紧接t。在一些实施方案中，dcg是tcg。x1优选0到6个核苷酸长度。在一些实施方案中，x2不含任何多聚g或多聚a基序。在其他实施方案中，免疫刺激性核酸在5’末端或3’末端具有多聚t序列。如本文所使用的“多聚a”或“多聚t”将分别指三个或更多个连续a或t的核酸段(stretch)，例如5'aaaa3'或5'tttt3'。

如本文所使用的“多聚g末端”将指三个或更多个连续g的核酸段，例如5'ggg3'，其出现在核酸的5’末端或3’末端。如本文所使用的“多聚g核酸”将指具有通式5'x1x2gggx3x43'的核酸，其中x1、x2、x3和x4是核苷酸且优选至少x3和x4之一是g。

该通式下b细胞刺激性结构域的一些优选设计包括tttttcg、tcg、ttcg、tttcg、ttttcg、tcgt、ttcgt、tttcgt、tcgtcgt。

核酸的第二基序被称为p或n，位于紧接x1的5’或紧接x2的3’。

n是b细胞中和性序列，它以cgg三核苷酸开始且至少10个核苷酸长。b细胞中和性基序包括至少一个cpg，其中cg之前为c或者之后为g(kriegam等.(1998)procnatlacadsciusa95:12631-12636)，或者是包含cg的dna序列，其中cg的c被甲基化。如本文所使用的“cpg”将指5’胞嘧啶(c)之后为3’鸟嘌呤(g)并通过磷酸酯键连接。至少5'cg3'的c必须是非甲基化的。中和性基序是这样的基序，当存在另外的非刺激性基序时，它们具有一定程度的免疫刺激性能力，但是当存在于其他免疫刺激性基序环境中时，它们用来降低其他基序的免疫刺激性潜力。

p是富含gc的回文，其包含至少10个核苷酸长的序列。如本文所使用的“回文”和等价的“回文序列”将指反向重复，即诸如abcdee'd'c'b'a'之类的序列，其中a和a'、b和b'等是能够形成常见沃森-克里克碱基配对的碱基。p还可以是中断性回文，即诸如abcdennnne'd'c'b'a'之类的序列，其中a和a'、b和b'等是能够形成常见沃森-克里克碱基配对的碱基，n是任意碱基。

如本文所使用的“富含gc的回文”将指具有至少三分之二g和c的碱基组成的回文。在一些实施方案中，富含gc的结构域优选在“b细胞刺激性结构域”的3’。在10个碱基长的富含gc的回文例子中，回文就因此而包含至少8个g和c。在12个碱基长的富含gc的回文例子中，回文也包含至少8个g和c。在14-聚体的富含gc的回文例子中，回文至少十个碱基是g和c。在一些实施方案中，富含gc的回文是完全由g和c组成的。

在一些实施方案中，富含gc的回文具有至少81％g和c的碱基组成。在这样的10个碱基长的富含gc的回文例子中，回文就因此而全部由g和c组成。在这样的12个碱基长的富含gc的回文例子中，优选回文至少十个碱基(83％)是g和c。在一些优选实施方案中，12个碱基长的富含gc的回文完全由g和c组成。在14-聚体的富含gc的回文例子中，回文至少十二个碱基(86％)是g和c。在一些优选实施方案中，14个碱基长的富含gc的回文完全由g和c组成。富含gc的回文的c能够是非甲基化的，或者它们能够是甲基化的。

一般而言，该结构域具有至少3个c和g，更优选每种4个，以及最优选每种5个或更多个。该结构域中c和g的数量不必相同。优选c和g的排列能够使它们形成自身互补的双链体或回文，诸如ccgcgcgg。这可以通过a或t进行中断，但优选自身互补性是至少部分保守的，如同作为例子的基序cgacgttcgtcg(seqidno:79)或cggcgccgtgccg(seqidno:80)。当互补性不保守时，优选非互补碱基对是tg。在优选实施方案中，不是回文一部分的连续碱基不超过3个，优选不超过2个，最优选仅1个。在一些实施方案中，富含gc的回文包括至少一个cgg三聚体，至少一个ccg三聚体，或者至少一个cgcg四聚体。

在一些实施方案中，非传统c类cpg寡核苷酸缺少任意一个或多个传统c类寡核苷酸的以上特征，包括核苷酸序列、优选长度或主链修饰。

球形核酸(sna)是一类公认的大分子，是通过将核酸放射状组织在纳米颗粒核即无机金属核周围而形成的(mirkinca等.(1996)adna-basedmethodforrationallyassemblingnanoparticlesintomacroscopicmaterials.nature382(6592):607-609)。这些结构展示了通过a类清道夫受体(sr-a)和脂筏的参与而无需辅助性递送媒介物或转染试剂就进入细胞的能力(rosinl等.(2006)oligonucleotide-modifiedgoldnanoparticlesforintracellulargeneregulation.science312:1027-1031；patelpc等.(2010)scavengerreceptorsmediatecellularuptakeofpolyvalentoligonucleotide-functionalizedgoldnanoparticles.bioconjugatechemistry21(12):2250-2256)。一旦在细胞内部，传统sna的核酸组分抵抗了核酸酶降解，就会延长胞内有效期。此外，由于它们的多功能化学结构，sna具有以多价方式结合其目标的能力(choich等.(2013)mechanismfortheendocytosisofsphericalnucleicacidnanoparticleconjugates.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica110(19):7625-7630；wuxa等.(2014)intracellularfateofsphericalnucleicacidnanoparticleconjugates.journaloftheamericanchemicalsociety136(21):7726-7733)。

本文已发现，基于已配成sna脂质的cpg寡核苷酸的递送系统增强了疗效。已根据本发明研发了cpg寡核苷酸sna，它们将脂质纳米颗粒掺入紧密包装的cpg寡核苷酸壳中。这些独特分子能够用于有效递送任意类型的治疗剂或诊断剂给细胞，特别是以有效方式递送给细胞，产生增强的治疗反应。带有掺入其中的可选治疗剂的脂质体或lipoplex能够通过将缀合了脂质的核酸插入其外表面而被功能化成sna。所产生的sna将包含脂质和放射状朝向外部的核酸。包在前述sna中的分子将通过清道夫受体介导的内吞被摄取到细胞中，产生了其他sna所特有的高效且快速的内涵体积累。将脂质体/lipoplex功能化为sna就改变了摄取途径。将脂质体/lipoplex功能化为sna就增加了脂质体/lipoplex的效率、动力学或者内涵体积累。通过将脂质体/lipoplex的表面功能化为sna，细胞递送路径直接通过清道夫受体，这就增强了体外和体内的内涵体摄取。

本发明的纳米结构通常是由具有寡核苷酸壳的可互换的纳米颗粒核所组成的，它是通过将cpg寡核苷酸排列成从核放射状朝向外部而形成的。在一些方面，纳米颗粒核可以是脂质纳米颗粒。另外，纳米颗粒核可以由泡囊(niosome)组成。疏水性(例如脂质)锚定基团优选用来将寡核苷酸嵌入脂质纳米颗粒中，该锚定基团连接到寡核苷酸的5’末端还是3’末端将取决于要将寡核苷酸排列成5’末端还是3’末端从核面向外部。锚发挥作用驱使插入到脂质纳米颗粒中，并将寡核苷酸连接到脂质上。

泡囊是由定向到脂双层中的非离子表面活性剂所形成的囊泡。泡囊通常具有添加作为赋形剂的胆固醇，也能包括其他基于脂质的和基于非脂质的成分。泡囊的制备方法是本领域公知的。在一些实施方案中，在泡囊制备过程中或之后，加入聚乙二醇(peg)。泡囊囊泡是脂质体的结构和功能类似物，但它们是基于非离子表面活性剂而不是脂质作为基本成分。所使用的常见非离子表面活性剂包括失水山梨醇酯(span)或聚山梨酯(tween)；然而，各种非离子表面活性剂都能用于制备泡囊。

能够从本领域技术人员已知的各种脂质构建脂质纳米颗粒以产生脂质体或lipoplex。脂质体是由包围内部隔室的至少一个脂双层膜所组成的。脂质体可根据膜类型和大小来表征。小单层囊泡(suv)具有单层膜，通常在0.02到0.05pm的直径范围；大单层囊泡(luv)一般大于0.05pm。寡层(oligolamellar)大囊泡和多层(multilamellar)囊泡具有多层的通常同心的膜层，一般大于0.1pm。带有几层不同心膜的脂质体，也就是包含在大囊泡内的几层小囊泡，被称为多囊(multivesicular)囊泡。

本发明的纳米结构可包括核。核可以是中空核，其在壳材料中心区域至少具有一些空间。中空核包括脂质体核。

本文所使用的脂质体核是指位于中心的核隔室，是由形成脂双层的脂质或磷脂组分所形成的。层里的每个脂质分子都是基本上平行朝向相邻脂双层的。形成脂双层的两层都具有它们分子暴露于水相的极性末端和互相邻近的非极性末端。脂质体核的中心水相区域可以是空的或者完全或部分充满水、水乳、寡核苷酸或者其他治疗剂或诊断剂。

lipoplex是在脂质-核酸复合物中掺入特定核酸的脂质纳米颗粒类型。lipoplex也被称为核酸脂质颗粒，通常包含阳离子脂质或非阳离子脂质，并可选包含固醇和/或防止颗粒聚集的脂质(例如peg-脂质缀合物)。在一些例子中，lipoplex包含阳离子脂质、非阳离子脂质、固醇和脂质。

脂质纳米颗粒中也可包括用于各种目的的其他脂质，诸如防止脂质氧化或将配体连接到脂质纳米颗粒表面上。任意的许多脂质都可存在，包括两亲性、中性、阳离子和阴离子脂质。这样的脂质能够单独或组合使用。脂质纳米颗粒中可存在更多组分，包括诸如聚酰胺低聚物之类的双层稳定性组分、肽、蛋白质、去污剂、诸如偶联到磷脂酰乙醇胺上的peg和缀合到神经酰胺上的peg之类的脂质衍生物。脂质纳米颗粒也可包括一种或更多种第二氨基脂质或阳离子脂质、中性脂质、固醇以及选择来在脂质颗粒形成期间减少聚集的脂质，这可能是由于颗粒的空间位阻稳定作用，其防止了形成期间的电荷诱导聚集。如本文所使用的术语“氨基脂质”打算包括具有一个或两个脂肪酸或脂肪族烷基链以及氨基头部基团(包括烷基氨基或二烷基氨基基团)的那些脂质，它们在生理ph下可以被质子化形成阳离子脂质。

脂质纳米颗粒或泡囊可具有约10nm到约150nm的平均直径，更常见约60nm到约130nm，更常见约70nm到约110nm，最常见约70nm到约90nm。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒或泡囊的直径是1nm到约250nm的平均直径，约1nm到约240nm的平均直径，约1nm到约230nm的平均直径，约1nm到约220nm的平均直径，约1nm到约210nm的平均直径，约1nm到约200nm的平均直径，约1nm到约190nm的平均直径，约1nm到约180nm的平均直径，约1nm到约170nm的平均直径，约1nm到约160nm的平均直径，约1nm到约150nm的平均直径，约1nm到约140nm的平均直径，约1nm到约130nm的平均直径，约1nm到约120nm的平均直径，约1nm到约110nm的平均直径，约1nm到约100nm的平均直径，约1nm到约90nm的平均直径，约1nm到约80nm的平均直径，约1nm到约70nm的平均直径，约1nm到约60nm的平均直径，约1nm到约50nm的平均直径，约1nm到约40nm的平均直径，约1nm到约30nm的平均直径，约1nm到约20nm的平均直径，或者约1nm到约10nm的平均直径。

寡核苷酸可位于脂质纳米颗粒或泡囊外部，核的壁内和/或核的中心。位于核的寡核苷酸通常称为偶联到核上。偶联可以是直接的或间接的。在一些实施方案中，至少5、10、15、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000或10,000个或其任意范围组合的寡核苷酸都位于核外部。在一些实施方案中，1-1000、10-500、50-250或50-300个寡核苷酸存在于表面上。

脂质纳米颗粒可包括中性脂质。中性脂质可以是例如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(dmpc)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(popc)，1,2-双硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(dspg)，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(dopg)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)，1,2-二(9z-十八烷基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)以及1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)，由商业供应商供应的任意相关磷脂酰胆碱或中性脂质。

脂质纳米颗粒可包括阳离子脂质。阳离子脂质可以是例如n,n-二油基-n,n-二甲基铵氯化物(dodac)，n,n-二硬脂基-n,n-二甲基铵溴化物(ddab)，n-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基铵氯化物(dotap)，n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基铵氯化物(dotma)，n,n-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(dodma)，1,2-二亚油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)，1,2-亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)，1,2-二亚油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)，1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)，1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(dlin-ma)，1,2-二亚油酰-3-二甲基氨基丙烷(dlindap)，1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)，1-亚油酰-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)，1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin-tma.c1)，1,2-二亚油酰-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin-tap.c1)，1,2-二亚油基氧基-3-(n-甲基哌嗪并)丙烷(dlin-mpz)或者3-(n,n-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(dlinap)，3-(n,n-二油基氨基)-1,2-丙二醇(doap)，1,2-二亚油基氧基-3-(2-n,n-二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin-eg-dma)，1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma),2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-dma)或其类似物，(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-双((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢--3ah-环戊[d][1,3]并二氧-5-胺，(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯或其混合物。

除了以上具体描述的那些之外，在生理ph附近带有净正电荷的其他阳离子脂质也可被包括在脂质纳米颗粒中。这样的阳离子脂质包括但不限于n,n-二油基-n,n-二甲基铵氯化物(“dodac”)；n-(2,3-二油酰氧基)丙基-n,n-n-三乙基铵氯化物(“dotma”)；n,n-二硬脂基-n,n-二甲基铵溴化物(“ddab”)；n-(2,3-二油酰氧基)丙基-n,n,n-三甲基铵氯化物(“dotap”)；1,2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(“dotap.cl”)；3.β.-(n--(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“dc-chol”)，n-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-n,n-二甲基铵三氟乙酸盐(“dospa”)，双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(“dogs”)，1,2-二油酰基-sn-3磷酸乙醇胺(“dope”)，1,2-二油酰-3-二甲基铵丙烷(“dodap”)，n,n-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(“dodma”)以及n-(1,2-二肉豆蔻酰氧基-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基铵溴化物(“dmrie”)。

“两亲性脂质”是指任何合适的材料，其中脂质材料的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。这样的化合物包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。代表性磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或者二亚油基磷脂酰胆碱。

本发明所描述的脂质纳米颗粒可包括不同比例的阳离子脂质、中性脂质、固醇和peg修饰的脂质。

可将治疗剂掺入sna。这些治疗剂包括但不限于小分子、蛋白质、核酸、气体(例如no)、染料、维生素、营养物、抗生素、抗真菌剂，以及抗病毒剂、化疗剂、类固醇、激素、磁性或顺磁颗粒、包囊治疗药物、前药或分子、水溶性或水不溶性分子，以及蛋白质，包括内涵体中起作用的蛋白质，特别是与内涵体贮积疾病相关联的蛋白质。

脂质体/lipoplex也可构建成包含其他表面元件，包括但不限于：适配体(aptamer)、抗体、蛋白质、肽、脂质衍生物；小分子以及磁性/顺磁颗粒。这些也可用于各种目的。

能够由本文所描述的各种cpg寡核苷酸来构建寡核苷酸壳。优选的cpg寡核苷酸是单链脱氧核糖核酸。然而，寡核苷酸也可以是核糖核酸以及掺入了本领域已知的一个或多个修饰的其他单链寡核苷酸，双链脱氧核糖核酸、核糖核酸以及掺入了本领域已知的一个或多个修饰的其他双链寡核苷酸，掺入了脱氧核糖核酸、核糖核酸或掺入了本领域已知的一个或多个修饰的寡核苷酸的寡核苷酸三链。这些寡核苷酸可以是也可以不是与蛋白质、多聚体或者包括鱼精蛋白在内的载体预先复合的。

在一些实施方案中，寡核苷酸壳具有25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个寡核苷酸或其任意范围组合的密度。在其他实施方案中，寡核苷酸壳具有1-10,000、1-9,000、1-8,000、1-7,000、1-6,000、1-5,000、1-4,000、1-3,000、1-2,000、1-1,000、5-10,000、5-9,000、5-8,000、5-7,000、5-6,000、5-5,000、5-4,000、5-3,000、5-2,000、5-1,000、100-10,000、100-9,000、100-8,000、100-7,000、100-6,000、100-5,000、100-4,000、100-3,000、100-2,000、100-1,000、500-10,000、500-9,000、500-8,000、500-7,000、500-6,000、500-5,000、500-4,000、500-3,000、500-2,000、500-1,000、10-10,000、10-500、50-10,000、50-300或50-250的密度。

在一些实施方案中，寡核苷酸壳的寡核苷酸是结构上相同的寡核苷酸。在其他实施方案中，寡核苷酸壳的寡核苷酸具有至少两种结构上不同的寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸壳的寡核苷酸具有2-50、2-40、2-30、2-20或2-10种不同的核苷酸序列。

在一些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的寡核苷酸位于纳米结构表面上。

在一些实施方案中，寡核苷酸形成寡核苷酸壳。当脂质体核外表面至少10％的可用表面区域都包括寡核苷酸时，寡核苷酸壳就形成了。在一些实施方案中，脂质体外表面至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的可用表面区域都包括寡核苷酸。寡核苷酸壳的寡核苷酸可朝向各个方向。在一些实施方案中，寡核苷酸放射状朝向外部。

在一些实施方案中，寡核苷酸壳中至少10％的寡核苷酸都通过脂质锚定基团连接到纳米颗粒上。脂质锚是由能够将寡核苷酸或核酸插入并锚定到脂质膜上的疏水基团所组成的。在一些实施方案中，寡核苷酸壳中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的寡核苷酸都通过脂质锚定基团连接到脂质纳米颗粒上。在一些实施方案中，脂质锚定基团是胆固醇。在其他实施方案中，脂质锚定基团是固醇、棕榈酰基、二棕榈酰基、硬脂酰基、二硬脂酰基、c16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸盐、油酰石胆酸、油酰胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、诸如类固醇之类的类异戊二烯、诸如维生素e之类的维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯或者本领域已知的其他脂质。

术语“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用来意指连接到磷酸基团和可交换性有机碱基上的多核苷酸(即包含糖(例如核糖或脱氧核糖)的分子)，该碱基是取代嘧啶(例如胞嘧啶(c)，胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))或者取代嘌呤(例如腺嘌呤(a)或鸟嘌呤(g))。因此，该术语涵盖了dna和rna寡核苷酸两者。该术语也应包括多聚核苷(即缺少磷酸的核苷酸)以及包含任意其他有机碱基的聚合物。寡核苷酸能够从现有核酸来源(例如基因组或cdna)获得，但优选合成的(例如通过核酸合成来产生)。术语“核苷”包括共价连接到糖部分的碱基，糖部分优选核糖或脱氧核糖。术语“核苷酸”包括还包含了磷酸基团或磷酸类似物的核苷。

本发明相关的寡核苷酸能够在诸如糖部分、磷酸二酯连接和/或碱基处进行修饰。如本文所使用的“糖部分”包括天然的未修饰糖，包括戊糖、核糖和脱氧核糖，以及修饰糖和糖类似物。糖部分的修饰能够包括用卤素、杂原子或脂肪族基团取代羟基，以及能够包括羟基官能化为例如醚、胺或巯基。

糖部分的修饰能够包括2’-o-甲基核苷酸，它被称为“甲基化”。在一些例子中，本发明相关的寡核苷酸可以仅包含修饰或未修饰的糖部分，而在其他例子中，寡核苷酸包含一些修饰的糖部分和一些未修饰的糖部分。

在一些例子中，修饰的核苷酸包括糖或主链修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。修饰的核糖或脱氧核糖核苷酸能够包含非天然产生的碱基，诸如5’-位修饰的尿苷或胞苷，例如5’-(2-氨基)丙基尿苷以及5’-溴尿苷；8-位修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；deaza核苷酸，例如7-deaza-腺苷；以及n-烷基核苷酸，例如n6-甲基腺苷。此外，糖修饰的核糖核苷酸的2’-oh基团能够被h、烷氧基(或or)、r或烷基、卤素、sh、sr、氨基(诸如nh2、nhr、nr2,)或cn基团取代，其中r是低级烷基、烯基或炔基。在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸连接相邻核糖核苷酸的磷酸二酯基团能够被诸如硫代磷酸酯基团之类的修饰基团取代。

修饰的糖能够包括d-核糖、2’-o-烷基(包括2’-o-甲基和2’-o-乙基)即2’-烷氧基、2’-氨基、2’-s-烷基、2’-卤素(包括2’-氟)、2’-甲氧乙氧基、2’-烯丙氧基(-och2ch＝ch2)、2’-炔丙基、2’-丙基、2’胺基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基等等。糖部分也能够是己糖。

术语“疏水修饰”是指总疏水性增加并且碱基仍能形成接近常规沃森-克里克相互作用的碱基修饰。碱基修饰的非限制性例子包括5-位尿苷和胞苷修饰，如苯基、4-吡啶基、2-吡啶基、吲哚基以及异丁基、苯基(c6h5oh)；色氨酰基((c8h6n)ch2ch(nh2)co)、异丁基、丁基、氨基苯基；苯基以及萘基修饰。

在一些方面，本发明的寡核苷酸包含3’和5’末端。寡核苷酸的3’和5’末端基本上能够防止核酸酶，例如通过修饰3’或5’连接(例如美国专利号5,849,902和wo98/13526)。寡核苷酸能够通过包含“封闭基团”(“blockinggroup”)来获得抗性。本文所使用的术语“封闭基团”是指能够连接到寡核苷酸或核苷单体(nucleomonomer)上作为合成用保护基团或偶联基团(fitc、丙基(ch2-ch2-ch3)、乙二醇(-o-ch2-ch2-o-)、磷酸盐(po3^2-)、氢膦酸或亚磷酰胺)的取代基(例如除oh基团之外的)。“封闭基团”也包括保护寡核苷酸5’和3’末端的“末端封闭基团”或“核酸外切酶封闭基团”，包括修饰的核苷酸和非核苷酸的核酸外切酶抗性结构。

示例性末端封闭基团包括帽子结构(例如7-甲基鸟苷帽子)，例如带有3’-3’或5’-5’末端反转(参见例如ortiagao等.1992.antisenseres.dev.2:129)的反向核苷单体、甲基膦酸、亚磷酰胺、2’→5’核苷酸间连接的非核苷酸基团(例如非核苷酸接头、氨基酸接头、缀合物)等等。3’末端核苷酸能够包含修饰的糖部分。3’末端核苷酸包含的3’-o能够可选地被防止寡核苷酸3’-核酸外切酶降解的封闭基团所取代。例如，能够通过3’→3’核苷酸间连接将3’-羟基酯化到核苷酸上。例如，烷氧基能够是甲氧基、乙氧基或丙氧基且优选乙氧基。可选地，3’-末端的3’→3’连接的核苷酸能够通过取代连接进行连接。为减少核酸酶降解，最5’的3’→5’连接能够是修饰的连接，例如硫代磷酸酯连接或对烷氧基磷酸三酯连接。优选地，两个最5’的3’→5’连接是修饰的连接。可选地，5’末端羟基部分能够被诸如磷酸、硫代磷酸酯或对乙氧基磷酸之类的含磷部分所酯化。

在一些方面，寡核苷酸能够包含dna和rna两者。

在一些方面，寡核苷酸的至少一部分是通过诸如硫代磷酸酯连接之类的取代连接而连接的。取代连接的存在能够改善药代动力学，这是由于它们对血清蛋白的更高亲和性。

寡核苷酸的表面密度可取决于核的尺寸和类型以及寡核苷酸的长度、序列和浓度。能够通过经验来确定足以使纳米颗粒稳定的表面密度以及获得它所希望的纳米颗粒和寡核苷酸组合所需的条件。一般而言，至少100个寡核苷酸/颗粒的表面密度将足以提供稳定的核-寡核苷酸缀合物。优选地，表面密度是至少5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,200、1,400、1,600、1,800、2,000、5,000或10,000个寡核苷酸/纳米颗粒。

根据本发明的另一方面，提供了刺激免疫应答的方法。该方法包括将包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna以有效诱导受试者免疫应答的量给予受试者。优选地，cpg免疫刺激性寡核苷酸是经口服、局部、在缓释装置中、粘膜、全身、肠胃外、鼻内、眼内或肌内给药的。当将包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna给药到粘膜表面时，它可以以有效诱导粘膜免疫应答或全身免疫应答的量被递送。

本文所描述化合物的受试者剂量通常在约0.1μg到10,000mg的范围，更为典型的是约1μg/天到8000mg的范围，最典型的是约10μg到100μg的范围。按照受试者体重表示的话，通常的剂量范围是每次给药约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重，到约1000mg/kg/体重或更多，以及可从其中推导出的任意范围。在由本文所列举数字可推导范围的非限制性例子中，约5mg/kg/体重到约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重到约500毫克/kg/体重等范围都是基于上述数字能够进行给药的。绝对量将取决于各种因素，包括同期治疗、剂量数以及包括年龄、身体状况、身高和体重在内的个体患者参数。这些都是本领域普通技术人员所公知的因素，不需要超过常规的实验就能够处理。一般优选使用最大剂量，也就是根据合理医学判断的最高安全剂量。

本公开的其他方面提供了用于治疗癌症的方法，包括经静脉、瘤内或皮下注射将本文所描述的发明给予患有癌症的受试者。

在一些实施方案中，该方法包括将受试者暴露给抗原，其中免疫应答是抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，抗原选自肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原和肽抗原。在其他实施方案中，将抗原掺入到包含cpg寡核苷酸的sna中。

包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna能够激发广谱免疫应答。例如，这些包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna能够用来将th2改变为th1免疫应答。cpg免疫刺激性寡核苷酸也可用于激活免疫细胞，诸如淋巴细胞(例如b细胞和t细胞)、树突状细胞和nk细胞。激活能够在体内、体外或离体进行，即通过从受试者分离免疫细胞，将免疫细胞与活化免疫细胞有效量的cpg免疫刺激性寡核苷酸相接触，并将活化的免疫细胞重新给予受试者。在一些实施方案中，树突状细胞提呈癌抗原。能够将树突状细胞离体暴露给癌抗原。

由包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna所产生的免疫应答还可导致诱导细胞因子产生，例如il-6、il-8、il-12、il-18、tnf、ifn-α、趋化因子和ifn-γ的产生。

在另一实施方案中，包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna适用于治疗癌症。根据本发明的其他方面，cpg免疫刺激性寡核苷酸也适用于有发展成癌症风险的受试者的癌症预防(例如降低癌症发生风险)。癌症可选自胆道癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、上皮内肿瘤、b细胞和t细胞淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、黑色素瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、甲状腺癌和肾癌、卵巢癌、以及其他癌(carcinoma)和肉瘤。在一些重要实施方案中、癌症选自骨癌、脑和中枢神经系统癌、结缔组织癌、食管癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、喉癌、口腔癌、黑色素瘤和其他皮肤癌以及睾丸癌。

可选地当cpg免疫刺激性寡核苷酸与抗癌治疗联合给药时，包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna也可用于增加癌症细胞对癌症治疗(例如抗癌治疗)的应答性。抗癌治疗可以是化疗、基于疫苗(例如体外致敏树突状细胞疫苗或癌抗原疫苗)或抗体的治疗。该后一治疗也可包括给予例如癌细胞的细胞表面抗原特异性抗体，其中免疫应答产生了抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)。在一个实施方案中，抗体可选自ributaxin、herceptin、quadramet、keytruda、opdivo、bexxar、vectibix、arzerra、yervoy、zevalin、darzalex、erbitux、adcetris、avastin、campath、panorex、idec-y2b8、bec2、c225、oncolym、smartm195、atragen、ovarex、bexxar、ldp-03、iort6、mdx-210、mdx-11、mdx-22、ov103、3622w94、抗vegf、zenapax、mdx-220、mdx-447、melimmune-2、melimmune-1、ceacide、pretarget、novomab-g2、tnt、gliomab-h、gni-250、emd-72000、lymphocide、cma676、monopharm-c、4b5、ioregf.r3、iorc5、babs、抗flk-2、mdx-260、anaab、smart1d10ab、smartabl364ab、immurait-cea，其他抗癌抗体，包括刺激免疫系统的检查点抑制剂或抗体。在一些实施方案中，可将癌症治疗掺入sna。

因此，根据本发明的一些方面，给予患有癌症或有癌症风险的受试者cpg免疫刺激性寡核苷酸和抗癌治疗。在一些实施方案中，抗癌治疗选自化疗剂、免疫治疗剂、检查点抑制剂、免疫系统激动剂、抗体片段、双特异性抗体和癌症疫苗。

检查点抑制剂抑制选自ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合的检查点蛋白。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是bms-936558(纳武单抗(nivolumab))。在另一实施方案中，检查点抑制剂是抗ctla-4抗体。在其他实施方案中，抗ctla-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)。

免疫系统激动剂可选自激动cd27、cd28、b7.1、cd137、cd137l、ox40、ox40l、hven和gitr的化合物。

本发明其他方面涉及用于预防受试者中疾病的方法。该方法包括定期给予受试者包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna来促进免疫系统应答性，以预防受试者中的疾病。试图使用本发明的预防性方法来预防的疾病或病症的例子包括微生物感染(例如性传播疾病)和食物过敏所致变应性休克。

在其他方面，本发明是用于诱导固有免疫应答的方法，其通过给予受试者有效量的用于激活固有免疫应答的包含cpg免疫刺激性寡核苷酸的sna。

根据本发明另一方面，提供了用于治疗或预防病毒或逆转录病毒感染的方法。该方法包括给予患有病毒或逆转录病毒感染或者有病毒或逆转录病毒感染风险的受试者有效量的用于治疗或预防病毒或逆转录病毒感染的本发明任意组合物。在一些实施方案中，病毒是由乙肝病毒、丙肝病毒之类的肝炎病毒，hiv，疱疹病毒或乳头瘤病毒所引起的。

根据本发明另一方面，提供了用于治疗或预防细菌感染的方法。该方法包括给予患有细菌感染或有细菌感染风险的受试者有效量的用于治疗或预防细菌感染的本发明任意组合物。在一个实施方案中，细菌感染是由于胞内细菌。

另一方面，本发明是用于治疗或预防寄生虫感染的方法，其通过给予患有寄生虫感染或有寄生虫感染风险的受试者有效量的用于治疗或预防寄生虫感染的本发明任意组合物。在一个实施方案中，寄生虫感染是由于胞内寄生虫。在另一实施方案中，寄生虫感染是由于非肠虫性寄生虫。

在一些实施方案中，受试者是人类，在其他实施方案中，受试者是选自狗、猫、马、奶牛、猪、火鸡、山羊、鱼、猴子、鸡、大鼠、小鼠和绵羊的非人脊椎动物。

另一方面，本发明涉及用于诱导th1免疫应答的方法，其通过给予受试者有效量的本发明任意组合物以产生th1免疫应答。

本发明并不限于其在以下描述中所阐述的或在附图中所显示的组件结构和排列细节中的应用。本发明能够是其他实施方案并以各种方式实施或执行。此外，本文所使用的措辞和术语都是为了说明目的，不应视为限制性的。“包括”、“包含”(“including”、“comprising”)或者“具有”、“含有”、“包括”(“having”、“containing”、“involving”)及其在本文中变体的使用，都是为了包括其后所列举的项目及其等价物以及额外项目。

使用不超过常规的实验，本领域技术人员就将认识到或者能够确认本文所描述的发明具体实施方案的许多等效方案。打算通过以下权利要求来包括这些等效方案。

本文所披露的包括专利文献在内的所有参考文献都通过引用以其整体并入。

实施例

基于核酸的新型tlr9激动剂的表征

背景

球形核酸(sna)包含放射状朝向球形脂双层上的紧密包装的寡核苷酸。该结构赋予sna独特性能，包括与线性寡核苷酸相比增强了的细胞摄取和内涵体受体活化动力学。

描述了sna形式的基于核酸的tlr9激动剂的特征。使用人pbmc为报告细胞在小鼠体内表征了不同cpg基序长度和不同cpg基序数量的寡核苷酸。不同于线性cpg寡核苷酸，测试了sna形式的短至12-聚体的cpg寡核苷酸，都发现它们活化了tlr9而不需要5’-tcg基序。tlr9激动剂sna保留了对tlr9的高特异性，增加了摄取进入人pbmc，并诱导与线性cpg寡核苷酸相比增加了的th1型细胞因子。在全身给药后的小鼠中观察到了很强的细胞因子诱导。sna结构降低了对合成tlr9激动剂寡核苷酸的长度和基序的要求，而不会削弱tlr9特异性，并增加了细胞摄取。sna的这些独特性质凸显了免疫刺激性sna用于治疗应用的实用性。

结果

报告细胞中的nf-κb活化

在源自人ramosb淋巴细胞和小鼠raw巨噬细胞的nf-κb报告细胞系中评估了核酸的tlr9刺激活性(表1)。sna构建体比线性形式的相同序列更强。在作为线性寡核苷酸时，由于更短长度(例如参见序列6)或缺少5’tcg(例如参见序列2和序列4)而弱刺激tlr9的序列，在作为sna时就是高活性了。sna形式的b类和c类cpg两者都是有活性的。为确认nf-κb活化是tlr9依赖的，在没有外源tlr表达(空(null))或者稳定转化表达人tlr9、小鼠tlr9、人tlr3、人tlr7或人tlr8的hek细胞系中进行了同样的实验。只有表达tlr9的细胞系对cpg寡核苷酸治疗产生了应答。

表1：tlr9依赖的nf-κb活化

n.d.＝未确定

在空、htlr3、htlr7或htlr8报告细胞系中未发现活化

人pbmc中的细胞因子应答

使用培养的人外周血单核细胞(hpbmc)制作了核酸的人细胞因子应答模型。在用基于核酸的tlr9激动剂处理之后，定量了hpmbc培养物上清中的细胞因子水平(表2)。sna构建体比线性形式的相同序列更强。更短长度(例如参见序列6、序列9和序列14)或缺少5’tcg(例如参见序列4和序列5)的序列在作为sna时就比作为线性寡核苷酸更有活性。短至12nt(参见序列9)的序列在作为sna时是高活性的。sna形式的a类、b类和c类cpg都是有活性的。

表2：人pbmc中的细胞因子应答

n.d.＝未确定

人pbmc中的寡核苷酸摄取

通过流式细胞术评估了由人pbmc所摄取的荧光标记核酸(图1)。当与线性寡核苷酸相比时，更高比例的细胞摄取了sna，并且在摄取寡核苷酸的细胞中，每个细胞摄取了更多sna。

体内细胞因子应答

在小鼠中经皮下注射cpg寡核苷酸之后，观察到了sna比线性寡核苷酸更高的血清细胞因子水平(图2)。

材料和方法

sna制备。合成带有硫代磷酸酯(ps)核苷酸间连接的dna寡核苷酸。对于sna形式的dna寡核苷酸，将胆固醇部分(3’-chol)通过两个六乙二醇(sp18)部分连接到3’末端。以100的寡核苷酸/脂质体的比例将sna化合物功能化到50nmdopc脂质体上(lsna)。

报告细胞中的nf-κb活化。在生长培养基中培养nf-κb报告细胞(人ramosb淋巴细胞、小鼠raw巨噬细胞、人tlr9-hek、小鼠tlr9-hek、null1-hek、人tlr3-hek、人tlr7-hek和人tlr8-hek；invivogen)，生长培养基是由dmem、4.5g/l葡萄糖、10％(v/v)胎牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素、100μg/mlnormocin、100μg/mlzeocin、10μg/ml灭瘟素(blasticidin)、2mml-谷氨酰胺所组成的。将细胞培养物于37℃和5％co2下贮存于corning的t75培养瓶(无热源聚苯乙烯)中。加入核酸之后24小时的时候，使用quantiblue试剂(invivogen)评估nf-κb活化。将160μl的quantiblue加入到无菌96孔板的每个孔中，并将40μl的细胞上清加入其对应孔中来获得200μl总体积。一旦所有测试化合物铺板完毕，就将板置于37℃和5％co2的培养箱中30分钟。30分钟孵育期之后，每15分钟检查颜色进展。在使用标准曲线作为参比显色之后，使用荧光酶标仪(synergy4)读取板650nm处的吸收值。

人pbmc中的细胞因子应答。为进行人外周血单核细胞(pbmc)培养，从zenbio和allcells购买了血沉棕黄层(buffycoat)。使用氯化铵进一步处理血沉棕黄层以裂解并除去红细胞。细胞在采集之后24小时之内现用。在补充rpmi生长培养基(带有酚红(corning)，4.5g/l葡萄糖，10％(v/v)胎牛血清，50u/ml青霉素和50mg/ml链霉素的rpmi)中于37℃和5％co2下培养pbmc。加入核酸之后24小时的时候，使用多重细胞因子elisa试剂盒(quansys)评估pbmc培养物上清中的细胞因子水平。使用试剂盒中提供的样品稀释液制备标准曲线。使用样品稀释液将从转染细胞收集的上清1:2稀释。将50μl的标准品和样品添加到q-plex96孔板中。将板密封并置于摇床上(500rpm和20℃)1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤板3次。将50μl的检测混合物添加到每个孔中。再次将板密封并置于摇床上(500rpm和20℃)1小时。然后再洗涤板3次。将50μl的链霉亲和素-hrp1x添加到每个孔中，将板密封并返回到摇床上(500rpm和20℃)15分钟。在该时间段内制备混合底物，小心防止uv光。然后洗涤板6次。将50μl的底物混合物添加到每个孔中，使用q-viewls成像仪在15分钟内读板。

人pbmc中的寡核苷酸摄取。如上所述培养人pbmc。用标记fitc的寡核苷酸处理pbmc，24小时之后，使用流式细胞术评估寡核苷酸摄取。

体内细胞因子应答。将参考b类cpg(人)线性寡核苷酸或sna经皮下注射到10周龄雄性c57bl/6小鼠中。注射后四小时，采集全血并处理成血清。使用如上所述的多重细胞因子elisa试剂盒评估细胞因子。

寡核苷酸序列

表3.

“*”表示硫代磷酸酯键，“/isp18/”表示六乙二醇间隔物，

“/3cholteg/”表示胆固醇亚磷酰胺，"/fluort/"表示缀合fitc的t

等效方案

使用不超过常规的实验，本领域技术人员就将认识到或者能够确认本文所描述的本发明具体实施方案的许多等效方案。打算通过所附权利要求书来包括这些等效方案。

本文所披露的包括专利文献在内的所有参考文献都通过引用以其整体并入。

序列表

<110>埃克西奎雷股份有限公司

<120>球形核酸tlr9激动剂

<130>a1107.70013wo00

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<141>与此同时

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