专利名称：一种尿液中核苷的测定方法及在恶性肿瘤诊断仪中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及色谱分析技术，特别提供了一种通过高效毛细管电泳从尿液中测定核苷的方法，用于恶性肿瘤的辅助性诊断仪。
尿中修饰核苷已被作为癌症和艾滋病的潜在诊断标记物进行研究。核糖核酸(RNA)特别是转运核糖核酸(tRNA)中除含有四种正常核苷腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)、尿嘧啶核苷(U)外，还有大量修饰核苷。现已发现有90多种修饰核苷，其中tRNA中已发现79种，其它来自于mRNA和rRNA中。所有修饰核苷是在大量高度特异性的修饰酶的作用下，尤其是甲基转移酶和连接酶的作用下，RNA链上特定位置的核苷被修饰如碱基甲基化、碳氮键发生重排、尿苷移位形成假尿苷等。转录修饰完成之后，RNA分子在核酸酶作用下释放出各种核苷。血中正常的未被修饰的核苷可以在酶的作用下，被磷酸酯化后再利用形成新的RNA，或降解为尿酸和β-丙胺酸。而修饰核苷十分稳定，既不易代谢也不能被磷酸酯化再利用，因此在尿中被定量排放。所以，在尿中，修饰核苷的含量相对来说比正常核苷的含量会稍高一些。但无论如何，对正常的成年人来说，个体间排放浓度差异较小，分布在一个较窄的范围。当人体的某一部分发生癌变时，核糖核酸周转加快，导致尿液或血液中修饰核苷的含量急剧增加。根据以上的机理，人们可以通过尿液或血液中修饰核苷浓度的增加程度，对癌症的发病进行早期诊断。
分析尿液或血液中的修饰核苷，可以采用高效液相色谱法(HPLC)，同时还有免疫分析法、气相色谱法。
气相色谱法通常能提供很高的分辨率，但受挥发性的限制，即使经过了化学衍生，也无法检测象t6A和Q这样的修饰核苷。
目前临床应用的肿瘤标记物分析仪，主要是基于免疫化学的方法，以分析血清中的某些蛋白质类肿瘤标记物来辅助癌症诊断，一次只能分析一种肿瘤标记物，癌症是一个非常复杂的疾病，它由多基因引起，并由多步骤控制，单靠一二种标记物很难做到早期发现、准确检测；另外免疫分析尽管可以在一天内快速分析多个样品，但是核苷与尿的其它成分会发生交叉反应，也减少了定量分析的准确度。
经典的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，可以一次性分析分离体液中的多个核苷和修饰核苷类肿瘤标记物，信息量大大增多，但是分析柱子比较昂贵，需要经常的维护，使用寿命较短，同时由于RP-HPLC的流动相消耗大量的溶剂，有较多的有机废液排出，从而增加了分析的成本。
本发明的目的是提供一种尿液中核苷的测定方法，其可以高分辨率地、高选择性地一次性分析分离尿液的中多个核苷和修饰核苷类肿瘤标记物，从而使核苷类肿瘤标记物辅助癌症诊断仪器的研制成为可能。
本发明提供了一种尿液中核苷的测定方法，采用毛细管电泳技术，首先将带有内标的随机尿样中的核苷预分离富集，其特征在于富集后的分析溶液以200～300mmol/L十二烷基磺酸钠SDS、10～75mmol/L十水合四硼酸钠Na2B4O7.10H2O、10～100mmol/L二水合磷酸二氢钠NaH2PO4.2H2O为缓冲液，pH为6.5-7.2，用未涂层石英毛细管25～75μm.ID为分离通道，在5～15kV电压和210～280nm检测波长下进行毛细管电泳分析，测定随机尿样中核苷的浓度。
由于尿中多达上万种化学物质，核苷的含量很低，其它成分的干扰太多，无法直接对样品进行分析，应采用苯基硼酸亲和色谱法预分离和富集尿中核苷。本发明所述预分离富集的过程是，将混有3-脱吖尿苷(3-Dzu)作内标的10ml尿样先通过苯基硼酸柱，经苯基硼酸柱洗脱的溶液，在旋转真空蒸发器中蒸发至干，再用1mL的Milli-Q超纯水溶解作为分析溶液。相比原尿样中的核苷浓度，萃取后浓缩了十倍。
富集后的核苷用高效毛细管电泳法进行分析。由于在pH 7左右核苷是不带电的物质，应用胶束电动力学毛细管色谱法。为此，使用SDS作表面活性剂，在硼酸盐和磷酸盐缓冲液中对萃取出的尿中核苷进行毛细管电泳分离分析。由于尿液数量受饮食等影响，上述分析最好用24h尿，看一天里病人排放的尿中核苷的总量。但24h尿采集起来又非常不方便。为此，本发明将所述测定的核苷浓度与测定的尿液中肌酐的浓度(creatinine)相除，以获得一不随24小时饮食变化的尿液中核苷的标定参量。所述尿液中肌酐的浓度可以用Jaffe法、毛细管电泳法或高效液相色谱法测定。
当所述肌酐浓度用毛细管区带电泳法测定时，将尿离心后，取10μL用重蒸水稀释10倍，在毛细管电泳仪上，以0.1mol/L pH为2.5的磷酸盐为缓冲液，在50μm.ID～75μm.ID的未涂层石英毛细管上，于20kV恒压，进行电泳分离，检测波长为214nm，外标法定量。
本发明与经典的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)相比有如下优点1)CE使用未涂渍的毛细管柱，比RP-HPLC的柱子更便宜，并且需要更少的维护，有着更长的寿命；2)RP-HPLC的流动相消耗大量的溶剂，而CE由于管径细，并在电场作用下分离样品，因此所需流动相和样品量很小，无有机废液。
本发明通过通用毛细管电泳仪，配上特定的缓冲液和分析方法，从而高分辨率地、高选择性地一次性定量分析分离尿液的中多个核苷和修饰核苷类肿瘤标记物。如果将通过本发明方法测得多种肿瘤标记物核苷和修饰核苷的数据，与现代先进的各种多变量数据处理技术——广义的模式识别技术结合进行数据处理，如因子分析法、人工神经元网络技术等，可以从高风险人群中筛选恶性肿瘤患者以及区分正常人、良性肿瘤患者和恶性肿瘤患者，从而使核苷类肿瘤标记物辅助癌症诊断仪器的研制成为可能。
下面通过实施例详述本发明。
附
图1为14种标样核苷组分的电泳图；附图2为健康人尿中核苷的电泳图；附图3为良性肿瘤患者尿中核苷的电泳图；附图4为恶性肿瘤患者尿中核苷的电泳图；附图5为健康人与良性乳腺肿瘤病人的多种核苷模式识别基图。
附图6为健康人与癌症病人的多种核苷模式识别基图。
实施例1应用高效毛细管电泳法—胶束电动力学色谱法，对14种核苷标样进行分离，分析结果见附图1。
色谱条件为电泳柱52cm×50μm.id； 真空进样0.5Psi×15s；温度29℃；运行电压7.0kV；缓冲溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸钠(SDS)-25mM十水合四硼酸钠(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)；检测波长254nm。
图中色谱峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.3-甲基尿嘧啶+5-甲基尿嘧啶，5.次黄嘌呤核苷，6.1-甲基次黄嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鸟苷，9.腺苷，10.3-脱吖尿苷(内标)，11.黄嘌呤核苷，12.2-甲基鸟苷，13.6-甲基腺苷。
实施例2应用胶束电动力学色谱法，对正常人的尿中核苷进行测定，结果见附图2。
色谱条件为电泳柱52cm×50μm.id；真空进样0.5Psi×15s；温度29℃；运行电压7.0kV；缓冲溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸钠(SDS)-25mM十水合四硼酸钠(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)；检测波长254nm。
图中色谱峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.甲基尿嘧啶，5.次黄嘌呤核苷，6.1-甲基次黄嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鸟苷8′.1-甲基鸟苷，9.腺苷，10.3-脱吖尿苷，11.黄嘌呤核苷，12.2-甲基鸟苷，13.6-甲基腺苷。
实施例3应用胶束电动力学色谱法，对良性肿瘤患者的尿中核苷进行测定，结果见附图3。
色谱条件为电泳柱52cm×50μm.id；真空进样0.5Psi×15s；温度29℃；运行电压7.0kV；缓冲溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸钠(SDS)-25mM十水合四硼酸钠(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)；检测波长254nm。
图中色谱峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.甲基尿嘧啶，5.次黄嘌呤核苷，6.1-甲基次黄嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鸟苷，8`.1-甲基鸟苷，9.腺苷，10.3-脱吖尿苷，11.黄嘌呤核苷，12.2-甲基鸟苷，13.6-甲基腺苷。
实施例4应用胶束电动力学色谱法，对恶性肿瘤患者的尿中核苷进行测定，结果见附图4。
色谱条件为电泳柱52cm×50μm.id；真空进样0.5Psi×15s；温度29℃；运行电压7.0kV；缓冲溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸钠(SDS)-25mM十水合四硼酸钠(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)；检测波长254nm。
图中色谱峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.甲基尿嘧啶，5.次黄嘌呤核苷，6.1-甲基次黄嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鸟苷，8`.1-甲基鸟苷，9.腺苷，10.3-脱吖尿苷，11、黄嘌呤核苷，12、2-甲基鸟苷。
实施例5分别对正常人、良性肿瘤患者、恶性肿瘤患者和待诊断病人的尿中核苷进行测定，所得结果转化为nmol/μmol肌酐(creatinine)。肌酐浓度用毛细管区带电泳法测定。方法为将尿离心后，取10μL用重蒸水稀释10倍，在毛细管电泳仪上，以0.1mol/L pH为2.5的磷酸盐为缓冲液，在50μm.ID～75μm.ID的未涂层石英毛细管上，于20kV恒压，进行电泳分离，检测波长为214nm，外标法定量。
以上述多种正常核苷和修饰核苷的浓度(nmol/μmol肌酐(creatinine))作数据矢量，用模式识别等数据分类法处理数据，给出可视化的诊断结果。
图5是正常人(+)与良性病人(x)核苷排放的比较。上述模式基图通过分析28个正常人和9个乳腺肿瘤病人的尿样获得。数据矢量为尿中14种核苷浓度。14种核苷为C，U，A，G，Pseu，I，ac4C，X，m3U+m5U，m1I，m1G，M1G，M2G。可见，良性和正常人尿中核苷的排放模式区别不大。9个病人中只有3个(点)稍稍偏离正常人区域。
图6是正常人(+)和癌症病人(x)的模式识别。上述模式基图通过分析25个正常人和25个癌症病人的尿样获得。数据矢量为尿中14种核苷浓度。14种核苷为C，U，A，G，Pseu，I，ac4C，X，m3U+m5U，m1I，m1G，M1G，M2G。可见正常人和癌症病人各有一个较明显的分布区域。正常人分布在一个较窄的范围，而癌症病人则较分散。大约有20％的病人(点)进入到正常人的区域，区别率为80％左右。
实施例6对28个正常人尿中核苷排放浓度进行了高效毛细管电泳测定。以此为基础，可对未知病人进行诊断如果未知病人的尿中核苷排放模式与正常人类似，则视为未发现恶性肿瘤，否则视为阳性，建议其去医院做更深入的体检。通过上百例诊断，可靠性大于70％。
本发明采用高分辨率和高选择性的高效毛细管电泳法用于尿中核苷的测定，然后结合模式识别技术，可以从高危病人中筛选出恶性肿瘤患者，如白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、食道癌、乳腺癌、鼻咽癌、脑癌、支气管癌、结肠癌、女性卵巢癌等。它提供了一个不“侵入”的诊断恶性肿瘤的方法。应用本发明所提供的方法可以制作急发性恶性肿瘤的诊断仪器。
权利要求
1.一种尿液中核苷的测定方法，采用毛细管电泳技术，首先将带有内标的随机尿样中的核苷预分离富集，其特征在于富集后的分析溶液以200～300mmol/L十二烷基磺酸钠SDS、10～75mmol/L十水合四硼酸钠Na2B4O7.10H2O、10～100mmol/L二水合磷酸二氢钠NaH2PO4.2H2O为缓冲液，pH为6.5-7.2，用未涂层石英毛细管25～75μm.ID为分离通道，在5～15kV电压和210～280nm检测波长下进行毛细管电泳分析，测定随机尿样中核苷的浓度。
2.按照权利要求1所述尿液中核苷的测定方法，其特征在于所述预分离富集的过程是，将混有3-脱吖尿苷3-Dzu作内标的10ml尿样先通过苯基硼酸柱，经苯基硼酸柱洗脱的溶液，在旋转真空蒸发器中蒸发至干，再用1mL的Milli-Q超纯水溶解作为分析溶液。
3.按照权利要求1或2所述尿液中核苷的测定方法，其特征在于将所述测定核苷的浓度与测定的尿液中肌酐的浓度(creatinine)相除，获得一不随24小时饮食变化的尿液中核苷的标定参量。
4.按照权利要求3所述尿液中核苷的测定方法，其特征在于所述尿液中肌酐的浓度用Jaffe法、毛细管电泳法或高效液相色谱法测定。
5.按照权利要求4所述尿液中核苷的测定方法，其特征在于所述肌酐浓度用毛细管区带电泳法测定，将尿离心后，取10μL用重蒸水稀释10倍，在毛细管电泳仪上，以0.1mol/L pH为2.5的磷酸盐为缓冲液，在50μm.ID～75μm.ID的未涂层石英毛细管上，于20kV恒压，进行电泳分离，检测波长为214nm，外标法定量。
6.权利要求1中所述尿液中核苷的测定方法在恶性肿瘤诊断仪器中的应用，其特征在于结合计算机技术，将测得的多种核苷类肿瘤标记物的数据用各种多变量数据处理技术，即广义的模式识别技术，如因子法、人工神经元网络技术等结合进行数据处理。
全文摘要
一种尿液中核苷的测定方法,首先将带有内标的随机尿样中的核苷预分离富集,其特征在于:富集后的分析溶液以200～300mmol/L十二烷基磺酸钠SDS、10～75mmol/L十水合四硼酸钠Na
文档编号G01N30/00GK1357762SQ0013430
公开日2002年7月10日 申请日期2000年12月13日 优先权日2000年12月13日
发明者许国旺, 郑育芳, 路鑫, 刘大渔, 孔宏伟 申请人:中国科学院大连化学物理研究所