包含修饰核苷的寡核苷酸的制作方法

本申请主张2016年7月1日提交的美国临时申请第62/357,623号和2016年12月21日提交的美国临时申请第62/437,592号的优先权益，所述临时申请各自以引用的方式整体并入本文中来达成任何目的。序列表本申请含有序列表，所述序列表已以ascii格式以电子方式提交并且以引用的方式整体并入本文。所述ascii副本创建于2017年6月15日，名称为01137-0020-00pct_sl.txt且大小为21,863位元。本公开大体涉及包含修饰核苷的寡核苷酸领域，诸如能够结合靶标分子的适配体。在一些实施方案中，本发明涉及包含超过一种类型的碱基修饰核苷的寡核苷酸，诸如适配体，以及制备和使用所述适配体的方法。发明背景修饰核苷已用作治疗剂、诊断剂并用于并入至寡核苷酸中以改进其特性(例如稳定性)。selex(用于指数富集的配体系统进化)为用于鉴别选择性地结合靶标分子的寡核苷酸(称作适配体)的方法。所述selex方法描述于例如美国专利第5,270,163号中。所述selex方法涉及从寡核苷酸的随机混合物中选择和鉴别寡核苷酸以实际上实现结合亲和力和选择性的任何所需标准。通过将特定类型的修饰核苷引入至在所述selex方法的过程中鉴别的寡核苷酸中，可改变核酸酶稳定性、静电荷、亲水性或亲脂性以提供寡核苷酸的三维结构和靶标结合能力的差异。技术实现要素：在一些实施方案中，提供包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶不同。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过koddna聚合酶并入。在一些实施方案中，所述适配体结合选自pcsk9、psma、erbb1、erbb2、fxn、kdm2a、igflr、pigf1r、a1-抗胰蛋白酶、cd99、mmp28和ppib的靶标蛋白。在一些实施方案中，所述适配体在所述适配体的5’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。在一些实施方案中，与具有相同长度和包含替代第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶和/或替代第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体具有改进的核酸酶稳定性。在一些实施方案中，与具有相同长度和包含替代第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶或替代第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体在人类血清中具有更长半衰期。在一些实施方案中，提供一种包含多种多核苷酸的组合物，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶不同。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在各多核苷酸的5’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在所述多核苷酸的3’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、色胺酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过koddna聚合酶并入。在一些实施方案中，所述组合物的各多核苷酸包含无规区域。在一些实施方案中，所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。在一些实施方案中，提供一种组合物，其包含第一适配体、第二适配体和靶标，其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物；并且其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过koddna聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶和所述第四5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，第三5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且第四5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，第三5位修饰胞嘧啶核苷选自bndc、pedc、ppdc、napdc、2napdc、nedc、2nedc和tyrdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自bndu、napdu、pedu、ibdu、fbndu、2napdu、nedu、mbndu、bfdu、btdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述靶标选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。在一些实施方案中，提供一种方法，其包括：(a)使能够结合靶标分子的适配体与样品接触；(b)用所述样品孵育所述适配体以允许适配体-靶标复合物形成；(c)在所述样品中富集所述适配体-靶标复合物，以及(c)检测所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的存在，其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的所述检测指示所述靶标分子存在于所述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；其中所述适配体为本文所提供的双重修饰适配体。在一些实施方案中，所述方法包括至少一个选自以下的额外步骤：将竞争分子添加至所述样品中；在固体支撑物上捕捉所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。在一些实施方案中，所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。在一些实施方案中，所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。在一些实施方案中，葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。在一些实施方案中，所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。在一些实施方案中，所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、唾液、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。在一些实施方案中，提供一种用于检测样品中的靶标的方法，所述方法包括a)使所述样品与第一适配体接触以形成混合物，其中所述第一适配体能够结合所述靶标以形成第一复合物；b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；c)使所述混合物与第二适配体接触，其中所述第二适配体能够结合所述第一复合物以形成第二复合物；d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；e)检测所述混合物中第一适配体、第二适配体、靶标、第一复合物或第二复合物的存在或不存在，其中第一适配体、第二适配体、靶标、第一复合物或第二复合物的存在指示所述靶标存在于所述样品中；其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶，或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过koddna聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶和所述第四5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，第三5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且第四5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，第三5位修饰胞嘧啶核苷选自bndc、pedc、ppdc、napdc、2napdc、nedc、2nedc和tyrdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自bndu、napdu、pedu、ibdu、fbndu、2napdu、nedu、mbndu、bfdu、btdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。在一些实施方案中，所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物。在一些实施方案中，提供一种用于鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体的方法，所述方法包括：(a)使适配体的文库与所述靶标分子接触以形成混合物，并且允许形成适配体-靶标复合物，其中当适配体对所述靶标分子具有亲和力时，所述适配体-靶标复合物形成；(b)从所述混合物的剩余部分分配所述适配体-靶标复合物(或富集所述适配体-靶标复合物)；(c)解离所述适配体-靶标复合物；以及(d)鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体；其中所述适配体的文库包含多种多核苷酸，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。在一些实施方案中，使所述一种或多种能够结合靶标分子的适配体扩增。在一些实施方案中，所述混合物包含聚阴离子竞争分子。在一些实施方案中，所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。在一些实施方案中，葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。在一些实施方案中，所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在各多核苷酸的5’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在所述多核苷酸的3’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过koddna聚合酶并入。在一些实施方案中，各多核苷酸包含无规区域。在一些实施方案中，所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸为结合靶标的适配体，并且其中所述文库包含至少1000种适配体，其中各适配体包含不同核苷酸序列。在一些实施方案中，提供结合pcsk9蛋白的适配体。在一些所述实施方案中，所述适配体包含序列5’-ygpppg-3’，其中各y为tyrdu并且各p为napdc。在一些实施方案中，所述适配体还包含序列5’-yeayganpap-3’，其中e选自y、a和g；并且n为0或1。在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，序列5’-yeayganpap-3’位于序列5’-ygpppg-3’的5’。在一些实施方案中，e为y。在一些实施方案中，提供结合pcsk9的适配体，其中所述适配体包含序列5’-fnpppaagrjrprppwm-3’(seqidno：81)，其中f选自r和g；各r独立地选自g和a；j选自r和a；w选自r、g和a；n为0或1；m为0或1；r为ppdc；并且p为napdu。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，f为r。在一些实施方案中，j为r。在一些实施方案中，w为g。在一些实施方案中，提供一种结合pcsk9的适配体，其中所述适配体包含序列5’-ttppggpp-3’，其中各p为napdc。在一些实施方案中，结合pcsk9的适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。在一些实施方案中，所述适配体抑制pcsk9结合ldl-r。在一些实施方案中，所述适配体抑制pcsk9结合ldl-r，其中ic50小于30nm、小于20nm或小于15nm。在一些实施方案中，提供一种降低受试者中的胆固醇的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合pcsk9的适配体。在一些实施方案中，结合pcsk9的适配体为本文所提供的适配体。在一些实施方案中，所述胆固醇为低密度脂蛋白(ldl)胆固醇(ldl-c)。在一些实施方案中，所述受试者患有杂合家族性高胆固醇血症或临床动脉粥样硬化性心血管疾病(cvd)。本发明的前述内容和其他目标、特征和优势将由以下实施方式变得更明显，所述实施方式参考附图继续进行。附图简述图1。用含有c5位修饰尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷三磷酸酯的dna文库修饰的核酸适配体的选择。具有两种修饰碱基的选择的示意图。其中使用30n随机化化学合成的主反义生物素化模板文库通过引物延伸反应酶促合成多个修饰和未修饰文库的选择方法的概述。图2。使用多个修饰文库产生的40聚体(30n+5+5)适配体对pcsk9的结合亲和力。具有≥1nm的亲和力的适配体以灰色阴影突出显示并且以320nm亲和力显示的适配体表示在结合曲线上在32nm最高浓度下无可检测结合。各文库上的黑线指示关于该文库中的所有适配体的中值。图3。关于单一修饰du或dc对比具有du的两种修饰dc的亲和力和拷贝拷贝数百分比。各点表示具有在y轴上显示的亲和力值和其在x轴上的拷贝数百分比的适配体之一。红点为单一修饰适配体并且绿点(空心和填充)为两种修饰适配体。填充绿点表示一些nap-dc/tyr-du和pp-dc/tyr-du适配体。图4a-4b。单一碱基修饰和两种碱基修饰适配体的可截短性。(a)所有高亲和力40聚体序列均进一步截短至其无规区域长度的30聚体，仅从各5’和3’末端移除5个核苷酸。保持或具有改进的对pcsk9的结合亲和力的适配体的百分比在y轴上绘制曲线。(b)来自每种个别文库的单一碱基修饰和两种碱基修饰适配体的亲和力比较和可截短性。具有≥1nm的亲和力的适配体以灰色阴影突出显示，最高平均亲和力是针对具有pp-dc与pp-du、nap-du和tyr-du的两种修饰碱基组合的适配体。图5。来自各文库的三种高亲和力适配体对其他原蛋白转化酶(pc)的靶标结合特异性。对于总计三十三种适配体(40聚体)进行溶液亲和力测量，其中十一种适配体具有单一修饰碱基(即，三种适配体具有nap-dc/dt；三种适配体具有dc/nap-du；三种适配体具有dc/pp-du并且两种适配体具有dc/ty-du)并且二十二种适配体具有双重修饰碱基(亦即，三种适配体具有nap-dc/nap-du；三种适配体具有nap-dc/pp-du；三种适配体具有nap-dc/moe-du；三种适配体具有nap-dc/tyr-du；三种适配体具有pp-dc/pp-du；三种适配体具有pp-dc/nap-du；三种适配体具有pp-ty-du，并且一种适配体具有pp-dc/moe-du)。在100nm亲和力处的虚线下方的适配体指示在100nm浓度下无可检测结合。未测试与剩余pc(pcsk5、pcsk6和pcsk8)的亲和力。图6。单一碱基和两种碱基修饰适配体的物种交叉反应性。单一修饰(三种适配体)和两种修饰(38种适配体)的截短30聚体适配体(kd值≤1nm)与来自人类、猴、小鼠和大鼠的pcsk9的亲和力。单一修饰的适配体结合人类和猴pscks9，但不结合小鼠或大鼠pskc9。相比之下，两种修饰的适配体结合人类、猴、小鼠和大鼠。来自各物种的pcsk9蛋白的同一性百分比相对于人类psck9提供。图7a-7c。在基于珠粒的分析中的夹心对筛选。(a)适配体夹心对筛选的示意图。(b)在10nmpcsk9浓度下与在缓冲液中不具有蛋白质的情况相比显示大于或等于50倍的信号的夹心对。所述夹心分析中测试的所有适配体均为kd≤1nm的40聚体。总计70对显示≥50倍的信号。当各对的各适配体选自单一修饰文库时，鉴别三种夹心对(3种夹心适配体对/3种单一碱基修饰文库)。相比之下，当各对的一种适配体选自三种单一碱基修饰文库并且所述对的另一适配体选自四种双重碱基修饰文库时，鉴别22种夹心对(即，22种夹心适配体对/3种单一碱基修饰文库和4种双重碱基修饰文库)并且当各对的两种适配体均选自双重修饰文库时，鉴别45种夹心对(45种夹心适配体对/5种双重碱基修饰文库)。(c)关于源于具有单一碱基修饰适配体的捕捉适配体文库和具有单一碱基修饰适配体的检测适配体文库；具有单一碱基修饰适配体的捕捉适配体文库和具有两种碱基修饰适配体的检测适配体文库；以及具有两种碱基修饰适配体的捕捉适配体文库和具有两种碱基修饰适配体的检测适配体文库的靶标蛋白pcsk9的夹心对数目的比较。图8a-8d。在基于珠粒的分析中显示pcsk9浓度依赖性信号的夹心对。(a)用与所选二次或检测适配体配对的表现最好的捕捉或一次适配体观察浓度依赖性信号。(b)用与所选一次或捕捉适配体配对的表现最好的二次或检测适配体观察浓度依赖性信号。(c)主要夹心对dc/pp-du适配体(一次)和nap-dc/nap-du适配体(二次)，当所述适配体的取向转换时显示信号。(d)用重组野生型pcsk9和功能获得型突变体pcsk9d374y获得的标准曲线。用检测野生型pcsk9(圆形)和功能获得型突变体pcsk9d374y(三角形)蛋白的夹心对获得线性浓度依赖性信号。图9a-9b。夹心测定的敏感性：适配体夹心测定(dc/pp-du适配体(一次)和nap-dc/nap-du适配体(二次))的效能显示在缓冲液中pcsk9浓度的检测限。(a)用具有约80pg/ml(lloq)的定量下限的适配体夹心测定观察线性浓度依赖性信号。(b)用具有约10ng/ml(uloq)的定量上限的适配体夹心测定观察线性浓度依赖性信号。图10。使用dc/pp-du适配体(一次)和nap-dc/nap-du适配体(二次)的夹心测定的稀释线性。图11。所述夹心测定包含一次单一碱基修饰适配体和二次两种碱基修饰适配体(dc/pp-du适配体(一次)和nap-dc/nap-du适配体(二次))。图12。野生型hepg2细胞中pcsk9的过度表达。图13。基于板的体外pcsk9抑制测定：用适配体抑制pcsk9的示意图。图14。关于单一碱基或两种碱基修饰适配体的抑制筛选。图15a-15b。物种交叉反应性潜在治疗性的两种碱基修饰适配体。(a)30聚体两种碱基修饰(pp-dc/nap-du)啮齿动物交叉反应性适配体(11733-44，seqidno：44)与人类pcsk9(经填充蓝色圆形)、人类功能获得型突变体pcsk9d374y(经填充红色圆形)、恒河猴pcsk9(经填充绿色正方形)、大鼠pcsk9(经填充粉色六边形)、小鼠pcsk9(经填充倒三角形)的亲和力以及混合型对照适配体(空心黑色菱形)。(b)物种交叉反应性潜在治疗性的两种碱基修饰适配体显示对pcsk9与ldl-r相互作用的抑制。适配体潜在地以2.1nm的ec50值(蓝色经填充圆形)抑制pcsk9与ldl-r相互作用并且以3.6nm的ec50值(红色经填充三角形)抑制pcsk9d374y并且混合型对照适配体显示对野生型pcsk9(绿色经填充正方形)和功能获得型突变体pcsk9d374y(空心黑色正方形)无抑制。图16。ldl-摄取逆转测定的示意图。图17。物种交叉反应性pp-dc/nap-du适配体通过阻断pcsk9与ldl-r相互作用而抑制ldl-r降解并且增加hepg2细胞表面上的ldl-r水平。通过活性soma聚体(红色圆形)，关于ldl-摄取逆转的ec50值为13.5nm，这用具有相同序列的混合型对照物(蓝色三角形)未观察到。图18。单一修饰和双重修饰适配体在90％人类血清中随时间的稳定性。单一c-5修饰或双重c-5修饰适配体的修饰模式用图例提供(例如x/y，其中x表示dc(未修饰核苷酸)、napdc(nap)或ppdc(pp)；并且y表示du或dt(未修饰核苷酸、tyrdu(tyr)、napdu(nap)、ppdu(pp)或moedu(moe))。图19a-19c。40聚体(30n+5+5)适配体与使用多种修饰文库产生的erbb2(a)、erbb3(b)和psma(c)的结合亲和力。具有≥1nm的亲和力的适配体以灰色阴影突出显示并且以320nm亲和力显示的适配体表示在结合曲线上在32nm最高浓度下无可检测结合。各文库上的黑线指示关于该文库中的所有适配体的中值。图20。可并入适配体中的某些示例性5位修饰尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷。图21。可存在于尿嘧啶核苷的5位处的某些示例性修饰。所述c-5修饰的化学结构包括连接所述修饰至尿嘧啶核苷的5位的示例性酰胺键。所示的5位部分包括苯甲基部分(例如bn、pe和pp)、萘基部分(例如nap、2nap、ne)、丁基部分(例如ibu)、氟苯甲基部分(例如fbn)、酪氨酰基部分(例如tyr)、3，4-亚甲基二氧基苯甲基(例如mbn)、吗啉代部分(例如moe)、苯并呋喃基部分(例如bf)、吲哚部分(例如trp)和羟丙基部分(例如thr)。图22。可存在于胞嘧啶核苷的5位处的某些示例性修饰。所述c-5修饰的化学结构包括连接所述修饰至胞嘧啶核苷的5位的示例性酰胺键。所示的5位部分包括苯甲基部分(例如bn、pe和pp)、萘基部分(例如nap、2nap、ne和2ne)和酪氨酰基部分(例如tyr)。实施方式除非另外注明，否则技术术语根据常规用法使用。分子生物学中的常见术语的定义可见于benjaminlewin，genesv，由oxforduniversitypress公布，1994(isbn0-19-854287-9)；kendrew等人(编)，theencyclopediaofmolecularbiology，由blackwellscienceltd.公布，1994(isbn0-632-02182-9)；以及roberta.meyers(编)，molecularbiologyandbiotechnology：acomprehensivedeskreference，由vchpublishers，inc.公布，1995(isbn1-56081-569-8)中。除非另外解释，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有如本领域普通技术人员通常所理解的相同意义。除非本文另外清楚地指示，否则单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括多个提及物。“包含a或b”意指包括a、或b、或a和b。应进一步理解，关于核酸或多肽给出的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸、以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并且为了描述而提供。此外，本文所提供的范围应理解为关于所述范围内的所有值的速记。例如，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或子范围(以及其分数，除非本文另外清楚地规定)。除非另外指示，否则任何浓度范围、百分率范围、比率范围或整数范围均应理解为包括在所陈述的范围内的任何整数值并且当适当时，包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另外指示，否则本文中关于任何物理特征(诸如聚合物亚基、尺寸或厚度)所陈述的任何数字均应理解为包括在所陈述的范围内的任何整数。除非另外指示，否则如本文所用，“约”或“基本上由......组成”意指所指示的范围、值或结构的±20％。如本文所用，术语“包括”和”包含”为开放式并且同义使用。尽管与本文所述的那些类似或相等的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但下文描述合适方法和材料。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其他参考文献均以引用的方式整体并入。在有冲突的情况下，则将以本说明书(包括术语的解释)为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性的并且不意图为限制性的。如本文所用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸，或其修饰形式，以及其类似物。核苷酸包括包含嘌呤(例如腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)的物质。除非另外特定地指示，否则如本文所用，术语“胞嘧啶核苷”一般地用于指包含胞嘧啶碱基的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或修饰核糖核苷酸。术语“胞嘧啶核苷”包括2’-修饰胞嘧啶核苷，诸如2’-氟、2’-甲氧基等。类似地，除非另外特定地指示，否则术语“修饰胞嘧啶核苷”或特定修饰胞嘧啶核苷也是指包含修饰胞嘧啶碱基的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或修饰核糖核苷酸(诸如2’-氟、2’-甲氧基等)。除非另外特定地指示，否则术语“尿嘧啶核苷”一般地用于是指包含尿嘧啶碱基的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或修饰核糖核苷酸。术语“尿嘧啶核苷”包括2’-修饰尿嘧啶核苷，诸如2’-氟、2’-甲氧基等。类似地，除非另外特定地指示，否则术语“修饰尿嘧啶核苷”或特定修饰尿嘧啶核苷也是指包含修饰尿嘧啶碱基的核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或修饰核糖核苷酸(诸如2’-氟、2’-甲氧基等)。如本文所用，术语“5位修饰胞嘧啶核苷”或“c-5修饰胞嘧啶核苷”是指在胞嘧啶核苷的c-5位处具有修饰的胞嘧啶核苷，例如如图20所示。非限制性示例性5位修饰胞嘧啶核苷包括图22中所示的那些。非限制性示例性5位修饰胞嘧啶核苷包括但不限于5-(n-苯甲基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“bndc”并且显示于图21中)；5-(n-2-苯基乙基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“pedc”并且显示于图21中)；5-(n-3-苯基丙基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“ppdc”并且显示于图21中)；5-(n-1-萘基甲基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“napdc”并且显示于图21中)；5-(n-2-萘基甲基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“2napdc”并且显示于图21中)；5-(n-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“nedc”并且显示于图21中)；5-(n-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作“2nedc”并且显示于图21中)；以及5-(n-酪氨酰基甲酰胺)-2′-去氧胞嘧啶核苷(称作tyrdc并且显示于图21中)。在一些实施方案中，所述c5修饰胞嘧啶核苷(例如，呈其三磷酸酯形式)能够通过聚合酶(例如koddna聚合酶)并入寡核苷酸中。本文所述的c-5修饰胞嘧啶核苷的化学修饰也可与单独或呈任何组合的2′位糖修饰(例如2’-o-甲基或2’-氟)、在环外胺处的修饰和4-硫代胞嘧啶核苷的取代及其类似修饰组合。如本文所用，术语“c-5修饰尿嘧啶核苷”或“5位修饰尿嘧啶核苷”是指在尿嘧啶核苷的c-5位处具有修饰的尿嘧啶核苷(典型地去氧尿嘧啶核苷)，例如如图20所示。在一些实施方案中，所述c5修饰尿嘧啶核苷(例如，呈其三磷酸酯形式)能够通过聚合酶(例如koddna聚合酶)并入寡核苷酸中。非限制性示例性5位修饰尿嘧啶核苷包括图21中所示的那些。非限制性示例性5位修饰尿嘧啶核苷包括：5-(n-苯甲基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(bndu)，5-(n-苯乙基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(pedu)，5-(n-硫代苯基甲基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(thdu)，5-(n-异丁基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(ibudu)，5-(n-酪氨酰基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(tyrdu)，5-(n-3，4-亚甲基二氧基苯甲基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(mbndu)，5-(n-4-氟苯甲基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(fbndu)，5-(n-3-苯基丙基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(ppdu)，5-(n-咪唑基乙基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(imdu)，5-(n-色氨基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(trpdu)，5-(n-r-苏氨酰基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(thrdu)，5-(n-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷氯化物，5-(n-萘基甲基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(napdu)，5-(n-[1-(2，3-二羟基丙基)]甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷)，5-(n-2-苯基甲基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(2napdu)，5-(n-1-萘基乙基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(nedu)，5-(n-2-萘基乙基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(2nedu)，5-(n-3-苯并呋喃基乙基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(bfdu)，5-(n-3-苯并噻吩基乙基甲酰胺)-2′-去氧尿嘧啶核苷(btdu)。本文所述的c-5修饰尿嘧啶核苷的化学修饰也可与单独或呈任何组合的2′位糖修饰(例如2’-o-甲基或2’-氟)、在环外胺处的修饰和4-硫代尿嘧啶核苷的取代及其类似修饰组合。如本文所用，术语“修饰(modify)”、“修饰(modified)”、“修饰(modification)”及其任何变化形式当参考寡核苷酸使用时意指寡核苷酸的四种组成性核苷酸碱基中的至少一种(即，a、g、t/u和c)为天然存在的核苷酸的类似物或酯。在一些实施方案中，修饰核苷酸向寡核苷酸赋予核酸酶抗性。额外修饰可包括主链修饰、甲基化、不常见碱基配对组合(诸如异碱基异胞嘧啶核苷和异胍)及其类似修饰。修饰还可包括3′和5′修饰，诸如加帽。其他修饰可包括用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如像具有不带电键的那些(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电键的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、具有嵌入剂的那些(例如，吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷基化剂的那些以及具有修饰键的那些(例如，α异头核酸等)。此外，通常存在于核苷酸的糖上的任何羟基均可通过膦酸酯基或磷酸酯基置换；通过标准保护基保护；或被活化以制备额外核苷酸或固体支撑物上的额外键。5′和3′端oh基团可被磷酸化或用胺、具有约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一个实施方案中介于约10至约80kda范围内的聚乙二醇(peg)聚合物、在另一个实施方案中介于约20至约60kda范围内的peg聚合物或其他亲水性或疏水性生物或合成聚合物取代。如本文所用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指示核苷酸的聚合物并且包括dna、rna、dna/rna杂合物和这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰，其中包括多种实体或部分与核苷酸单元在任何位置处的连接。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸为比术语适配体更宽泛的术语并且因此，术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括作为适配体的核苷酸聚合物，但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于适配体。多核苷酸也可含有本领域中一般已知的核糖或去氧核糖的类似形式，包括2′-o-甲基、2′-o-烯丙基、2′-o-乙基、2′-o-丙基、2′-o-ch2ch2och3、2′-氟、2′-nh2或2′-叠氮基、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构体糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷酸类似物(诸如甲基核糖苷)。如本文所注，一种或多种磷酸二酯键可由替代连接基团置换。这些替代连接基团包括如下实施方案，其中磷酸酯由p(o)s(“硫代酯”)、p(s)s(“二硫代酯”)、(o)nrx2(“酰胺化物”)、p(o)rx、p(o)orx′、co或ch2(“甲缩醛”)置换，其中各rx或rx′独立地为h或任选地含有醚(-o-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的取代或未取代烷基(c1-c20)。并非多核苷酸中的所有键均需要相同。糖、嘌呤和嘧啶的类似形式的取代可有利于设计最终产物，例如，如替代性主链结构(像聚酰胺主链)也可如此。多核苷酸也可含有碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构体糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷酸类似物(诸如甲基核糖苷)的类似形式。若果存在核苷酸结构的修饰，则其可在聚合物的组装之前或之后给予。核苷酸序列可由非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合之后进一步修饰，诸如通过与标记组分结合。如本文所用，术语“至少一种核苷酸”当提及核酸的修饰时是指所述核酸中的一种、数种或全部核苷酸，指示核酸中的任何或全部a、c、t、g或u的任何或全部出现可为修饰或未修饰的。如本文所用，“核酸配体”、“适配体”、“soma聚体”和“克隆”可互换使用以指示对靶标分子具有所需作用的非天然存在核酸。所需作用包括但不限于结合靶标、催化改变靶标、以修饰或改变靶标或靶标的功能活性的方式与靶标反应、共价连接至靶标(如在自杀性抑制剂中)、以及促进靶标与另一分子之间的反应。在一个实施方案中，所述作用为对靶标分子的特异性结合亲和力，此靶标分子为除通过独立于watson/crick碱基配对或三螺旋形成的机制结合适配体的多核苷酸之外的三维化学结构，其中所述适配体并非具有由靶标分子结合的已知生理学功能的核酸。给定靶标的适配体包括通过如下方法由核酸的候选混合物鉴别的核酸，其中所述适配体为靶标的配体，所述方法包括：(a)使候选混合物与靶标接触，其中相对于候选混合物中的其他核酸对靶标具有增加的亲和力的核酸可从候选混合物的剩余部分分配；(b)从候选混合物的剩余部分分配亲和力增加的核酸；以及(c)扩增亲和力增加的核酸以生成核酸的配体富集混合物，由此鉴别靶标分子的适配体。应认识到亲和力相互作用为程度问题；然而，在此背景下，适配体对其靶标的“特异性结合亲和力”意指所述适配体一般以比其结合混合物或样品中的其他、非靶标组分高得多的亲和力程度结合其靶标。“适配体”、“soma聚体”或“核酸配体”为一种类型或种类的具有特定核苷酸序列的核酸分子的拷贝集合。适配体可包括任何合适数目的核苷酸。“适配体”是指分子的超过一种此类集合。不同的适配体可具有相同或不同数目的核苷酸。适配体可为dna或rna并且可为单链、双链或含有双链或三链区域。在一些实施方案中，适配体使用如本文所述或本领域中已知的selex方法制备。如本文所用，“soma聚体”或缓慢解离速率修饰适配体是指具有改进的解离速率特征的适配体。soma聚体可使用标题为“methodforgeneratingaptamerswithimprovedoff-rates”的美国专利第7,947,447号中所述的改进的selex方法产生。如本文所用，包含两种不同类型的5位修饰嘧啶或c-5修饰嘧啶的适配体可称作“双重修饰适配体”、具有“两种修饰碱基”的适配体、具有“两种碱基修饰”或“两种修饰碱基”的适配体、具有“双重修饰碱基”的适配体，其均可互换使用。适配体的文库或适配体文库也可使用相同术语。因此，在一些实施方案中，适配体包含两种不同的5位修饰嘧啶，其中所述两种不同的5位修饰嘧啶选自napdc和napdu、napdc和ppdu、napdc和moedu、napdc和tyrdu、napdc和thrdu、ppdc和ppdu、ppdc和napdu、ppdc和moedu、ppdc和tyrdu、ppdc和thrdu、napdc和2napdu、napdc和trpdu、2napdc和napdu、和2napdc和2napdu、2napdc和ppdu、2napdc和trpdu、2napdc和tyrdu、ppdc和2napdu、ppdc和trpdu、ppdc和tyrdu、tyrdc和tyrdu、trydc和2napdu、tyrdc和ppdu、tyrdc和trpdu、tyrdc和tyrdu、以及tyrdc和tyrdu。在一些实施方案中，适配体包含至少一种修饰尿嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶核苷和至少一种修饰胞嘧啶核苷，其中所述至少一种修饰尿嘧啶核苷和/或胸腺嘧啶核苷在5位处用选自萘基部分、苯甲基部分、氟苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3，4-亚甲基二氧基苯甲基部分、苯并噻吩基部分以及苯并呋喃基部分的部分修饰，并且其中所述至少一种修饰胞嘧啶核苷在5位处用选自萘基部分、酪氨酰基部分和苯甲基部分的部分修饰。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。如本文所用，包含单一类型的5位修饰嘧啶或c-5修饰嘧啶的适配体可称作“单一修饰适配体”、具有“单一修饰碱基”的适配体、具有“单一碱基修饰”或“单一修饰碱基”的适配体，其均可互换使用。适配体的文库或适配体文库也可使用相同术语。如本文所用，“蛋白”与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义使用。“纯化”多肽、蛋白、肽或肽片段实质上不含细胞材料或来自获得氨基酸序列的细胞、组织或无细胞来源的其他污染蛋白，或当以化学方式合成时实质上不含化学前体或其他化学品。在某些实施方案中，适配体包含第一5位修饰嘧啶和第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶在所述第一5位修饰嘧啶的5位处包含酪氨酰基部分，并且所述第二5位修饰嘧啶在所述第二5位修饰嘧啶的5位处包含萘基部分或苯甲基部分。在一个相关实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为尿嘧啶。在一个相关实施方案中，所述第二5位修饰嘧啶为胞嘧啶。在一个相关实施方案中，所述适配体的尿嘧啶的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％在5位处被修饰。在一个相关实施方案中，所述适配体的胞嘧啶的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％在5位处被修饰。修饰核苷酸在某些实施方案中，本发明提供包含两种不同类型的碱基修饰核苷酸的寡核苷酸，诸如适配体。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含两种不同类型的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一种c5修饰胞嘧啶核苷和至少一种c5修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含两种不同的c5修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含两种不同的c5修饰尿嘧啶核苷。非限制性示例性c5修饰尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷显示于例如下式i中和图20中。某些非限制性示例性c5修饰尿嘧啶核苷显示于图21中，并且某些非限制性示例性c5修饰胞嘧啶核苷显示于图22中。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一种式i嘧啶：其中r独立地为-(ch2)n-，其中n为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；rx1独立地选自由以下组成的组：其中，＊表示rx1基团与-(ch2)n-基团的连接点；并且其中，rx4独立地选自由以下组成的组：支链或直链低级烷基(c1-c20)；羟基；卤素(f、cl、br、i)；腈(cn)；硼酸(bo2h2)；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx2)；伯酰胺(conh2)；仲酰胺(conhrx2)；叔酰胺(conrx2rx3)；磺酰胺(so2nh2)；n-烷基磺酰胺(sonhrx2)；rx2和rx3在每次出现时独立地选自由以下组成的组：支链或直链低级烷基(c1-c20)；苯基(c6h5)；rx4取代的苯环(rx4c6h4)，其中rx4定义于上文中；羧酸(cooh)；羧酸酯(coorx5)，其中rx5为支链或直链低级烷基(c1-c20)；以及环烷基，其中rx2和rx3一起形成取代或未取代的5元或6元环；x独立地选自由以下组成的组：-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3、nh2和-叠氮基；r′独立地选自由以下组成的组：-h、-oac；-obz；-p(nipr2)(och2ch2cn)；以及-osime2tbu；r″独立地选自由氢、4，4′-二甲氧基三苯甲基(dmt)和三磷酸酯(-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)-o-p(o)(oh)2)或其盐组成的组；z独立地选自由-h、取代或未取代c(1-4)烷基组成的组；和其盐。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含图21中所示的至少一种修饰嘧啶，其中各x独立地选自-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3、nh2和-叠氮基。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含图22中所示的至少一种修饰嘧啶，其中各x独立地选自-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3、nh2和-叠氮基。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含图21中所示的至少一种修饰嘧啶和图22中所示的至少一种修饰嘧啶，其中各x独立地选自-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3、nh2和-叠氮基。某些非限制性示例性修饰嘧啶对在本文所述的实施例中示出。在一些实施方案中，寡核苷酸包含图20中所示的至少一种修饰嘧啶，其中所述核糖的2’位置独立地选自-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3、nh2和-叠氮基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含图20中所示的至少两种修饰嘧啶，其中所述核糖的2’位独立地选自-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3、nh2和-叠氮基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含图20中所示的至少一种修饰嘧啶和图21或图22中所示的至少一种修饰嘧啶，其中核糖的2’位独立地选自-h、-oh、-ome、-o-烯丙基、-f、-oet、-opr、-och2ch2och3、nh2和-叠氮基。某些非限制性示例性修饰嘧啶对在本文所述的实施例中示出。在任何本文所述的实施方案中，所述寡核苷酸可为适配体。在一些此类实施方案中，所述寡核苷酸为特异性结合靶标多肽的适配体。制备寡核苷酸寡去氧核苷的自动化合成在许多实验室中为常规实践(参见例如matteucci，m.d.和caruthers，m.h.，(1990)j.am.chem.soc.，103：3185-3191，其内容由此以引用的方式整体并入)。寡核糖核苷的合成也为熟知的(参见例如scaringe，s.a.等人，(1990)nucleicacidsres.18：5433-5441，其内容由此以引用的方式整体并入)。如本文所注，亚磷酰胺适用于通过化学合成将修饰核苷并入寡核苷酸中，并且三磷酸酯适用于通过酶促合成将修饰核苷并入寡核苷酸中。(参见例如vaught，j.d.等人(2004)j.am.chem.soc.，126：11231-11237；vaught，j.v.等人(2010)j.am.chem.soc.132，4141-4151；gait，m.j.“oligonucleotidesynthesisapracticalapproach”(1984)irlpress(oxford，uk)；herdewijn，p.“oligonucleotidesynthesis”(2005)(humanapress，totowa，n.j.(其各自以引用的方式整体并入本文中)。selex方法术语selex和selex方法在本文中可互换使用以一般地是指(1)以所需方式(例如以高亲和力结合蛋白)与靶标分子相互作用的核酸的选择，与(2)那些所选核酸的扩增的组合。所述selex方法可用于鉴别对特定靶标分子或生物标记物具有高亲和力的适配体。selex一般地包括制备核酸的候选混合物、使所述候选混合物结合所需靶标分子以形成亲和力复合物、分离所述亲和力复合物与未结合候选核酸、分离和离析核酸与所述亲和力复合物、纯化核酸、以及鉴别特定适配体序列。所述方法可包括多轮以进一步细化所选适配体的亲和力。所述方法可在所述方法的一个或多个点处包括扩增步骤。参见例如标题为“nucleicacidligands”的美国专利第5,475,096号。所述selex方法可用于产生共价结合其靶标的适配体以及非共价结合其靶标的适配体。参见例如标题为“systematicevolutionofnucleicacidligandsbyexponentialenrichment：chemi-selex”的美国专利第5,705,337号。所述selex方法可用于鉴别含有修饰核苷酸的高亲和力适配体，所述核苷酸对适配体赋予改进特征，例如像改进的体内稳定性或改进的递送特征。此类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置处的化学取代。selex方法鉴别的含有修饰核苷酸的适配体描述于标题为“highaffinitynucleicacidligandscontainingmodifiednucleotides”的美国专利第5,660,985号中，所述专利描述含有在嘧啶的5′和2′位置处以化学方式修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利第5,580,737号(参见上文)描述含有用2′-氨基(2′-nh2)、2′-氟(2′-f)和/或2′-o-甲基(2′-ome)修饰的一种或多种核苷酸的高度特异性适配体。还参见标题为“selexandphotoselex”的美国专利申请公开第20090098549号，所述公开描述具有扩展的物理和化学特性的核酸文库以及其在selex和光交联selex中的用途。selex也可用于鉴别具有所需解离速率特征的适配体。参见标题为“methodforgeneratingaptamerswithimprovedoff-rates”的美国专利第7,947,447号，所述专利以引用的方式整体并入本文中，其描述用于产生可结合靶标分子的适配体的改进selex方法。描述了用于产生具有较慢的与其相应靶标分子解离的速率的适配体和光适配体的方法。所述方法涉及使候选混合物与靶标分子接触、允许发生核酸-靶标复合物的形成、以及执行缓慢解离速率富集方法，其中具有快速解离速率的核酸-靶标复合物解离且不会再形成，而具有缓慢解离速率的复合物保持完整。另外，所述方法包括在候选核酸混合物的产生中使用修饰核苷酸以产生具有改进解离速率性能的适配体(参见标题为“selexandphotoselex”的美国专利第8,409,795号)。(还参见美国专利第7,855,054号和美国专利公开第20070166740号)。这些申请各自以引用的方式整体并入本文中。“靶标”或“靶标分子”或“靶标”在本文中是指核酸可以所需方式起作用的任何化合物。靶标分子可为而不限于蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多醣、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、毒性物质、底物、代谢物、过渡状态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养素、生长因子、细胞、组织、前述任一者的任何部分或片段等。事实上任何化学或生物效应子均可为合适靶标。具有任何尺寸的分子均可充当靶标。靶标也可以某些方式修饰以增强靶标与核酸之间的相互作用的可能性或强度。靶标也可包括特定化合物或分子的任何微小变化，诸如在蛋白的情况下，氨基酸序列的微小变化、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合，其不会实质上改变分子身份。“靶标分子”或“靶标”为一种类型或种类的能够结合适配体的分子或多分子结构的拷贝的集合。“靶标分子”或“靶标”是指分子的超过一种此类集合。其中靶标为肽的selex方法的实施方案描述于标题为“modifiedselexprocesseswithoutpurifiedprotein”的美国专利第6,376,190号中。在一些实施方案中，靶标为蛋白。如本文所用，“竞争分子”或“竞争剂”可互换使用以指示可与非靶标分子形成非特异性复合物的任何分子。在此背景中，非靶标分子包括游离适配体，其中例如竞争剂可用于抑制所述适配体非特异性结合(再结合)另一非靶标分子。“竞争分子”或“竞争剂”为一种类型或种类的分子的拷贝的集合。“竞争分子”或“竞争剂”是指分子的超过一种此类集合。竞争分子包括但不限于寡核苷酸、聚阴离子(例如肝素、鲱精dna、鲑鱼精dna、trna、硫酸葡聚糖、葡聚糖、无碱基磷酸二酯聚合物、dntp和焦磷酸盐)。在多个实施方案中，可使用一种或多种竞争剂的组合。如本文所用，“非特异性复合物”是指除适配体之外的两种或更多种分子与其靶标分子之间的非共价缔合。非特异性复合物表示分子类别之间的相互作用。非特异性复合物包括在适配体与非靶标分子、竞争剂与非靶标分子、竞争剂与靶标分子、以及靶标分子与非靶标分子之间形成的复合物。如本文所用，术语“缓慢解离速率富集方法”是指一种改变候选混合物的某些组分的相对浓度，使得具有缓慢解离速率的适配体亲和力复合物的相对浓度相对于具有较快、不太希望的解离速率的适配体亲和力复合物的浓度有所增加的方法。在一个实施方案中，所述缓慢解离速率富集方法为基于溶液的缓慢解离速率富集方法。在此实施方案中，基于溶液的缓慢解离速率富集方法在溶液中发生，使得混合物中形成适配体亲和力复合物的靶标和核酸均未在所述缓慢解离速率富集方法期间固定于固体支撑物上。在多个实施方案中，所述缓慢解离速率富集方法可包括一个或多个步骤，包括添加竞争分子和用竞争分子孵育、稀释混合物或这些步骤的组合(例如，在竞争分子存在下稀释混合物)。因为缓慢解离速率富集方法的效应一般取决于不同适配体亲和力复合物(即，在靶标分子与候选混合物中的不同核酸之间形成的适配体亲和力复合物)的不同解离速率，所以选择所述缓慢解离速率富集方法的持续时间以便保持高比例的具有缓慢解离速率的适配体亲和力复合物，同时实质上降低具有快速解离速率的适配体亲和力复合物的数目。所述缓慢解离速率富集方法可在selex方法期间以一个或多个循环使用。当稀释和添加竞争剂组合使用时，其可同时或以任何次序依序执行。当混合物中的总靶标(蛋白)浓度低时，可使用所述缓慢解离速率富集方法。在一个实施方案中，当所述缓慢解离速率富集方法包括稀释时，所述混合物可尽量可行地加以稀释，注意将适配体保持的核酸回收用于selex方法中的后续循环。在一个实施方案中，所述缓慢解离速率富集方法包括使用竞争剂以及稀释，从而允许所述混合物以低于不使用竞争剂时可能所必需的程度加以稀释。在一个实施方案中，所述缓慢解离速率富集方法包括添加竞争剂，并且所述竞争剂为聚阴离子(例如肝素或硫酸葡聚糖(葡聚糖))。肝素或葡聚糖已在先前selex选择中用于鉴别特定适配体。然而，在此类方法中，肝素或葡聚糖在其中靶标和适配体结合形成复合物的平衡步骤期间存在。在此类方法中，因为肝素或葡聚糖的浓度增加，所以高亲和力靶标/适配体复合物与低亲和力靶标/适配体复合物的比率增加。然而，高浓度的肝素或葡聚糖可由于在核酸与竞争剂之间竞争靶标结合而降低平衡时高亲和力靶标/适配体复合物的数目。相比之下，目前描述的方法在已允许靶标/适配体复合物形成之后添加竞争剂并且因此不会影响所形成的复合物的数目。在平衡结合已在靶标与适配体之间发生之后添加竞争剂会产生非平衡状态，其适时发展为具有较少靶标/适配体复合物的新平衡。在新平衡已实现之前捕捉靶标/适配体复合物会富集用于缓慢解离速率适配体的样品，因为快速解离速率复合物将首先解离。在另一个实施方案中，聚阴离子竞争剂(例如硫酸葡聚糖或另一聚阴离子材料)用于所述缓慢解离速率富集方法以有利于鉴别抵抗聚阴离子存在的适配体。在此背景中，“聚阴离子抵抗性适配体”为能够形成相比包含非聚阴离子抵抗性适配体的适配体/靶标复合物不太可能在也含有所述聚阴离子抵抗性材料的溶液中解离的适配体/靶标复合物的适配体。以此方式，聚阴离子抵抗性适配体可用于执行分析方法以检测样品中靶标的存在或量或浓度，其中所述检测方法包括使用适配体所抵抗的聚阴离子材料(例如硫酸葡聚糖)。因此，在一个实施方案中，提供一种用于产生聚阴离子抵抗性适配体的方法。在此实施方案中，在核酸的候选混合物与靶标接触之后。允许靶标与候选混合物中的核酸到达平衡。引入聚阴离子竞争剂并且使其在溶液中孵育一个时间段以确保所述候选混合物中的大多数快速解离速率适配体与靶标分子解离。而且，候选混合物中可在聚阴离子竞争剂存在下解离的适配体将从靶标分子释放。所述混合物被分配以离析已保持与靶标分子缔合的高亲和力、缓慢解离速率适配体并且从溶液中移除任何未复合材料。所述适配体可接着从靶标分子释放并且被离析。离析适配体也可被扩增并且应用额外数轮选择以增加所选适配体的总体性能。如果缓慢解离速率适配体的选择不是特定应用所需要的，则此方法也可与最少孵育时间一起使用。因此，在一个实施方案中，提供一种修改的selex方法以鉴别或产生具有缓慢(长)解离速率的适配体，其中靶标分子和候选混合物接触并且一起孵育一个时间段，所述时间段足以在靶标分子与候选混合物中所含的核酸之间发生平衡结合。在平衡结合之后，过量竞争分子(例如，聚阴离子竞争剂)添加至混合物中并且所述混合物与过量竞争分子一起孵育一个预定时间段。大部分具有低于此预定孵育时间段的解离速率的适配体将在所述预定孵育时间段期间从靶标解离。这些“快速”解离速率适配体与靶标的再缔合由于过量可非特异性结合靶标并占据靶标结合位点的竞争分子而减至最少。大部分具有较长解离速率的适配体将在所述预定孵育时间段期间保持复合至靶标。在孵育时间段结束时，从所述混合物的剩余部分分配核酸-靶标复合物会允许分离缓慢解离速率适配体的群体与具有快速解离速率的那些群体。解离步骤可用于解离缓慢解离速率适配体与其靶标并且允许对靶标分子具有高亲和力和特异性的缓慢解离速率适配体(个别适配体或一组缓慢解离速率适配体)离析、鉴别、测序、合成和扩增。如同常规selex，从一轮修改的selex方法鉴别的适配体序列可用于合成新的候选混合物，使得接触、平衡结合、添加竞争分子、与竞争分子一起孵育和分配缓慢解离速率适配体的步骤在必要时可重做/重复许多次。在添加竞争剂之前允许候选混合物与靶标平衡结合、随后添加过量竞争剂和与所述竞争剂一起孵育一个预定时间段的组合允许选择解离速率远大于先前所实现的那些的适配体群体。为了实现平衡结合，所述候选混合物可与靶标一起孵育至少约5分钟、或至少约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时或约6小时。在必要时可选择竞争分子与候选混合物和靶标分子的混合物的预定孵育时间段，应考虑各因素，诸如靶标性质和已知适配体对靶标的已知解离速率(如果有的话)。预定孵育时间段可选自：至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时。在其他实施方案中，稀释用作解离速率增强方法并且稀释候选混合物、靶标分子/适配体复合物的孵育可进行一个预定时间段，所述时间段可选自：至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时。本公开的实施方案涉及缓慢解离速率适配体的鉴别、产生、合成和用途。这些适配体为如下适配体，其与非共价适配体-靶标复合物解离的速率(t1/2)高于通过常规selex通常获得的适配体的解离速率。关于含有适配体和靶标的非共价复合物的混合物，t1/2表示一半适配体从适配体-靶标复合物解离所用的时间。根据本公开的缓慢解离速率适配体的t1/2选自以下之一：大于或等于约30分钟；在约30分钟与约240分钟之间；在约30分钟至约60分钟之间；在约60分钟至约90分钟之间；在约90分钟至约120分钟之间；在约120分钟至约150分钟之间；在约150分钟至约180分钟之间；在约180分钟至约210分钟之间；在约210分钟至约240分钟之间。通过selex程序鉴别的适配体的表征性特征为其对其靶标的高亲和力。适配体对其靶标的解离常数(kd)将选自以下之一：小于约1μm、小于约100nm、小于约10nm、小于约1nm、小于约100pm、小于约10pm、小于约1pm。寡核苷酸文库在一些实施方案中，提供包含无规序列的寡核苷酸文库。此类文库可在一些实施方案中适用于执行selex。在一些实施方案中，寡核苷酸文库的各寡核苷酸包含许多随机化位置，诸如至少20、25、30、35、40、45、或50、或20-100、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40或30-40个随机化位置。在一些实施方案中，寡核苷酸文库的各寡核苷酸包含侧接所述随机化位置的固定序列。此类固定侧接序列可彼此相同或不同(即，5’侧接序列和3’侧接序列可相同或不同)，并且在一些实施方案中可对于所述文库的所有成员均相同(即，所述文库的所有成员可具有相同5’侧接序列，和/或所述文库的所有成员可具有相同3’侧接序列)。在一些实施方案中，所述随机化位置可由四种或更多种不同核苷酸碱基构成，所述核苷酸碱基中的一种或多种为修饰的。在一些实施方案中，一种类型的核苷酸碱基全部是修饰或未修饰的(例如，所述随机化区域中的所有胞嘧啶核苷或修饰，或全部未修饰)。在一些实施方案中，所述随机化区域中一种类型的核苷酸碱基以修饰和未修饰形式存在。在一些此类实施方案中，所述随机化位置由两种修饰和两种未修饰核苷酸碱基构成。在一些此类实施方案中，所述随机化位置由腺嘌呤、鸟嘌呤、c5修饰胞嘧啶核苷和c5修饰尿嘧啶核苷构成。非限制性示例性c5修饰胞嘧啶核苷和c5修饰尿嘧啶核苷示出在图19至21中。寡核苷酸文库及其制备方法进一步描述于例如本文的实施例中。示例性适配体在一些实施方案中，提供结合靶标分子的适配体。在一些实施方案中，靶标分子为靶标蛋白。在一些实施方案中，提供结合pcsk9的适配体。在一些实施方案中，结合pcsk9的适配体抑制pcsk9与ldl-r的结合。在一些此类实施方案中，所述适配体包含序列5’-ygpppg-3’，其中各y为tyrdu并且各p为napdc。在一些实施方案中，所述适配体还包含序列5’-yeayganpap-3’，其中e选自y、a和g；并且n为0或1。在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，序列5’-yeayganpap-3’位于序列5’-ygpppg-3’的5’。在一些实施方案中，e为y。在一些实施方案中，提供结合pcsk9的适配体，其中所述适配体包含序列5’-fnpppaagrjrprppwm-3’(seqidno：81)，其中f选自r和g；各r独立地选自g和a；j选自r和a；w选自r、g和a；n为0或1；m为0或1；r为ppdc；并且p为napdu。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，f为r。在一些实施方案中，j为r。在一些实施方案中，w为g。在一些实施方案中，提供一种结合pcsk9的适配体，其中所述适配体包含序列5’-ttppggpp-3’，其中各p为napdc。在一些实施方案中，结合pcsk9的适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。在一些实施方案中，所述适配体抑制pcsk9与ldl-r的结合。在一些实施方案中，所述适配体抑制pcsk9与ldl-r的结合，其中ic50小于30nm、小于20nm或小于15nm。在一些实施方案中，提供一种降低受试者中的胆固醇的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合pcsk9的适配体。在一些实施方案中，结合pcsk9的适配体为本文所提供的适配体。在一些实施方案中，所述胆固醇为低密度脂蛋白(ldl)胆固醇(ldl-c)。在一些实施方案中，所述受试者患有杂合家族性高胆固醇血症或临床动脉粥样硬化性心血管疾病(cvd)。盐制备、纯化和/或处理所述化合物的对应盐(例如，药学上可接受的盐)可为便利的或需要的。药学上可接受的盐的实例论述于berge等人(1977)“pharmaceuticallyacceptablesalts”j.pharm.sci.66：1-19中。例如，如果所述化合物为阴离子性的，或具有可为阴离子性的官能基(例如，-cooh可为-coo-)，则可与合适阳离子形成盐。合适无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子(诸如na+和k+)、碱土金属阳离子(诸如ca2+和mg2+)和其他阳离子(诸如al+3)。合适有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即，nh4+)和取代的铵离子(例如nh3rx+、nh2rx2+、nhrx3+、nrx4+)。一些合适取代的铵离子的实例为衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苯甲胺、苯基苯甲胺、胆碱、甲葡胺和氨丁三醇，以及氨基酸(诸如赖氨酸和精氨酸)。常见季铵离子的实例为n(ch3)4+。如果所述化合物为阳离子性的，或具有可为阳离子性的官能基(例如，-nh2可为-nh3+)，则可与合适阴离子形成盐。合适无机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。合适有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡糖庚酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲烷磺酸、黏液酸、油酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、苯磺酸和戊酸。合适聚合物有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下聚合物酸的那些：鞣酸、羧甲基纤维素。除非另外规定，否则对特定化合物的提及亦包括其盐形式。某些非限制性示例性实施方案实施方案1.一种包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。实施方案2.如实施方案1所述的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。实施方案3.如实施方案1所述的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。实施方案4.如实施方案2或实施方案3所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。实施方案5.如实施方案2至4中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。实施方案6.如实施方案2至5中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。实施方案7.如实施方案2至6中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案8.如实施方案1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。实施方案9.如实施方案1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。实施方案10.如实施方案8或实施方案9所述的适配体，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。实施方案11.如实施方案1至10中任一项所述的适配体，其中所述适配体结合选自pcsk9、psma、erbb1、erbb2、fxn、kdm2a、igf1r、pigf1r、a1-抗胰蛋白酶、cd99、mmp28和ppib的靶标蛋白。实施方案12.如实施方案1至11中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的5’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。实施方案13.如实施方案1至12中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。实施方案14.如实施方案1至13中任一项所述的适配体，其中所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。实施方案15.一种包含多种多核苷酸的组合物，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。实施方案16.如实施方案15所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。实施方案17.如实施方案16所述的组合物，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。实施方案18.如实施方案15至17中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。实施方案19.如实施方案18所述的组合物，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。实施方案20.如实施方案15至19中任一项所述的组合物，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。实施方案21.如实施方案15至19中任一项所述的组合物，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。实施方案22.如实施方案20或实施方案21所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。实施方案23.如实施方案20至22中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。实施方案24.如实施方案20至23中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。实施方案25.如实施方案20至24中任一项的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案26.如实施方案15所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案27.如实施方案15所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。实施方案28.如实施方案26或实施方案27所述的组合物，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。实施方案29.如实施方案15至28中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸包含无规区域。实施方案30.如实施方案29所述的组合物，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。实施方案31.如实施方案15至29中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。实施方案32.一种包含第一适配体、第二适配体和靶标的组合物，其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶；其中所述第一适配体、第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物；并且其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。实施方案33.如实施方案32所述的组合物，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。实施方案34.如实施方案32所述的组合物，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。实施方案35.如实施方案33或实施方案34所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。实施方案36.如实施方案33至35中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。实施方案37.如实施方案33至36中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。实施方案38.如实施方案33至37中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案39.如实施方案32所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案40.如实施方案32所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案41.如实施方案39或实施方案40所述的组合物，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。实施方案42.如实施方案32至41中任一项所述的组合物，其中所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰嘧啶。实施方案43.如实施方案42所述的组合物，其中所述第三5位修饰嘧啶选自bndc、pedc、ppdc、napdc、2napdc、nedc、2nedc、tyrdc、bndu、napdu、pedu、ibdu、fbndu、2napdu、nedu、mbndu、bfdu、btdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案44.如实施方案32至43中任一项所述的组合物，其中所述靶标选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。实施方案45.一种方法，其包括：(a)使能够结合靶标分子的适配体与样品接触；(b)用所述样品孵育所述适配体以允许适配体-靶标复合物形成；(c)在所述样品中富集所述适配体-靶标复合物，以及(c)检测所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的存在，其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的所述检测指示所述靶标分子存在于所述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；其中所述适配体为如实施方案1至14中任一项所述的适配体。实施方案46.如实施方案45所述的方法，其中所述方法包括至少一个选自以下的额外步骤：将竞争分子添加至所述样品中；在固体支撑物上捕捉所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。实施方案47.如实施方案46所述的方法，其中所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。实施方案48.如实施方案47所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。实施方案49.如实施方案48所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。实施方案50.如实施方案45至49中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。实施方案51.如实施方案45至50中任一项所述的方法，其中所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、唾液、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。实施方案52.一种用于检测样品中的靶标的方法，其包括a)使所述样品与第一适配体接触以形成混合物，其中所述第一适配体能够结合所述靶标以形成第一复合物；b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；c)使所述混合物与第二适配体接触，其中所述第二适配体能够结合所述第一复合物以形成第二复合物；d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；e)检测所述混合物中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在或不存在，其中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在指示所述靶标存在于所述样品中；其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶；其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。实施方案53.如实施方案52所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。实施方案54.如实施方案53所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。实施方案55.如实施方案53或实施方案54所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。实施方案56.如实施方案53至55中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。实施方案57.如实施方案53至56中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。实施方案58.如实施方案53至57中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案59.如实施方案52所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案60.如实施方案52所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案61.如实施方案59或实施方案60所述的方法，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。实施方案62.如实施方案52至61中任一项所述的方法，其中所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰嘧啶。实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述第三5位修饰嘧啶选自bndc、pedc、ppdc、napdc、2napdc、nedc、2nedc、tyrdc、bndu、napdu、pedu、ibdu、fbndu、2napdu、nedu、mbndu、bfdu、btdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案64.如实施方案52至63中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。实施方案65.如实施方案52至64中任一项所述的方法，其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物。实施方案66.一种用于鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体的方法，所述方法包括：(a)使适配体的文库与所述靶标分子接触以形成混合物，并且允许形成适配体-靶标复合物，其中当适配体对所述靶标分子具有亲和力时，所述适配体-靶标复合物形成；(b)从所述混合物的剩余部分分配所述适配体-靶标复合物(或富集所述适配体-靶标复合物)；(c)解离所述适配体-靶标复合物；以及(d)鉴别一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体；其中所述适配体的文库包含多种多核苷酸，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。实施方案67.如实施方案66所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。实施方案68.如实施方案67所述的方法，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。实施方案69.如实施方案66至68中任一项所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。实施方案70.如实施方案69所述的方法，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。实施方案71.如实施方案66至70中任一项所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。实施方案72.如实施方案66至71中任一项所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。实施方案73.如实施方案71或实施方案72所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。实施方案74.如实施方案71至73中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。实施方案75.如实施方案71至74中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。实施方案76.如实施方案71至75中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案77.如实施方案66所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。实施方案78.如实施方案66所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。实施方案79.如实施方案77或实施方案78所述的方法，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。实施方案80.如实施方案66至79中任一项所述的方法，其中各多核苷酸包含无规区域。实施方案81.如实施方案80所述的方法，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。实施方案82.如实施方案66至81中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。实施方案83.如实施方案66至82中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为结合靶标的适配体，并且其中所述文库包含至少1000种适配体，其中各适配体包含不同核苷酸序列。实施方案84.如实施方案66至83中任一项所述的方法，其中步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。实施方案85.如实施方案66至84中任一项所述的方法，其中所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体被扩增。实施方案86.褥实施方案66至85中任一项所述的方法，其中所述混合物包含聚阴离子竞争分子。实施方案87.如实施方案86所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。实施方案88.如实施方案87所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。实施方案89.如实施方案66至88中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。实施方案90.如实施方案1至14中任一项所述的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。实施方案91.如实施方案15至44中任一项所述的组合物，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。实施方案92.如实施方案45至89中任一项所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。实施方案93.如实施方案1至14和90中任一项所述的适配体，其中与具有相同长度和包含替代所述第一5位修饰嘧啶中每一种的未修饰嘧啶或替代所述第二5位修饰嘧啶中每一种的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体具有改进的核酸酶稳定性。实施方案94.如实施方案1至14、90和93中任一项所述的适配体，其中与具有相同长度和包含替代所述第一5位修饰嘧啶中每一种的未修饰嘧啶或替代所述第二5位修饰嘧啶中每一种的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体在人类血清中具有更长半衰期。实施例提供以下实施例以便更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其决不应被视为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可容易地采用此发现的潜在原理来设计多种化合物，而不偏离本发明的精神。实施例1：包含两种修饰碱基的适配体为了用两种修饰碱基比较selex的相对效率，针对总计18种起始文库分析以未修饰dt作为对照物在du上的五种单一修饰(nap-du、pp-du、moe-du、tyr-du和thr-du)、和与以未修饰dc作为对照物在dc上的修饰(nap-dc和pp-dc)的组合(图1)。所测试的修饰的类型包括类似于氨基酸上的疏水性侧链的疏水性芳族侧链。还测试du上的亲水性侧链(moe-du和thr-du)。所述18种文库各自含有30种随机化核苷酸，从而允许≥1015种不同序列。所述文库使用天然和/或修饰核苷酸三磷酸酯使用外切koddna聚合酶酶促合成(数据未示)。使用三十核苷酸(30n)随机化文库来替代具有单一修饰du的先前40n随机化文库。不意图受任何特定理论束缚，假设增加修饰碱基的密度将允许较短高亲和力适配体。此外，较短寡核苷酸文库生成较高产率。各核苷酸的比率针对da/dc/dg/dt为1∶1∶1∶1(各25％)。在各种情况下，所述无规区域侧接用于杂交pcr扩增引物(表2)的固定序列，在5’末端处和在3’末端处具有额外间隔区。主合成模板用于产生所有du和或dc位置均匀地在替换性引物延伸反应中修饰的修饰文库。总计18种酶促合成文库，其包含单一修饰du(nap-du、pp-du、moe-du、tyr-du和/thr-du)，其中未修饰dt作为对照物；单一修饰dc(nap-dc和pp-dc)，其中未修饰dc作为对照物；以及两种修饰碱基的组合：nap-dc或pp-dc与所有可能的修饰du(nap-du、pp-du、moe-du、tyr-du和thr-du)。如下在溶液中使用反义模板、放射性标记的5’引物与天然或修饰核苷酸三磷酸酯和kod聚合酶(外切)进行定性引物延伸反应(一式三份)。在60μl引物延伸反应中，20pmol生物素化反义文库与40pmol5’冷引物(2x)和痕量32p标记的5’引物、1xsq20缓冲液(120mmtris-hcl，ph7.8；10mmkcl；6mm(nh4)2so4；7mmmgso4、0.1％tritonx-100和0.1mg/mlbsa)中的0.5mm天然或修饰dntp和0.25u/mlkod聚合酶(外切)混合。将所述混合物热冷却，随后添加dna聚合酶并且在68℃下进行所述反应2h，接着在10℃下冷却。来自各文库反应的部分连同游离标记引物在10％tbu脲凝胶上运行。小的等分试样在变性凝胶上运行，所述变性凝胶暴露至荧光屏并且用fuji磷相仪成像，使用imagegauge4.0软件对色带定量并且结果以graphpadprism软件6.05绘制曲线。关于制备初始文库，使用在piercetm高容量抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒(lifetechnologies)上捕捉的主生物素化反义无规文库进行大规模引物延伸反应。与100％未修饰文库dna(dc/dt)对照物相比，对于某些两种修饰核苷的组合获得较低文库产率，例如对于nap-dc/nap-du为28％±1.3％，对于nap-dc/moe-du为40％±5.2％，并且对于pp-dc/nap-du为43％±2.7％。由测序结果计算各核苷酸的频率，所述结果获自初始文库和用于产生各单一和两种碱基修饰文库的主反义无规模板。主无规反义模板(30n)在1μm规模下用1∶1∶1∶1比率的da∶dg∶dc∶dt(trilinkbiotechnologies)以化学方式合成。初始无规单一碱基和两种碱基修饰文库在大规模反应中酶促合成并且用于选择实验中。这些文库连同富集池一起测序并且对于30n无规区域中的所有四种碱基以总计100％对核苷酸频率绘制曲线。与起始合成性天然dna模板文库和酶促合成的未修饰dna对照初始文库相比，当使用深度测序测定文库的碱基组成时在核苷酸频率方面未观察到显著偏差(数据未示出)。使用所述文库来选择结合pcsk9的适配体。所述选择实质上如先前使用硫酸葡聚糖作为聚阴离子竞争剂所报告地进行，持续总计六轮，在各连续轮次的选择期间应用递增靶标稀释。参见表1(r1＝第1轮，r2＝第2轮等)。选择通过将修饰无规文库(或对照未修饰)(≥1000pmol)和人类重组his标记的靶标蛋白pcsk9混合来开始，所述靶标蛋白在100μl体积中以0.5μm浓度存在。所选择的复合物分配在磁性his标签捕捉上，洗涤未结合序列，洗脱所选择的适配体并且使用所有天然核苷酸和3’生物素-引物进行pcr扩增。在3’末端处生物素化的天然双链dna捕捉在myonetm抗生蛋白链菌素c1珠粒上，通过碱性变性消除有义链并且在引物延伸反应中用修饰dc和或du置换以再生富集池并且用稀释蛋白重复选择循环。用于下一轮selex的蛋白浓度基于由每种样品的临界循环时间(ct)值计算的信号：背景比率来测定。表1：体外选择条件用于扩增的5’引物包含(at4)-尾部并且3’引物包含(a-生物素)2-t8-尾部(seqidno：82)，这避免了在合成修饰文库时添加修饰dc或du。表2：用于selex的天然dna模板、引物的序列在六轮选择之后，使用iontorrentpgm仪器对含有天然核苷酸的适配体进行深度测序。使用定制软件使用局部分批比对执行序列分析。来自所有富集池的序列分析的数据证明了两种修饰文库组合导致与单一修饰文库相比富集序列的多样性更高(数据未示出)。为了测试适配体的结合亲和力，选择序列的广泛集合，其不仅表示高拷贝独特序列，而且表示来自不同家族的低拷贝序列(数据未示出)。所有适配体均通过标准固相亚磷酰胺化学使用修饰/未修饰亚磷酰胺试剂以化学方式合成。所有适配体最初在溶液中用放射性标记的过滤器结合测定筛选为截短的40聚体，其含有30核苷酸无规区域和来自5’和3’末端的用于其pcsk9结合亲和力的固定引物区域的额外5个核苷酸。所述截短适配体(40聚体)包含来自固定区域的10个核苷酸。未修饰对照dna文库(dc/dt)不会产生任何活性序列(kd＜32nm)，这是预期的，因为对此文库的池亲和力为单调的(数据未示出)并且另外深度测序数据不会产生任何富集的多拷贝序列(数据未示出)。在dc或du上具有nap(萘基)修饰的单一修饰文库产生对靶标具有亲和力的适配体，然而，对靶标具有最大亲和力的适配体由具有tyr(酪氨酰基部分)修饰的du的nap(萘基部分)或pp(苯甲基部分)修饰的dc获得(图2)。用dt置换tyr-du会取消与靶标的结合，这指示酪氨酰基部分对与pcsk9的靶标表面的结合相互作用的重要性(数据未示出)。亲和力数据证明两种修饰核苷酸的适配体一般具有大于单一修饰核苷酸适配体的亲和力，并且当与单一修饰核苷酸适配体相比时还提供更大数目的结合pcsk9的适配体(图3)。此外，高拷贝单一修饰核苷酸的适配体具有在0.1-100nm之间的平均亲和力，而高拷贝两种修饰核苷酸的适配体具有≤0.1nm的平均亲和力。比较用于pcsk9的单一修饰适配体(40聚体)和双重修饰适配体(40聚体)的数据概述在下表3中示出。表3.用于pcsk9的单一和双重修饰适配体的结合数据概述基于表3中的信息，不显示结合的所有测定的单一修饰适配体的百分比为62％。不结合被定义为具有320nm或更大的kd的适配体。具有kd≤10nm的所有单一修饰适配体的百分比低于21％，并且所有单一修饰适配体的平均kd为5，2nm。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)的适配体的百分比为43％。此外，具有kd≤10nm的所有两种修饰的适配体的百分比为47％，并且所有两种修饰的适配体的平均kd为0.12nm。实施例2：双重修饰适配体的截短研究进一步截短对高亲和力(kd＜1nm)适配体结合的影响。将适配体截短至30聚体，其为25％长度减少。pp-dc/tyr-du组合具有最高数目的可能截短至30聚体的适配体，同时仍保持高亲和力(图4a)。单一碱基修饰适配体显示21.5％的可截短性(蓝色条，3/14)，具有修饰du的两种碱基修饰nap-dc适配体显示约23％的可截短性(红色条，11/48)，而具有其他修饰du的两种碱基修饰pp-dc显示60％的增强可截短性(绿色条，27/45)。对于pp-dc与pp-du、nap-du或tyr-du的两种碱基修饰组合，可能截短至30聚体的40聚体的百分比和数目与其他文库相比也更高(图4b)。测试较少的来自单一碱基修饰文库的适配体，因为在三种文库中仅有14种适配体具有≤1nm的亲和力(40聚体，对于单一修饰在图4b中的灰色区域中)。相比之下，来自具有高亲和力的两种碱基修饰文库的适配体的数目为93(40聚体，对于两种修饰在图4b的灰色区域中)，对于具有修饰du的nap-dc为48并且对于具有修饰du的pp-dc为45。各文库上的黑色水平线指示关于该文库中的所有适配体的中值。不意图受任何特定理论束缚，有可能的是，pp修饰碱基中的延长碳链(与其他修饰相比)帮助到达在靶标表面上难以接近的表位并且无需用于结构折叠和有效蛋白结合相互作用的固定引物区域。还评价pcsk9适配体对多种其他原蛋白转化酶(pc)的特异性。选择来自各文库的三种最高亲和力适配体(n＝33，40聚体；均不是来自未修饰dna对照文库，仅两种适配体来自dc/tyr-du文库并且一种适配体来自pp-dc/moe-du文库)并且测试其对其他pc的特异性。结果证明所述适配体对pcsk9具有特异性并且在100nm浓度下用其他pc(图5)未观察到可检测结合。针对啮齿动物(小鼠和大鼠)和恒河猴pcsk9测试具有≤1nm的kd值的截短适配体(n＝41，30聚体)的交叉物种反应性(参见表4)。来自多种物种的pcsk9之间的同一性百分比在图6中的图顶部示出。小鼠/大鼠pcsk9与猴和人类蛋白约76％相同。大多数适配体以相似亲和力结合恒河猴pcsk9(同一性96.4％)，然而，较少来自两种修饰文库(pp-dc/nap-du和pp-dc/tyr-du)的适配体结合大鼠和小鼠pcsk9(同一性约76％)。这些结果证明某些两种碱基修饰文库(例如pp-dc/nap-du和pp-dc/tyr-du)产生可以相似亲和力结合啮齿动物和人类/猴pcsk9的适配体(图6)。表4.单一和双重修饰适配体的交叉物种结合活性“-”指示在所述测定中未检测到结合实施例3：夹心测定中的适配体结合selex方法有时产生优先结合靶标表面上的显性“适应性(aptagenic)”表位的适配体。因此，关于适配体夹心对的报告限于文献中。选择方法的修改可用于搜索可结合靶标蛋白上的不同表位的适配体，诸如多价适配体离析(mai-selex)、用于多价适配体的基于阵列的发现平台(ad-map)夹心选择，其中一级适配体过量使用以阻断第一表位，从而尝试发现结合非竞争性信号传导表位的第二适配体。为了证明在选择可结合靶标表面上的不同表位的适配体时通过dc和du合起来的修饰的多重性所产生的化学多样性是否扩展，开发基于珠粒的夹心对筛选测定，其中使用抗生物素蛋白偶合的磁性珠粒来捕捉生物素化一级适配体(图7a)。将具有个别适配体的捕捉珠粒混合在一起使用以搜索多重成对组合中的第二结合配对物(图7a)。关于此实验，使用来自单一和两种碱基修饰文库的具有亲和力kd≤1nm的40聚体适配体(n＝96，9216对)。简言之，将个别适配体(每种样品0.05pmol)捕捉于单一magplex抗生物素蛋白珠粒类型上并且混合在一起(在一个实验中为24个珠粒，每种样品1000个珠粒)并且在室温下在1850rpm下在震荡下捕捉持续20min。将珠粒用1xsbt洗涤持续2min，随后在1xsbt中用0.5mm游离生物素洗涤持续5min，随后用1xsbt洗涤3次，每次持续2min。将珠粒用游离抗生蛋白链菌素阻断持续5min并且再次用1xsbt洗涤持续2min。将具有个别适配体的24种不同珠粒类型混合在一起用于筛选各捕捉适配体的夹心配对物。将检测或二级适配体在1xsbt中稀释至500nm，热冷却并且与pcsk9(最终10nm)混合，在25℃下孵育1h。添加1000个捕捉珠粒并且进一步在震荡下孵育1h。接着将珠粒捕捉于磁体上，用1xsbt洗涤三次每次持续2min并且再悬浮于具有0.1％bsa和100umdxso4的75μl1xsbt中。向其中添加75μl抗生蛋白链菌素藻红蛋白(最终5μg/ml)并且在25℃下在震荡下孵育20min。将珠粒最终再次用1xsbt洗涤持续2min并且在luminex3dxmap机器上读数。所述单一碱基修饰文库产生少量夹心对(三个)，而添加与单一碱基修饰适配体组合的来自两种碱基修饰文库的适配体会产生较多夹心对(22对)。此外，当两种配对物(捕捉和检测)适配体来自两种碱基修饰文库时，每种文库中夹心对的数目急剧地增加(45对，图7c，图7b)。来自夹心筛选的多重表位结合结果表明，初始无规文库中化学多样性的增加会产生可结合靶标表面上的非竞争性位点的修饰适配体。接着，测量产生最高信号的夹心对(10nmpcsk9浓度；所测试的所有对的0.75％，9216对中的70对；图7c)的pcsk9浓度依赖性反应，其中结果的子集示出在图8a(示出针对单一碱基修饰一级适配体dc/pp-du的浓度依赖性信号并且良好起作用的最佳二级为两种碱基修饰适配体nap-dc/nap-du[三角形])和8b(示出针对两种碱基修饰二级适配体nap-dc/nap-du的浓度依赖性信号并且良好起作用的最佳一级为单一碱基修饰适配体dc/pp-du[闭合正方形])中。有趣的是，构成单一碱基修饰一级(pp-du，亲和力kd175pm)和两种碱基修饰二级(nap-du/nap-dc，亲和力kd531pm)的一个特异性对在一种取向中产生比任何其他对高得多的稳固信号(图8c)。然而，当此单一碱基修饰一级适配体转换为二级适配体时，信号丧失，这指示所述适配体的取向对此夹心对而言为重要的。此适配体夹心对也可测量功能获得型突变蛋白pcsk9d374y的活性(图8d)，所述突变蛋白对ldl-r的亲和力高于野生型pcsk9并且据报告在患有重度形式的家族性高胆固醇血症(fh)的患者中过度表达。关于突变体pcsk9d374y的敏感性和mfu值高于野生型蛋白。也通过当重组人类pcsk9掺加至新生小牛血清(nbcs)中时，与人类血浆(数据未示出)相比缺乏内源信号来测量适配体夹心对的特异性。此夹心对进一步表征以开发适配体夹心测定来检测人类临床样品中血浆pcsk9的循环浓度。所述夹心测定的性能通过进行研究来评价，诸如敏感性(图9a和9b以及表5和6)、精确定度(表7和8)、准确性(表9)和血浆稀释线性测量(图10)，其均证实稳固分析窗。为了评定所述测定的样品稀释线性，用含有和/或掺加有高浓度pcsk9的样品执行夹心测定。血浆样品(n＝5)连续地用测定缓冲液稀释以拟合所述测定的动态范围内的值。检测限(llod)在表5中示出，其定义为产生高于空白(稀释缓冲液)的平均rfu加上3个标准偏差的rfu值的pcsk9浓度(40pg/ml)。定量下限(lloq)和定量上限(uloq)在表6中示出，其定义为可使用应用于标准曲线的4参数逻辑(4pl)拟合定量的最低和最高pcsk9浓度，导致已知靶标浓度的80％-120％恢复。为了确定测定内变异性，在单一板中测试已知浓度的五种血浆样品16次。参见表7。所述测定内的变异系数(cv)介于4.3％至6％范围内。为了确定分析间变异性，在五个独立测定中测量已知浓度的五种血浆样品。参见表8。测定之间的cv介于2.3％至9.8％范围内。最终，为了确定靶标测量值的准确性，使五种血浆样品掺加不同量的pcsk9并且进行测量。评价在所述测定的范围内掺加的pcsk9水平的恢复。参见表9。样品的恢复百分比平均为掺加的靶标的83.1％至137.5％。评价由两组个体(一个对照组(n＝42)和其中受试者采用司他汀疗法的另一研究组(n＝42，通过自主报告))获得的血浆样品的集合以便确定所述测定是否可在这两组之间进行统计学区分，因为已知使用司他汀会增加pcsk9的血浆浓度。使用捕捉或一级soma聚体(11723-5)作为单一碱基修饰适配体(pp-du/dc)并使用二级或检测适配体(11727-20)作为两种碱基修饰适配体(nap-dc/nap-du)来开发所述夹心测定。这些结果指示适配体夹心测定可通过mann-whitney分析以0.0044的p值(图11)统计学区分所述两组并且此测定可能用于鉴别可能由于其高血浆浓度的pcsk9而受益于抗pcsk9疗法的人。还使用适配体夹心测定来测量来自pcsk9过度表达的hepg2细胞的无细胞上清液中的pcsk9浓度以鉴别过度表达克隆并且证明所述测定的研究效用(图12)。使用sbisystembioscienceslentiviral系统(lv300a-1)使pcsk9在hepg2细胞中过度表达。所述hepg2细胞系用获自origene(rc220000l1)的用于野生型人类pcsk9的慢病毒表达克隆转导以产生稳定细胞系。总计96种个别克隆针对其分泌pcsk9的能力进行筛选。在培养基中分泌的pcsk9的相对量通过用于各种克隆的适配体夹心测定来测量并且与来自野生型hepg2细胞的表达进行比较。用于产生重组蛋白的细胞的数目使用cell发光细胞活力测定来归一化。克隆数目45分泌比野生型hepg2细胞多约100倍的pcsk9。表5：夹心测定的敏感性(检测下限)表6：夹心测定的敏感性(定量下限)表7：测定内的精确度表8：测定之间的精确度表9：靶标测量值的准确性实施例4：通过双重修饰适配体进行的靶标活性抑制为了发现阻断pcsk9与ldl-r的结合的pcsk9抑制剂，在基于板的测定中筛选具有kd≤1nm的41种截短30聚体适配体，其中板涂布有ldl-r并且使用抗生蛋白链菌素-hrp缀合物通过化学发光试剂检测生物素化pcsk9的结合(图13)。将重组ldl-r(acrobiosystems)在4℃下涂布于elisa板上(2.5μg/ml)过夜，并且接着在室温下洗涤各孔并用superblock(invitrogen)阻断持续1h。将生物素化pcsk9(acrobiosystems，avi标记)和适配体混合在一起并且在室温下孵育1h，接着添加至elisa板中并进一步在室温下在震荡下孵育2h。最高pcsk9浓度为0.5nm并且适配体的最高浓度为100nm，并且接着将这些浓度针对抑制曲线通过1/2log连续地稀释。将抗生蛋白链菌素结合的hrp(invitrogen，1μg/ml)添加至各孔中并且在室温下在震荡下孵育30min，添加pico敏感性化学发光底物(invitrogen)，在光度计(hidexplatechameleon)中测量发光，并且将数据在graphpadprism6.0软件中绘制曲线以计算ec50值。将pcsk9中和抗体(bpsbioscience)用作对照物。来自所述抑制测定的结果(适配体的测试浓度在100nm下并且pcsk9在1nm下)显示70％的适配体为抑制剂(超过90％抑制)并且所述两种修饰适配体中的一些潜在地抑制pcsk9与ldl-r的相互作用(数据未示出)。进一步针对剂量-反应曲线评价适配体以测定其用于抑制的ec50值。结果指示许多抑制剂潜在地以0.1-1nm范围内的ec50抑制pcsk9与ldl-r的相互作用(图14)。为了证明两种修饰适配体的潜在治疗价值，选择一种物种交叉反应性pcsk9适配体(30聚体，seqid.11733-915(11733-198))来测量靶标与来自多种物种的pcsk9的亲和力。此适配体分别对人类(野生型)、恒河猴、人类(gof突变体d374y)、小鼠和大鼠pcsk9具有14.7、11.3、5.2、77和165pm的亲和力(图15a)。此适配体也以2.1nm的ec50阻断野生型人类pcsk9ldl-r相互作用并且以3.6nm的ec50阻断gof突变体pcsk9d374yldl-r相互作用(图15b)。评价与其他pc相比此适配体对pcsk9的特异性，并且结果显示此适配体仅结合pcsk9并且不结合其他pc(数据未示出)。为了测试pcsk9适配体阻断ldlr降解的中和效应，在ldl摄取逆转测定中测试pp-dc/nap-du适配体，其中野生型hepg2细胞与重组pcsk9一起孵育16h，并且接着洗涤细胞并添加萤光标记的ldl持续3h。结果显示出所述适配体可以159nm的ec50逆转ldl摄取(图16和图17)。此外，适配体处理可增加pcsk9过度表达的hepg2细胞中的ldl-r水平，如通过facs所测量(图17。由物种交叉反应性、高亲和力、截短、特异性并高度有效适配体获得的这些结果表明两种碱基修饰适配体的潜在治疗价值可通过selex后修饰针对长度和生物稳定性进一步最佳化。实施例5：双重修饰适配体的血清稳定性为了测定人类血清中所述双重修饰适配体的血清稳定性，将1μm凝胶纯化的适配体在37℃下在pbs缓冲液中的90％合并人类血清中以200μl的总体积孵育。在多个时间点，收集20μl等分试样并且添加相等体积的edta/甲酰胺/染料混合物(甲酰胺87.7％、sds0.03％、edta钠20mm、二甲苯蓝0.05％、溴酚蓝0.05％、orangeg0.1％)。然后将等分试样混合物储存于-20℃下。在分析之前，将40μl等分试样混合物用100μlh2o稀释并且用150μl25∶24∶1苯酚∶氯仿∶异戊醇萃取。将所述样品在16，100xg下离心持续15分钟，并且移出含适配体的水相并储存于-20℃下直至凝胶分析。将所述适配体样品装载于15％tbepage变性凝胶(8m脲)上，并且将适配体用1x(约2μm)sybr金染色持续10分钟。使用fluorchemq分析软件(alphainnotech)定量在各时间点时全长适配体的量。该实验的结果在表10和图18中示出。表10示出在该实验中测试的适配体的组成、在90％人类血清中96小时之后剩余的全长适配体的百分率和各适配体的半衰期，所述半衰期通过线性回归拟合使用凝胶定量的数据以graphpadprism7软件计算。图18示出随时间剩余的全长适配体的百分率。一般而言，双重修饰适配体证明人类血清中随时间的稳定性大于单一修饰适配体。表10：适配体组成。实施例6：包含两种修饰碱基的适配体使用实施例1中描述的文库来选择结合erbb2、erbb3和psma的适配体。实质上如实施例1中所述针对各靶标进行选择。对于erbb2和erbb3，使用单一修饰nap-dc/dt；pp-dc/dt；以及dc/tyr-du文库；以及双重修饰nap-dc/tyr-du和pp-dc/tyr-du文库。对于psma，使用未修饰dc/dt文库；单一修饰nap-dc/dt；pp-dc/dt；dc/nap-du、dc-pp-du、dc-moe-du和dc/tyr-du文库；以及双重修饰nap-dc/nap-du、nap-dc/pp-du、nap-dc/moe-du、nap-dc/tyr-du、pp-dc/pp-du、pp-dc/nap-du和pp-dc/tyr-du文库。与先前一样，用于psma的未修饰对照dna文库(dc/dt)不产生任何结合psma的适配体。dc或du上具有nap修饰(萘基部分)的单一修饰文库产生用于所有三种靶标的结合剂，然而，双重修饰文库提供相对于单一修饰文库具有较大亲和力的适配体(图19a-19c)。比较psma、erbb2和erbb3中每一者的单一修饰适配体(40聚体)和双重修饰适配体(40聚体)的数据概述分别在表11、12和13中示出。表11.对于psma的单一和双重修饰适配体的结合数据概述n.t.为“未测试”；n/a为不适用或无数据基于表11中的信息，不显示结合的所有测定的单一修饰适配体的百分比为71％。不结合被定义为具有320nm或更大的kd的适配体。具有kd≤10nm的所有单一修饰适配体的百分比为12％，并且所有单一修饰适配体的平均kd为12.3nm。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)适配体的百分比为54％。此外，具有kd≤10nm的所有两种修饰适配体的百分比为20％，并且所有两种修饰的适配体的平均kd为6.6nm。表12.对于erbb2的单一和双重修饰适配体的结合数据概述基于表12中的信息，不显示结合的所有测定的单一修饰适配体的百分比为70％。不结合被定义为具有320nm或更大的kd的适配体。具有kd≤10nm的所有单一修饰适配体的百分比低于2％，并且所有单一修饰适配体的平均kd为15.1nm。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)适配体的百分比为44％。此外，具有kd≤10nm的所有两种修饰适配体的百分比为25％，并且所有两种修饰的适配体的平均kd为0.7nm。表13.对于erbb3的单一和双重修饰适配体的结合数据概述基于表13中的信息，不显示结合的所有测定的单一修饰适配体的百分比为38％。不结合被定义为具有320nm或更大的kd的适配体。具有kd≤10nm的所有单一修饰适配体的百分比为40％，并且所有单一修饰适配体的平均kd为6nm。相比之下，不显示结合的所有测定的两种修饰(双重修饰)适配体的百分比为24％。此外，具有kd≤10nm的所有两种修饰适配体的百分比为69％，并且所有两种修饰适配体的平均kd为0.02nm。实施例7：包含两种修饰碱基的其他适配体如下制备包含表14中所示的各修饰对的文库。在一些实施方案中，各文库含有40种或更多种随机化核苷酸。在一些实施方案中，各文库含有30种随机化核苷酸，从而允许≥1015种不同序列。所述文库可使用天然和/或修饰核苷酸三磷酸酯使用外切koddna聚合酶酶促合成。在一些实施方案中，所述无规区域侧接用于杂交pcr扩增引物的固定序列，在5’末端处和在3’末端处具有或不具有额外间隔区。在一些情况下，主合成模板用于产生所有du和或dc位置均匀地在替换性引物延伸反应中修饰的修饰文库。文库合成可实质上如实施例1中所述执行。表14：双重修饰适配体文库表14中的一种或多种文库可用于选择结合靶标(诸如蛋白靶标)的适配体。包含两种修饰碱基的文库典型地产生对靶标具有较大特异性和/或亲和力的适配体。实施例8：示例性双重修饰适配体来自池11720(nap-dc/dt)的保守序列家族的pcsk9结合适配体在表15中示出。仅示出各序列的无规区域。指示了在11，380种总序列中各序列的拷贝数(与多达5种错配相同或相等)。此家族中的所有适配体均共享保守序列元件ttppggpp，其中p＝nap-dc。适配体11730-6(seqidno：4，kd＝0.1nm)为针对代谢稳定性测定从此池中选出的代表。表15：来自池11720的适配体来自池11730(nap-dc/tyr-du)的保守序列家族的pcsk9结合适配体在表16中示出。仅示出各序列的无规区域。指示了在17，695种总序列中各序列的拷贝数(与多达5种错配相同或相等)。此家族中的所有适配体均共享保守序列元件ygpppg，其中p＝nap-dc并且y＝tyr-du。多种序列还含有保守序列元件yyaygpap。适配体11730-19(seqidno：27，kd＝0.2nm)为针对代谢稳定性测定从此池中选出的代表。表16：来自池11730的适配体来自池11733(pp-dc/nap-du)的保守序列家族的pcsk9结合适配体在表17中示出。仅示出各序列的无规区域。指示了在16，118种总序列中各序列的拷贝数(与多达5种错配相同或相等)。此家族中的所有适配体均共享保守序列元件rpppaaggrrpappg(seqidno：83)，其中r＝pp-dc并且p＝nap-du。适配体11733-44(seqidno：44，sl1063)为野生型人类pcsk9(ic50＝2.8nm)的最有效30聚体抑制剂。适配体11733-198(seqidno：46，kd＝0.07nm)为针对代谢稳定性测定从此池中选出的代表。表17：来自池11733的适配体权利要求书(按照条约第19条的修改)1.一种包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷；其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分；并且其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自奈基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。2.如权利要求1所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。3.如权利要求1或权利要求2所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。4.如权利要求1至3中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。5.如权利要求1至4中任一项所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。6.如权利要求1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。7.如权利要求1所述的适配体，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。8.如权利要求6或权利要求7所述的适配体，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。9.如权利要求1至8中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的5’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。10.如权利要求1至9中任一项所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。11.如权利要求1至10中任一项所述的适配体，其中所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。12.一种包含多种多核苷酸的组合物，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷；其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分；并且其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。。13.如权利要求12所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。14.如权利要求13所述的组合物，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。15.如权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。16.如权利要求15所述的组合物，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。17.如权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。18.如权利要求12至17中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。19.如权利要求12至18中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。20.如权利要求12至19中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。21.如权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。22.如权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。23.如权利要求21或权利要求22所述的组合物，其中所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。24.如权利要求12至23中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸包含无规区域。25.如权利要求24所述的组合物，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。26.如权利要求12至25中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。27.一种包含适配体和靶标的组合物，其中所述适配体和所述靶标能够形成复合物，并且其中所述适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体。28.一种包含第一适配体、第二适配体和靶标的组合物，其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物；并且其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；并且其中所述第一适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体。29.如权利要求28所述的组合物，其中所述靶标选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。30.一种方法，其包括：(a)使能够结合靶标分子的适配体与样品接触；(b)用所述样品孵育所述适配体以允许适配体-靶标复合物形成；(c)在所述样品中富集所述适配体-靶标复合物，以及(c)检测所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的存在，其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的所述检测指示所述靶标分子存在于所述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；其中所述适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体。31.如权利要求30所述的方法，其中所述方法包括至少一个选自以下的额外步骤：将竞争分子添加至所述样品中；在固体支撑物上捕捉所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。32.如权利要求33所述的方法，其中所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。33.如权利要求32所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。34.如权利要求33所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。35.如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。36.如权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、唾液、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。37.一种用于检测样品中的靶标的方法，其包括a)使所述样品与第一适配体接触以形成混合物，其中所述第一适配体能够结合所述靶标以形成第一复合物；b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；c)使所述混合物与第二适配体接触，其中所述第二适配体能够结合所述第一复合物以形成第二复合物；d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；e)检测所述混合物中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在或不存在，其中所述第一适配体、所述第二适配体、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在指示所述靶标存在于所述样品中；其中所述第一适配体为如权利要求1至11中任一项所述的适配体；其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶，或者其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶。38.如权利要求37所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物。40.一种用于鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体的方法，所述方法包括：(a)使适配体的文库与所述靶标分子接触以形成混合物，并且允许形成适配体-靶标复合物，其中当适配体对所述靶标分子具有亲和力时，所述适配体-靶标复合物形成；(b)从所述混合物的剩余部分分配所述适配体-靶标复合物(或富集所述适配体-靶标复合物)；(c)解离所述适配体-靶标复合物；以及(d)鉴别所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体；其中所述适配体的文库包含多种多核苷酸，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷；或者其中所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷；其中所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位处的选自奈基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分；并且其中所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位处的选自奈基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。41.如权利要求40所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。42.如权利要求41所述的方法，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。43.如权利要求40至42中任一项所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。44.如权利要求43所述的方法，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。45.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。46.如权利要求40至45中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。47.如权利要求40至46中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。48.如权利要求40至47中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。49.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。50.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。51.如权利要求40至50中任一项所述的方法，其中各多核苷酸包含无规区域。52.如权利要求51所述的方法，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。53.如权利要求40至52中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。54.如权利要求40至53中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为结合靶标的适配体，并且其中所述文库包含至少1000种适配体，其中各适配体包含不同核苷酸序列。55.如权利要求40至54中任一项所述的方法，其中步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。56.如权利要求40至55中任一项所述的方法，其中所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体被扩增。57.如权利要求40至56中任一项所述的方法，其中所述混合物包含聚阴离子竞争分子。58.如权利要求57所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。59.如权利要求58所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。60.如权利要求40至59中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。61.如权利要求1至11中任一项所述的适配体或如权利要求12至29中任一项所述的组合物或如权利要求30至60中任一项所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。62.如权利要求1至11中任一项所述的适配体，其中与具有相同长度和包含替代所述第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶或替代所述第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体具有改进的核酸酶稳定性和/或人类血清中更长的半衰期。当前第1页12当前第1页12