专利名称：一种同时测定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种同时测定尿液中l-0HP、3-0HB[a]P和3-0HB[a]A含量的方法，属于生化检验技术领域。
背景技术：
苯并芘(B[a]P)，苯并蒽(B[a]A)和屈等是卷烟烟气中重要的多环芳烃(PAH)类有害成分，其在人体内产生的代谢物一3-羟基苯并芘(3-OHB[a]P)、3-羟基苯并蒽(3-OHB[a]A )和1-羟基芘(1-OHP )，可作为B [a] P，B [a] A和其它多环芳烃类(PAH )化合物的接触生物标志物用于区分不同暴露剂量人群及预测可能的作用机制。到目前为止，已有研究者建立了检测尿液中的PAH代谢物的方法，其中以高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FL)最为常见。由于荧光的高灵敏性，使得HPLC-FL适合于尿液中PAH代谢物的检测，但是HPLC-FL检测方法的样本需求量较大(IOmL或者更多)，运行时间较长且较多的方法未应用内标。气相色谱法(GC)和气相色谱质谱法(GC/MS)也被应用于测定羟基PAH代谢物。研究报道采用气相色谱-高分辨质谱同时测定了多个PAH代谢物的方法，此方法具有高灵敏度和高选择性等优点，但是，高灵敏的仪器较为昂贵，GC法的前处理过程较为复杂费时。近年来，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)被广泛应用于新药的发现与开发。液相色谱配备三级四级杆串联质谱被广泛应用于复杂生物基质中低含量化合物的定量检测，并且此方法一般具有较高选择性和较短的分析时间。有研究者报道采用液相色谱-飞行时间质谱在电喷雾离子模式下测定尿液中的1-0HP，在活体代谢研究中，有报道应用液相色谱单级四级杆在电喷雾离子化模式下测定PAHs代谢物方法。采用LC/MS配大气压化学电离法(APCI)或电喷雾离子化法 (ESI)也可以实现多种PAH代谢物的测定，但是较少有应用于生物基质。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时测定尿液中l-0HP、3_0HB[a]P和3_0HB[a]A含量的方法。为了实现以上目的，本发明采用一种同时测定尿液中l-0HP、3_0HB[a]P和3-0HB[a]A含量的方法，具体操作步骤如下(I)酶解尿液样本取尿液样本，置于室温下解冻，调节尿液pH，依次加入醋酸缓冲液、β -葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，水浴振荡酶解过夜；(2)固相萃取纯化选取C18固相萃取柱，上样前经甲醇和水活化，将酶解后的尿液样本全部上样，用水和甲醇/水淋洗，吹干后，用甲醇洗提，过滤后即为样品待测液；
(3)混合空白尿液和标准工作液的配制取三个非吸烟者的尿液混合均匀作空白尿液，配制不同浓度的l-0HP，3_0HB[a]P和3-0HB[a]A标准工作溶液；(4)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定分别吸取空白尿液和配制好的不同浓度的l-0HP、3_0HB[a]P和3_0HB[a]A标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中l-0HP、3-0HB[a]P和3-0HB[a]A 含量。步骤(I)中酶解过程依次加入的醋酸缓冲液(O. 5mol/L, pH5. O)和β -葡糖甘酸酶(30U/mL) /芳基硫酸酯酶(60U/mL)，其体积分别为2. 5mL和30 μ L。步骤(I)中用O. 2mol/L的HCl调节尿液的pH到5. O。步骤(4)中固相萃取柱选取2· OX IOOmm, 2· 5 μ m Phenomenex Synergi Hydro-RP色谱柱。步骤(4)中选取40%超纯水和60%乙腈初始流动相体系,分析时间为IOmin,进样量为10 μ Lo·步骤(4)中梯度洗脱条件为Omin-2. 5min,40%超纯水+60%乙腈；3. 5min_8. Omin,10% 超纯水 +90% 乙腈；8. lmin-11. 0min，90% 超纯水 +10% 乙腈；11. lmin-12. 0min，40% 超纯水+60%乙腈,流动相流速为380 μ m/min。步骤(4)串联质谱检测器的条件APCI+，喷雾针电压5500V ;离子源温度400° C ；雾化气为氮气，雾化气流速设为60psi，气帘气为氮气，流速为25psi，碰撞气8psi。步骤(4)中测定尿液中l-0HP、3_0HB[a]P和3_0HB[a]A含量的具体操作为吸取标准空白尿液和配制好的不同浓度的1-0HP，3-0HB[a]P和3-OHB [a] A标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，绘制1-0HP，3_0HB[a]P和3_0HB[a]A的线性回归方程，对酶解和固相萃取净化之后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对尿液样本优化了酶解条件、固相萃取条件，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果①与传统的液相色谱-荧光法比较，采用酶解法来检测游离和结合的1-0HP，3-0HB[a]P和3-0HB[a]A代谢物。优化了色谱条件，缩短了分析时间；②由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的3-0HB[a]P 的测定；③选取了氘代内标对三个化合物进行定量，使得方法的准确性更高，并消除了前处理过程中引起的误差；④本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
图1a为1-0HP的离子色谱图；图1b为3_0HB[a]P的离子色谱图；图1c为3_0HB[a]A的子离子色谱图2A为加标量为5ng的1-0HP的典型性色谱图(MRM m/z219. 2/189.1)；图2B为加标量为Ing的3_0HB[a]P的典型性色谱图(MRM m/z269. 1/252.1)；图2C为加标量为2. 5ng的3_0HB[a]A的典型性色谱图(MRM m/z245. 1/215.1)；图2D D9-1-OHP 的典型性色谱图(MRM m/z219. 2/198.1)；图3A为空白尿液样本中1-0HP的典型性色谱图(MRMm/z219. 2/189. 1，保留时间RT 3. 44min)；图3B为空白尿液样本中3-0HB[a]P的典型性色谱图(MRM m/z269. 1/252. 1，保留时间 RT 5. 94min)；图3C为空白尿液样本中3-0HB[a]A的典型性色谱图(MRM m/z245. 1/215. 1，保留时间 RT 4. 31min)；图3D为空白尿液样本中D9-1-OHP的典型性色谱图(MRM m/z219. 2/198. 1，保留时间 RT 3. 29min)。
具体实施例方式本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。一种同时测定尿液中l-0HP，3_0HB[a]P和3_0HB[a]A含量的方法，其测试过程是将室温下解冻尿液样本，混合均匀后离心，取上清液，加入盐酸调节PH，加入醋酸缓冲液和β -葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，酶解尿液样品。酶解后的样本通过C18固相萃取小柱净化，然后用旋转蒸发仪浓缩样品，最后利用LC-MS/MS系统分析l-0HP，3-0HB[a]P和3_0HB[a]A的含量。实验例I1.仪器与试剂安捷伦1200超高分辨液相色谱仪(自动进样器G1367D，二元溶剂泵 G1312B,柱温箱 G1316B) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)，API5500 三级四级杆串联质谱系统(Applied Biosystems, Foster City, CA),数据采集与处理在 Analystl. 5.1软件上实现(Applied Biosystems)。1-OHP 购自 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany,纯度 98. 5%)，3-0HB [a]P 购自 Institute for Reference Materials and Measurements (Belgium, EuropeanCommission,纯度 99. 4%), 3-0HB [a] A 购于 MRIGlobaKKansas City, Missouri,纯度 >97%)和内标D9-1-OHP购自 Toronto Research Chemicals Inc. (Toronto, Canada,化学纯度97%,同位素纯度99%)。β -葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶购自德国默克公司，高效液相色谱级、乙月青购自 TEDIA Company Inc. (Ohio, USA)。2.酶解尿液样本尿液样本在室温下解冻，混匀后移取IOmL尿液于25mL锥形瓶中，用0. 2M HCl将尿液pH调节到5，并加入2. 5mL0. 5M醋酸缓冲液(pH5.0)。加入30yL的β -葡糖甘酸酶(30U/mL) /芳基硫酸酯酶(60U/mL)后，在37° C的振荡水浴锅中酶解过夜。3.固相萃取纯化选取Supelco-ENVI C-18固相萃取柱(500mg, 3ml),上样前先经5mL的甲醇和5mL的水活化，将水解后的尿液样本全部上到固相萃取柱上，然后用IOmL水和10mL30%的甲醇/水淋洗样本，将淋洗液吹干后， 用4mL的甲醇洗提样本，将接收的所有洗提液放到旋转蒸发仪上蒸干，然后用150 μ L甲醇复溶，复溶液过O. 22 μ m有机相滤膜后储存在-20° C冰箱直到进行样品分析。4液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS )测定(I) LC-MS/MS 条件色谱柱以流动相体系进行梯度洗脱，初始流动相体系选取40%超纯水和60%乙腈，总分析时间为12分钟，梯度洗脱条件见表I。串联质谱检测器的条件:APCI+，喷雾针电压5500V ;离子源温度400° C ;雾化气为氮气，雾化气流速设为60psi，气帘气为氮气，流速为25psi，碰撞气8psi。利用连续流动注射(FIA)来优化离子源参数，优化后的结果见表2。整个分析过程由 Applied Biosystems Analyst versionl. 5.1 软件来控制。表I分析方法的梯度洗脱条件
权利要求
1.一种同时测定尿液中l-0HP、3-0HB[a]P和3-0HB[a]A含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)酶解尿液样本 取尿液样本，置于室温下解冻，调节尿液PH，依次加入醋酸缓冲液、β -葡糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，水浴振荡酶解过夜； (2)固相萃取纯化 选取C18固相萃取柱，上样前经甲醇和水活化，将酶解后的尿液样本全部上样，用水和甲醇/水淋洗，吹干后，用甲醇洗提，过滤后即为样品待测液； (3)混合空白尿液和标准工作液的配制取三个非吸烟者的尿液混合均匀作空白尿液，配制不同浓度的1-0ΗΡ，3-0HB[a]P和3-OHB[a]A标准工作溶液； (4)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定 分别吸取空白尿液和配制好的不同浓度的l-0HP、3-0HB[a]P和3-OHB [a] A标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中1-OHP、3-OHB [a] P和3-0HB[a]A 含量。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定尿液中1-0即、3-0耶[&] 和3-0耶[&从含量的方法，其特征在于，所述步骤(I)中酶解过程依次加入的醋酸缓冲液(O. 5mol/L, pH5. O)和β -葡糖甘酸酶(30U/mL) /芳基硫酸酯酶(60U/mL)，其体积分别为2. 5mL和30 μ L。
3..根据权利要求1所述的一种同时测定尿液中l-0HP、3-0HB[a]P和3_0HB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步骤(I)中用O. 2mol/L的HCl调节尿液的pH到5. O。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定尿液中l-0HP、3-0HB[a]P和3_0HB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中固相萃取柱选取2. OX 100mm, 2. 5 μ mPhenomenexSynergi Hydro-RP 色谱柱。
5.根据权利要求1所述的一种同时测定尿液中1-0即、3-0耶[&] 和3-0耶[&从含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中选取40%超纯水和60%乙腈初始流动相体系，分析时间为IOmin,进样量为10 μ L。
6.根据权利要求1所述的一种同时测定尿液中l-0HP、3-0HB[a]P和3_0HB[a]A含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为Omin-2. 5min，40%超纯水+60%乙臆；3. 5min-8. Omin, 10% 超纯水 +90% 乙臆；8. lmin-11. Omin, 90% 超纯水 +10% 乙臆；11.lmin-12. Omin, 40% 超纯水 +60% 乙腈，流动相流速为 380μηι/ηι; η。
7.根据权利要求1所述的一种同时测定尿液中1-0即、3-0耶[&] 和3-0耶[&从含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)串联质谱检测器的条件APCI+，喷雾针电压5500V ;离子源温度400° C ;雾化气为氮气，雾化气流速设为60psi，气帘气为氮气，流速为25psi，碰撞气8psi ο
8.根据权利要求1所述的一种同时测定尿液中1-0即、3-0耶[&] 和3-0耶[&从含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中测定尿液中l-0HP、3-0HB[a]P和3-OHB [a] A含量的具体操作为吸取标准空白尿液和配制好的不同浓度的1-0HP，3-0HB[a]P和3_0HB[a]A标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，绘制l-0HP，3-0HB[a]P和3_0HB[a]A的线性回归方程，对酶解和固相萃取净化之后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
全文摘要
本发明公开了一种同时测定尿液中1-OHP、3-OHB[a]P和3-OHB[a]A含量的方法。本发明依次采用β-葡糖甘酸酶酶解样品、固相萃取纯化、真空旋转蒸发仪浓缩样品、液相色谱-串联质谱仪进行测定，可快速、准确、同时检测出、尿液中1-羟基芘(1-OHP)，3-羟基苯并[a]芘(3-OHB[a]P)和3-羟基苯并[a]蒽(3-OHB[a]A)的含量水平。本发明采用氘代标准品作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差、串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性、选取了基质配标的方法，比纯水配标准品法有更好的准确性，能够消除基质效应的干扰。通过色谱柱以及梯度洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。
文档编号G01N30/88GK103063791SQ20121051998
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者侯宏卫, 胡清源, 熊巍, 张小涛, 刘彤, 陈欢, 朱风鹏, 李中皓, 庞永强, 边照阳, 刘楠, 张洪非, 唐纲岭 申请人:国家烟草质量监督检验中心