分析标准品及其使用方法与流程

文档序号:17580671发布日期:2019-05-03 20:54阅读:195来源:国知局
分析标准品及其使用方法与流程

本申请主张2016年5月6日提交的美国临时专利申请no.62/332,879的优先权,通过引用将其并入本文。

序列表

本申请含有通过efs-web电子提交至美国专利和商标局的序列表,该序列表为ascii文本文件,标题为“2017-05-05-sequencelisting_st25.txt”,大小313千字节,生成于2017年5月5日。包含在序列表中的信息通过引用在此并入。



技术实现要素:

本公开一般地描述分析标准品,其使得能够在包括多种多核苷酸分子的样品中检测和/或测量取样、加工和/或扩增误差。

在一个方面,本公开描述了用于在样品中测量和校正扩增偏倚(amplificationbias)的方法。通常,所述方法包括获得包括多核苷酸分子的样品;将至少一种检测两种样品多核苷酸之间的扩增偏倚的合成标准品掺入所述样品;在经掺入的样品中扩增多核苷酸;对第一样品多核苷酸、第二样品多核苷酸,以及所述标准品测序;测量所述合成标准品多核苷酸、所述第一样品多核苷酸,以及所述第二样品多核苷酸的出现频率;将测量的所述合成标准品多核苷酸的出现与所述合成标准品多核苷酸的预期出现频率比较,由此生成合成标准品多核苷酸偏倚值;以及根据所述合成标准品偏倚值校正所述第一样品多核苷酸和所述第二样品多核苷酸的出现频率。

在另一方面,本公开描述了在多种多核苷酸之间确定扩增偏倚的另一方法。通常,所述方法包括扩增样品中的多种多核苷酸,所述样品包括第一样品多核苷酸,第二样品多核苷酸;以及多种合成标准品多核苷酸,其中所述多种合成标准品包括第一合成标准品多核苷酸和与所述第一合成标准品多核苷酸在g-c含量、二级结构、扩增子大小,或与引物序列的匹配程度方面有差异的第二合成标准品多核苷酸;对所述第一样品多核苷酸、所述第二样品多核苷酸,以及所述多种合成标准品多核苷酸测序;测量所述第一样品多核苷酸、第二样品多核苷酸、所述第一合成标准品多核苷酸,以及所述第二合成标准品多核苷酸的出现频率;将测量的所述第一合成标准品多核苷酸的出现与所述第一合成标准品多核苷酸的预期出现频率比较,由此生成第一合成标准品值;将测量的所述第二合成标准品多核苷酸的出现与所述第二合成标准品多核苷酸的预期出现频率比较,由此生成第二合成标准品值;以及如果所述第一合成标准品值与所述第二合成标准品值不同,检测扩增偏倚。

在另一方面,本公开描述了在多种多核苷酸之间确定扩增偏倚的另一方法。通常,所述方法包括扩增样品中的多种多核苷酸,所述样品包括具有第一无pcr定量标签(pcr-freequantitationtag)的第一合成多核苷酸和包括第二无pcr定量标签的第二合成多核苷酸;消化所述第一合成多核苷酸以释放所述第一无pcr定量标签;消化所述第二合成多核苷酸以释放所述第二无pcr定量标签;对所述第一无pcr定量标签和所述第二无pcr定量标签测序;以及测量所述第一无pcr定量标签和所述第二无pcr定量标签的丰度。

在另一方面,本公开描述了用于在包括多种多核苷酸的样品中检测二次抽样错误(sub-samplingerror)的方法。通常,所述方法包括获得包括至少第一样品多核苷酸和第二样品多核苷酸的样品;将至少一种设计为检测二次抽样错误的合成多样性标准品掺入所述样品;在经掺入的样品中扩增多核苷酸;对第一样品多核苷酸、第二样品多核苷酸,以及所述至少一种合成多样性标准品测序;测量所述合成多样性标准品多核苷酸的出现频率;将测量的所述合成多样性标准品多核苷酸的出现与所述合成多样性标准品多核苷酸的预期出现频率进行比较;以及检测所述样品中的二次抽样错误,如果所测量的所述合成多样性标准品的出现小于所述合成多样性标准品多核苷酸的预期出现频率。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述合成标准品多核苷酸可包括16srrna基因多核苷酸。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述合成标准品多核苷酸可包括多种不同的合成标准品多核苷酸。在一些实施方案中,其中所述不同的合成标准品多核苷酸可包括经设计以检测扩增中的不同偏倚的差异。例如,第一合成标准品多核苷酸和第二合成标准品多核苷酸可在g-c含量、二级结构、扩增子大小,或与引物序列的匹配程度方面有差异。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述合成标准品多核苷酸可包括引物编辑标准品。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述合成标准品多核苷酸可包括从添加至所述样品的生物学标准品生物体(biologicalstandardorganism)获得的多核苷酸。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述合成标准品多核苷酸可包括环状多核苷酸。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述合成标准品多核苷酸以确定的水平掺入样品中,以便测量所述样品中多核苷酸的绝对或相对丰度。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,多种合成标准品多核苷酸以多种确定的浓度掺入样品中,以便测量检测限。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,扩增所述多核苷酸可包括采用单组引物。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述合成标准品多核苷酸可包括允许所述合成标准品的无pcr定量的特征。例如,所述允许所述合成标准品的无pcr定量的特征可包括条码(barcode)。

在上文总结的各种方法的各种实施方案中,所述第一样品多核苷酸可来自第一微生物,所述第二样品多核苷酸可来自第二微生物。

以上对本发明的总结无意描述本发明的每个公开的实施方案或者每种实践。以下的描述更具体地例举了阐释性实施方案。在该申请的若干个地方,通过实例的列表提供指导,这些实例可以以各种组合使用。每种情形下,所给出的列表仅用作代表性组,而不应解释为排他性列表。

附图简要说明

图1.含有标准品分子的示例性标准品构建体的设计,用于质粒线性化的归巢内切核酸酶(homingendocuclease)i-scei位点,用于基于测序对标准品和标准品混合样(standardpools)定量的侧翼有mlyi的无pcrillumina测序盒。

图2.16srrna基因v4515f区引物编辑标准品(seqidno:288-318)的设计。引物错配被阴影加深。

图3.磷硫醇(phosphorothiol)键(its*引物组)的引入可降低接头二聚体的形成(不希望的引物编辑过程的副作用),表明引物编辑的程度可采用磷硫醇修饰来调节。

图4.用mlyi消化可释放含有定量条码(barcode)的148bp分子。

图5.illumina接头侧翼的mlyi-1释放的定量条码可直接测序并用于在复杂混合样中定量标准品分子的丰度。

图6.对应于模拟群落(mockcommunity)测序数据集之中掺入型(spike-in)合成标准品的read百分比与预期的(靶向的)百分比很好地相关。

图7.示例性模拟群落的丰度分析。上:采用kapahifi(左)或taq(右)扩增的hmp均匀模拟群落(hm-276d)的未校正的(原始的)丰度测量值。下:应用了基于线性化的v4合成标准品的校正因子的丰度测量值。

图8.模拟群落数据中观察到的痤疮丙酸杆菌reads的量(左侧条)或者三种不同浓度的合成标准品掺入物的线性化v4合成标准品数据(右侧条)。

图9.未校正的和经采用基于环状(未切割)或线性化的v4合成标准品的校正因子校正的hmp均匀模拟群落(hm-276d)数据的比较。黑色框表示线性化标准品“过校正(overcorrect)”样品的案例。

图10.hmp均匀(even)(hm-276d,左)或参差(staggered)(hm-277d,右)模拟群落的集合误差(aggregateerror)(rmsd)测量值,具有或没有采用环状(上)或线性化(下)标准品进行的基于v4合成标准品的校正。

图11.未校正的和采用环状(上)或线性v4合成标准品(下)校正的数据的比较,其中进行(右)或不进行(左)模板dna的打断(shearing)。

图12.显示已采用二次抽样至各种read深度的环状(上)或线性(下)v4合成标准品reads应用校正因子时,定量hmp模拟群落的准确性方差的图。

图13.环状标准品分子展示了增加的引物编辑,其在这里作为对应于痤疮丙酸杆菌(其检测依赖于引物编辑的物种)的reads比率被检测到。

图14.基于线性化的v4合成标准品的校正因子(kapa.hm.276d.2500l和kapa.hm.276d.1kb.2500l)抬高了对痤疮丙酸杆菌丰度的评估(标准品的较差引物编辑导致虚高的校正因子),而基于环状v4合成标准品的校正因子(kapa.hm.276d.2500c和kapa.hm.276d.1kb.2500c)改善了对痤疮丙酸杆菌的定量准确性。

图15.合成标准品分子reads的缺乏可用于标示扩增人为因素(amplificationartifacts)导致的分类漏失(dropoutoftaxa)(本例中,taq聚合酶未能扩增痤疮丙酸杆菌模板)。

图16.错误校正聚合酶(error-correctingpolymerases)的引物编辑允许回收与扩增引物有错配的生物体。(a)痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)16srrna基因的16srrna基因v4引物区(seqidno:319和seqidno:321)与v4515f(seqidno:320)和v4806r引物(seqidno:322)序列的比对。与v4515f和v4806r引物的错配位置被加深。(b)所指出的方法中映射到痤疮丙酸杆菌的reads百分比。误差条为+/-sem。***p<0.01,*p<0.05,通过带有tukeyhsdpost-hoc检验的anova确定。(c)使用di规程以q5聚合酶测量的hm-276d均匀模拟群落数据中v4515f引物(seqidno:320)区中的被编辑碱基平均百分比。误差条为+/-sem,n=4。(d)使用di规程以q5聚合酶测量的hm-276d均匀模拟群落数据中v4806r引物(seqidno:322)区中的被编辑碱基平均百分比。误差条为+/-sem,n=4。(e)使用di规程以kapahifi聚合酶测量的hm-276d均匀模拟群落数据中v4515f引物(seqidno:320)区中的被编辑碱基评价百分比。误差条为+/-sem,n=4。(f)使用di规程以kapahifi聚合酶测量的hm-276d均匀模拟群落数据中v4806r引物(seqidno:322)区中的被编辑碱基评价百分比。误差条为+/-sem,n=4。(g)使用di规程以taq聚合酶测量的hm-276d均匀模拟群落数据中v4515f引物(seqidno:320)区中的被编辑碱基评价百分比。误差条为+/-sem,n=4。(h)使用di规程以taq聚合酶测量的hm-276d均匀模拟群落数据中v4806r引物(seqidno:322)区中的被编辑碱基评价百分比。误差条为+/-sem,n=4。

图17.kapahifi酶浓度对准确性、嵌合体形成(chimeraformation)、样品平衡(samplebalance),以及接头二聚体形成(adapterdimerformation)的影响。采用0.25x、0.5x、1xkapahifi聚合酶,或kapareadymix扩增5种不同起始模板浓度20、30,或35个循环,用于hm-276d均匀模拟群体的曲线显示:(a-d)rmsd;(e-h)嵌合reads的百分比;(i-j)总的reads数量;(m-p)接头二聚体百分比。

图18.kapahifi酶浓度对引物编辑效率和引物编辑人为因素出现的影响。(a)使用di规程以kapareadymix测量的来自空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)的纯分离株数据中v4515f引物(seqidno:320)中被编辑碱基的分布。(b)使用di规程以kapareadymix测量的来自空肠弯曲菌的纯分离株数据中v4806r引物(seqidno:322)中被编辑碱基的分布。(c)来自空肠弯曲菌的纯分离株的示意性16sv3-v5扩增。该扩增子包含v4515f引物序列,使得能评估内源序列。(d)在序列的位置6处观察到的每个碱基的百分比对应于来自空肠弯曲菌的v3-v5扩增子中v4515f引物序列。

图19.16srrna基因v4区%gc和预测的二级结构(dg)的分布,黑色空心圆(blackopencircles),以及设计的过程控制标准品的分布,浅色填充圆(lightfilledcircles)。黑色片区(blacksmear)为密集重叠黑色空心圆的结果。

图20.16srrna基因v4区大小的天然分布。过程控制标准品范围从193bp至313bp。

图21.采用kapahifi聚合酶的reads分析。(a-d)不同浓度kapahifi聚合酶情况下,跨一系列pcr循环数量和起始模板浓度回收的痤疮丙酸杆菌reads比例。(e)v4515f引物(seqidno:320)碱基被编辑成鸟嘌呤的比例。(f)v4806r引物(seqidno:320)碱基被编辑成鸟嘌呤的比例。(seqidno:322)

图22.多样性标准品的设计和使用。(a)一个多样性标准品的设计实例,其中该标准品特有的10-bp序列标签(seqidno:323)在侧翼加有其他多样性标准品共有的序列区,用于例如通过pcr扩增从样品回收该标签。(b)构建复杂度等于1000个标签的多样性标准品混合样,每个标签代表总群体的0.1%。出于阐释的目的,显示了用于标签1-3和标签1000的的标签序列(阐释的seqidno:323-326),但是该整个混合样含有1000个独特标签序列。(c)阐对作为约束(constricting)多样性标准品混合样的分子群体大小结果而经历的序列标签多样性丧失的说明。(d)对使用多样性标准品混合样来检测和评估经过几个分子步骤的样品的群体瓶颈的说明。这种估计所需要的一切是对最终数据中每个标签的频率的可靠测量。

图23.多样性标准品组的设计和使用。(a)5个多样性标准品组的设计实例,每个含有9个多样性标准品的等摩尔混合样(图22)。每个多样性标准品组以不同浓度合并成全部5个组的超级混合样,使得每个组中每个标签的频率是已知的。例如,组a中的所有标签在以10%存在,组b中的所有标签以1%存在,等等。(b)对作为约束多样性标准品组混合样的分子群体大小结果而经历的序列标签多样性的丧失的说明。

图24.引物编辑标准品的设计和分析。(a)引物编辑标准品的v4515f区的设计(seqidno:288-318)。引物错配被阴影加深。(b)引物编辑标准品(seqidno:288)被用于证实很多校对聚合酶可支持引物编辑,尽管程度不同。(c)引物编辑标准品被用于证实对模板序列(seqidno:327)的引物编辑几乎没有明显的序列特异性。(d)引物编辑标准品被用于证实kapahifi聚合酶对模板序列(seqidno:327)的引物编辑是浓度依赖的。(e)引物编辑可导致改变野生型大肠杆菌引物去匹配突变的模板(浅色曲线),或者突变的引物去匹配野生型大肠杆菌模板(深色曲线),它们在给定的引物位置具有类似的效率。

图25.引物编辑标准品被用于证实kapahifi聚合酶的引物编辑可在特定位置受阻于单个磷硫醇键。

图26.采用生物物理标准品和大小标准品分析偏倚。(a)基于greengenes数据库中的序列的16srrna基因v4区%gc和预测的二级结构(dg)的分布,黑色空心圆,以及设计的生物物理标准品的分布,浅色填充圆。如同图19,黑色片区为密集重叠的黑色空心圆的结果。(b)基于greengenes数据库中序列的16srrna基因v4区大小的分布。v4大小标准品范围从193bp至313bp。(c-d)生物物理标准品和大小标准品被用于报告以kapahifi聚合酶扩增时序列性质导致的偏倚。(e-f)生物物理标准品和大小标准品被用于报告以accuprimetaq聚合酶扩增时序列性质导致的偏倚。

图27.采用掺入型对照分析pcr偏倚。(a)合成掺入型对照与未知组成的样品一起扩增。该掺入型对照用于测量特异于不同的模板分子的pcr偏倚,以及用于生成校正矩阵,该校正矩阵用于推断样品中不同物种的起始丰度。(b)采用16sv4区测量的包括8个细菌物种(其中5个(深色圆点)由合成标准品靶向,3个(浅色圆点)不是)的模拟群落的丰度。(c)采用16sv1-v3区测量的该相同模拟群落的丰度。(d-e)当将来自合成掺入型标准品的校正因子用于校正扩增偏倚时的丰度测量值。经校正的分类(深色圆点)的丰度接近预期值(对角线虚线)。

图28.无pcr条码的设计和分析。(a)并入无pcr定量条码构建体的合成dna标准品质粒的设计。(b)采用无pcr定量条码定量质粒标准品混合样。采用这种丰度信息将该相同的标准品组再混样,并采用该无pcr条码定量方法对该第二混合样定量。(c)用无pcr条码定量方法对均匀再混样混合物的三次独立技术性重复,证实用这种技术获得的测量值是高度精确的。

图29.采用无pcr条码的丰度分析。(a-b)均匀混合的质粒标准品混合样的定量比较:采用无pcr条码定量方法或不同的pcr循环量以制备文库用于illumina测序(虚线表示预期值)。(c)用无pcr条码或不同数量的pcr循环测量的均匀混合的质粒混合样与预期值的均方根误差。(d)用无pcr条码或不同数量的pcr循环测量的质粒参差混合物与预期值的均方根误差。(e)无pcr条码测量值与微滴式数字pcr数据很好地相关。增加的pcr循环导致所测量的丰度与微滴式数字pcr数据的降低的相关性。

图30.无pcr条码构建体。(a)含有无pcr条码构建体(seqidno:328)的tn5转座子构建体,其已用于在大肠杆菌中生成超过13,000个插入转座子的文库。(b)通过在转化进大肠杆菌之前以mlyi释放该无pcr条码构建体来试验该文库的条码多样性(转座前文库,黑色曲线),并证实该无pcr条码构建体可从大肠杆菌基因组释放并直接测序(转座后文库,灰色曲线)。(c)使用多种酶以允许无pcr定量条码构建体的多重化(multiplexing)的策略。(d)以mlyi切割,试验这4个质粒的均匀混样的混合物的成簇特异性。存在其他条码渗漏(bleed-through)的事实提示可能需要大小选择以改善特异性。(e)串联的无pcr条码构建体可克隆进转座子或质粒载体骨架以潜在地允许无pcr条码测量的多重化。

阐释性实施方案的详细描述

本公开描述了几种用于在包括扩增组分的基于扩增子的分析中定量和校正误差和偏倚(errorsandbiases)的分析标准品(analyticalstandards),该基于扩增子的分析例如为具有扩增组分的微生物组实验(microbiomeexperiments)和/或定量实验,例如tn-seq或混合的rna干扰或crispr-cas9筛选。

在具体应用中使用的分析标准品可为合成的核酸标准品或生物学(基于重组生物体的)标准品。该分析标准品可为合成标准品或生物学标准品。生物学标准品可为包括任何类型的合成标准品序列的重组生物体。该生物学标准品还可包括另外的合成序列,该另外的合成序列被特异设计来允许测量从生物学标准品细胞提取和回收核酸的效率。

合成标准品可为被单独扩增的独立试剂,或者其可为被添加至样品以监测和/或控制样品扩增和随后加工期间发生的错误和偏倚的“掺入型”标准品。例如,合成的掺入型标准品可包括经修饰的16srrna基因核苷酸,其被设计为掺入扩增反应中。尽管下文在合成标准品包括经修饰的16srrna基因核苷酸的示例性实施方案的上下文中有讨论,但该合成标准品可包括来自任何适合的标记基因(markergene)的核苷酸,例如来自真核细胞的18srrna或内部转录间隔区(its)。

在一些实施方案中,当作为“掺入型(spike-in)”标准品使用时,合成标准品分子可以添加至样品以提供例如1∶10,000至100∶1的标准品多核苷酸与样品多核苷酸比例(标准品多核苷酸:样品多核苷酸)。例如,合成标准品可添加至样品以提供至少1∶10,000、至少1∶5,000、至少1∶1000、至少1∶500、1∶100、至少1∶50、至少1∶10、至少1∶5、至少1∶1、至少5∶1、至少10∶1,或至少50∶1的最小标准品多核苷酸:样品多核苷酸比例。合成标准品可添加至样品以提供不超过100∶1、不超过50∶1、不超过10∶1、不超过5∶1、不超过1∶1、不超过1∶5、不超过1∶10,或不超过1∶50的最大标准品多核苷酸:样品多核苷酸比例。合成标准品可添加至样品以提供由范围定义的标准品多核苷酸:样品多核苷酸比例,该范围具有任何上文列出的最小标准品多核苷酸:样品多核苷酸比例和大于该最小标准品多核苷酸:样品多核苷酸比例的任何上文列出的最大标准品多核苷酸:样品多核苷酸比例作为端点。

在其他实施方案中,当作为掺入型标准品使用时,该合成标准品分子可以1个分子至100,000个分子的量添加至样品。例如,该合成标准品分子可以至少1个分子、至少10个分子、至少100个分子、至少500个分子、至少1000个分子、至少5000个分子,或至少10,000个分子的最小量提供。该合成标准品分子可以不超过100,000个分子、不超过50,000个分子、不超过10,000个分子、不超过5000个分子、不超过1000个分子、不超过500个分子、不超过100个分子、不超过50个分子,或不超过10个分子的最大量提供。该合成标准品可添加至样品以提供一范围内的合成标准品分子,该范围具有任何上文列出的标准品合成分子最小量和大于该合成标准品分子最小量的任何上文列出的合成标准品分子最大量作为端点。

无论合成标准品是设计为独立试剂还是为掺入型标准品,合成标准品都可为如下类型的序列特异标准品的一种或更多种:定量偏倚标准品(quantitativebiasstandard)、过程标准品(processstandard)、引物编辑标准品(primereditingstandard),和/或多样性标准品(diversitystandard)。用于本文时,定量偏倚标准品设计为测量可有差异地影响来自不同生物物种的序列的扩增效率的序列特异的定量扩增错误和偏倚。用于本文时,过程标准品设计为评估序列特征对扩增偏倚的影响。用于本文时,引物编辑标准品设计为测量扩增期间dna聚合酶引起的引物编辑的发生和程度。用于本文时,多样性标准品设计为测量实验室加工期间分子群体中的瓶颈(bottlenecks)。

过程标准品可包括分子集合(acollectionofmolecules),它们在很多不同的序列特性(可影响扩增)方面系统地变化。可影响扩增的示例性特性例如包括gc含量、二级结构、扩增子大小,和/或与引物序列的错配程度。过程标准品可设计为与试验样品平行运行,以检测扩增过程中的系统性偏倚。

引物编辑标准品可包括经修饰以系统地在它们的引物结合位点中有区别并且报告pcr反应中引物编辑功效的16srrna基因核苷酸序列。引物编辑标准品可掺入扩增反应中。再一次地,尽管下文在合成标准品包括经修饰的16srrna基因核苷酸的示例性实施方案上下文中有讨论,但该合成标准品可包括来自任何适合的标记基因的核苷酸,例如来自真核细胞的18srrna基因或内部转录间隔区(its)。

多样性标准品可包括混合物中的已知浓度的的独特序列标签(uniquesequencetags)群体,以使得这些标准品可用于报告分子群体的绝对大小(即,分子数量),以及在该群体操作期间于群体中出现的约束(constrictions)(“瓶颈”)。如果该群体大小(分子数量)减少至低于多样性标签数量的数量,则标签多样性将通过从该混合物中随机丢失一些标签而永久地减小。标签“漏失(drop-out)”的可能性将随着群体大小趋近于标签多样性而增加。

此外,可设计多样性标签组以允许通过混合跨一系列相对浓度(例如,对于每个组两倍浓度稀释)的这类多样性标签组来跨宽范围测量分子群体大小,使得对较低相对浓度的组首先观察到多样性丧失。

当多样性标准品或多样性标准品组掺入接受串行操作(serialmanipulation)的样品中时,它们允许通过在操作后的终点测量多样性标准品或多样性标准品组的回收(recovery),例如通过下一代测序,来整合评估这些操作期间的群体“瓶颈”。

丰度标准品(abundancestandards)可为掺入样品中以允许对样品模板分子绝对或相对定量的分子集合。

生物学标准品(biologicalstandards)可用于检测提取中的偏倚,并且可在提取前掺入样品中以监测从不同类型的微生物的dna提取效率,包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌或其它微生物体。生物学标准品可包括一种或更多种具有不同膜性质的生物体,它们设计为例如包括可被扩增和定量的独特序列标签。在这些实施方案中,序列标签可例如为经编辑的16srrna基因多核苷酸或不同的序列。在其他实施方案中,这些独特标签可为设计来测量群体大小和群体大小中的瓶颈的多样性标准品或多样性标准品组,使得能绝对或相对定量,或者评价检测限。生物学标准品可以为复制缺陷的或者以其他方式失活的,使得当提供在商业分析试剂盒中时它们不能由用户“再生长”。在其他情况下,生物学标准品可为有复制能力的,并设计为报告发生在样品运送或保存中的细菌生长。

本文描述的标准品和方法的各个实施方案可提供一个或更多个如下性质。第一,某些标准品和方法可校正用于已知靶的不同引物组之间扩增效率差异导致的偏倚。这些标准品和方法可采用单一引物组校正扩增子性质导致的偏倚。第二,通过合并不止一种类型的标准品,本文描述的某些标准品和方法使得能够测量和校正模板分子和/或另外类型的pcr人为因素(artifact)内在的生物物理性质导致的偏倚,例如引物错配导致的漏失。第三,某些合成的标准品并入无pcr定量条码(pcr-freequantificationbarcodes),该无pcr定量条码使得例如能够准确定量该标准品分子。第四,多样性标准品和标准品组使得能够检测和半定量测量样品加工期间由分子群体大小中瓶颈引入的人为因素。

示例性核苷酸标准品的构建体设计阐释在图1中。合成后,标准品可以被克隆进质粒并转化进宿主细胞(例如,大肠杆菌(e.coli)),进行繁殖。该构建体包括(1)标准品序列,(2)限制性位点,用于任选地在扩增前线性化质粒,以及(3)条码。该标准品序列可包括上文总结的核苷酸标准品的任意一种或更多种,即合成的扩增偏倚标准品、过程标准品、引物编辑标准品,和/或多样性标准品。在一些实施方案中,该限制性位点可包括用于归巢内切核酸酶如i-scei的识别序列。当存在限制性位点时,该位点可由任何适合的限制性内切核酸酶识别,只要该限制性内切核酸酶的识别序列不存在于扩增引物之间。

在图1阐释的实施方案中,该构建体包括12bp的i7条码:aatcagtctcgt(seqidno:7)。具体的条码序列可为任意的。

另外,对于允许无pcr定量的实施方案,该构建体可包括另外的使得能够直接无pcr定量标准品分子的条码序列。在一些实施方案中,该无pcr定量条码可例如为侧翼有mlyi的附加有illumina接头的20bp条码,以使得该标准品可采用illumina测序直接定量,而无需pcr扩增。该无pcr定量使得能够改善合成标准品的混合池(pools)的精确性。用于定量标准品混合池的常规方法会是进行定量pcr,这可将偏倚引入分析中,并由此导致浓度测量的不准确。阐释在图1中的示例性实施方案包括有待于通过适合的内切核酸酶(例如图1中阐释的mlyi)消化而释放的148bp的条码序列(其通常对于每个合成标准品是不同的)。但是该条码可为任何适合的长度。所释放的分子可直接测序(例如,采用illumina测序仪),无需居间的文库制备或pcr。

合成掺入型标准品

在一些实施方案中,掺入型合成标准品可包括在接受分析的样品的所有生物体中都存在的核苷酸。例如,在一些实施方案中,该掺入型标准品可包括编码16srrna基因的v4可变区的核苷酸。针对确定的细菌模拟群落(bacterialmockcommunity)(由人类微生物组计划(humanmicrobiomeproject)制备)设计合成的标准品分子,该细菌模拟群落由20种不同的生物体组成,它们或者处于相等丰度(“均匀模拟群落(evenmockcommunity)”),或者处于不同丰度(“参差模拟群落(staggeredmockcommunity)”)。针对存在于构成该模拟群落的生物体的基因组中每个独特16s-v4编码区合成合成的标准品(参见下文合成的标准品01-23;seqidno:8至seqidno:30)。合成后,标准品被克隆进质粒并转化进大肠杆菌。对于存在于hmp模拟群落中的每个分子在类似位置修饰16sv4区(引物位点每一外侧上+20bp),以具有“tct”标签。该修饰在高度保守的位置进行,该位置通过采用clustalw从greengenes数据库比对500个16s基因而鉴定。选择所预测的茎环区内的高度保守位点,以最小化该“tct”插入可能对合成的标准品分子二级结构的任何影响。另外,设计了几种分子来试验添加至16sv4区的标签的序列组成或长度是否影响动力学(试验以下的3bp标签序列“ttt”、“tca”、“ccc”、“ggg”,以及1、2、5、7和10bp的标签;参见下文合成的标准品24至32;seqidno:31至seqidno:39)。

在其他实施方案中,掺入型合成标准品可包括存在于接受分析的所有生物体中的全长核苷酸。因此,在一个实施方案中,该合成的掺入型标准品可包括来自存在于所分析的样品中的每种生物体的全长16srrna核苷酸序列。可例如通过计算两全长16srrna编码序列以及v3-v6可变编码区的成对汉明距离(pair-wisehammingdistances),而能够评价物种内的分子是如何紧密相关的。在示例性的16srrna情形中,该汉明距离表明,在单一物种中,该16srrna基因变动小于1%,这通常在确定操作分类单元(otus)中用作序列相似性的严谨阈值。因此,可基于每个生物体的一个代表性序列(例如,与来自给定生物体的所有其他16srrna序列具有最低的累积汉明距离的序列)设计标准品,作为用于全长标准品的基础。

为了使用这些全长标准品来评价该3bp外来序列标签的初级序列(primarysequence)或位置对标准品模仿模板特异的pcr偏倚的影响,将三个不同的3bp标签“tag”、“tct”、和“cat”分别插入v3、v4、和v5区的高度保守的节段中(下文合成的标准品78至97;seqidno:85至seqidno:104)。除了靶向hmp模拟群落生物体的带标签的全长合成标准品之外,还制备了用于普通人体肠道微生物的另外25个带标签的全长合成标准品(下文合成的标准品208至232;seqidno:215至seqidno:239)。

为了试验采用合成标准品校正扩增偏倚的功效,采用一系列模板浓度和两种不同的酶(kapahifi和5primetaq)扩增了均匀模拟群落dna和参差模拟群落dna。将不同量和不同相对丰度的合成标准品dna掺入模拟群落样品中(每种生物体0、25、250,以及2500个标准品分子)。采用扩增16srrna基因v4区并且还包含接头尾部(adaptertails)的引物扩增样品。在初步扩增(primaryamplification)后,将扩增子在无核酸酶的水中1∶100稀释,采用靶向该接头尾部并添加illumina测序所需的流动池接头和索引的索引引物再扩增10个循环。在该索引pcr后,采用sequalprep板归一化,混样(pooled),并用1.8xampurexp微珠纯化和浓缩。接着用picogreen对该混合样定量,稀释至8pm,并在miseq2×300bp运行的一部分上测序。

测序后,采用自定义脚本(customscript)将每个样品的reads分成两个文件。一个文件含有合成标准品reads,其是通过添加的“tct”标签鉴定的,并被映射到含有标准品序列的参照文件。另一文件含有剩余的reads,并被映射至含有模拟群落序列的参照文件。

基于分配至标准品文件和模拟群落文件的reads相对量,掺入分子与模拟群落分子的相对浓度被很好地靶向(图6)。恰当地靶向该比例的能力使得能够足够深的对标准品分子测序以准确定量标准品分子的丰度,但不是过深而使得标准品reads淹没了所研究的样品。

在一些应用中,标准品分子可用于在模拟群落数据中校正扩增偏倚。基于所观察到的与预期的标准品分子的比例生成物种特异的校正因子(预期值为以上采用无pcr定量条码测量,如下文更详细描述的)。然后,将这些校正因子应用于模拟群落数据,并将应用校正之前和之后的数据准确性进行比较(相对于已知的起始丰度)。对于一些物种(例如龋齿放线菌(actinomycesodontolyticus)和加氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)),使用基于合成标准品的校正因子改善了定量准确性。但是,对于其他物种(最突出地,痤疮丙酸杆菌(proprionibacteriumacnes(p.acnes)),使用基于合成标准品的校正因子降低了定量准确性。

痤疮丙酸杆菌是hmp模拟群落中唯一的在其16srrna基因中具有与v4扩增引物错配的生物体。来自该生物体的reads仅在使用校对聚合酶(proofreadingpolymerase)的测序数据中看到,该校对聚合酶能够编辑引物序列以匹配该痤疮丙酸杆菌模板(图16)。当评估从模拟群落或合成标准品的痤疮丙酸杆菌序列的回收程度时,基于标准品的校正因子抬高了痤疮丙酸杆菌的丰度,是由于标准品分子没有准确报告采用痤疮丙酸杆菌模板时发生的引物编辑(图8)。

为了找出采用基于合成标准品的校正因子时对几个物种的错估,评价了质粒线性化对(a)标准品序列的扩增和(b)引物校正程度的影响。再一次地,采用一序列模板浓度和两种不同的酶(kapahifi和5primetaq)扩增均匀模拟群落dna和参差模拟群落dna。将不同量和不同相对丰度的合成标准品dna掺入模拟群落dna样品中(每种生物体0、25、250,以及2500个标准品分子)。

采用环状(未切开)质粒改善了基于标准品的校正的准确性,包括用于痤疮丙酸杆菌(图9)。此外,基于环状标准品的校正相对于未校正数据和线性标准品校正的数据(其比未校正数据准确性低)改善了跨整个均匀模拟群落的总体准确性(如通过与预期值的均方根差(rmsd)衡量的)。线性和环状标准品二者都改善了对参差模拟群落定量的准确性,尽管这种作用很可能是由该群落中的几个高丰度生物体驱动的(图10)。

还试验了打断模板dna(使其更接近线性标准品分子)对准确性的影响。在未打断模板和打断成平均大小300bp、1kb,或5kb的模板之间,在以环状或线性标准品测量或校正中没有实质差异(图11)。

此外,评价了标准品混合样获得对标准品分子相对丰度的准确测量所需测序的深度。将标准品reads二次采样(subsampled)至不同水平,计算校正因子,将校正因子应用至模拟群落数据,并且检查定量的总体准确性的方差。在低的二次采样深度(<1,000reads)时,所计算的rmsd值的方差高。然而,2,500reads产生了稳健的定量(图12)。这证实,标准品应该能够以小部分样品浓度掺入并且仍能准确定量。

使用环状标准品看到的准确性的改善可能是至少部分地由于环状标准品更有效地报告引物编辑。该环状标准品回收了更大量的对应痤疮丙酸杆菌的标准品reads(图13),这导致对该生物体的基于标准品的校正的改善(图14)。环状和线性化标准品模板之间在引物编辑方面的这种差异的机制目前未知,正在研究中。

过程标准品

示例性过程控制标准品设计为报告扩增偏倚,该扩增偏倚可通过扩增条件和试剂与模板分子的生物物理性质(例如,gc含量、扩增子大小,和/或二级结构)之间相互作用而发生。通过评估greengenes数据库中所有可识别的v4区域的gc含量和预测的二级结构来评估16srrna基因的v4区域中的天然遗传变异所涵盖的参数空间。接着,在计算机中(insilico)改动大肠杆菌16rrna基因的序列,添加不同量的gc或at偏倚并生成数百万个变动序列的计算机文库(insilicolibrary)。然后,为这些序列生成二级结构预测,过滤掉与greengenes数据库中的序列有>97%一致性的序列,并选择一组覆盖了天然gc含量范围和二级结构变动的分子(图19)。表征了v4区大小的天然出现的分布并制备了涵盖该大小分布的一组标准品,它们可用于检测大小选择或扩增导致的扩增子大小中的偏倚(图20)。(参见下文的过程控制标准品33至96,seqidno:40至seqidno:103)。采用类似的设计考虑,为真核its2区制备了另一组过程控制标准品(下文的合成标准品160至207,seqidno:167至seqidno:214)。

引物编辑标准品

引物编辑标准品的产生源于意想不到的现象。错误校对聚合酶在扩增期间可编辑引物序列以纠正引物序列和模板分子之间的错配(图16)。由于与痤疮丙酸杆菌16srrna基因的错配,v4515f和v4806r引物通常对于检测痤疮丙酸杆菌表现不佳(图16)。采用emp规程,或以di(taq)规程检测到低水平的痤疮丙酸杆菌;该物种事实上在发表的模拟群落emp数据集中也缺失(图16;nelson等,2014,plosone9:e94249)。出乎意料地,以di(q5)和di(kapa)规程观察到高水平的痤疮丙酸杆菌(图16)。当检查对应用于di(q5)和di(kapa)数据集的扩增引物的reads部分时,约4%的v4515f引物序列在位置18处已从a>g编辑,并且约4%的v4806r引物序列在位置20处已从t>g编辑,修饰匹配痤疮丙酸杆菌模板序列(图16)。在di(taq)数据集中未观察到这样的修饰(图16)。这些结果表明校对聚合酶可在pcr反应中编辑扩增引物,允许从模板含有引物错配的生物体扩增序列。引物编辑的效率是值得注意的,因为该编辑必须基本上在每个pcr循环中发生以便在最终的测序reads中观察到。

接头二聚体形成的程度,从而测定的整体灵敏度,也可以通过调整聚合酶的浓度来调节(图21)。用制造商建议的酶浓度(1x)、0.5x,或0.25x该建议的酶浓度,以kapahifi聚合酶扩增了来自该稀释系列的样品。此外,将这些数据集与以kapareadymix(预制2x主混合物(mastermix))扩增的样品比较。在所使用的酶浓度和接头二聚体形成之间有强相关性。以kapareadymix扩增的样品具有迄今为止最大程度的接头二聚体形成,而以0.25xkapahifi扩增的样品具有可忽略量的接头二聚体形成,甚至在非常低的模板浓度时(图17)。除了对最低模板浓度的样品具有非常少reads的kapareadymix样品之外,用降低浓度的kapahifi仅温和降低准确性,尤其是在较低的pcr循环数(图17)。降低kapahifi浓度以及由此的接头二聚体污染水平大大改善了样品平衡(图17)。过量的酶浓度可以例如通过引物异二聚体的回咬(chew-back)和延伸介导接头二聚体形成。因此,优化酶浓度可牵涉在靶/脱靶编辑(on-target/off-targetediting)(图18)、灵敏度,以及总体准确性之间的权衡。引物编辑的程度也作为酶浓度的函数变化(图21)。

由于未扩增导致的模板分子漏失代表了pcr偏倚的最严重形式,即其为与定量错估相对的定性错误,所以期望有可报告引物编辑功效的标准品分子。设计了一组标准品,其中来自大肠杆菌16srrna基因模板的v4_515f引物位点经该引物结合位点的最3’10bp中每个可能的单碱基错配修饰(图2)。这些标准品可用于评估编辑程度和与引物编辑相关的任何碱基偏好(参见下文引物编辑标准品97至128;seqidno:104至seqidno:135)。采用类似的设计考虑,制备了用于真核its2区的另外一组引物编辑标准品(下文合成标准品129至159,seqidno:136至seqidno:166)。另外,图3展示的数据提示,可在扩增引物中采用防止外切核酸酶的磷硫醇修饰来控制引物编辑程度。

具有引物错配的生物体,例如痤疮丙酸杆菌,仅在使用校对聚合酶时才被扩增并以可察觉的水平出现在测序数据中。因此,可报告引物编辑功效并标示引物错配导致的潜在分类漏失的合成标准品将在基于扩增子的微生物组测序中帮助鉴定定性错误。合成标准品分子可用于鉴定这样的分类漏失。当在测序前用标准taq聚合酶扩增hmp模拟群落时,引物编辑不发生,痤疮丙酸杆菌不会检测到。类似地,也观察到含有对应引物错配的痤疮丙酸杆菌标准品分子的漏失(图15)。这表明除了校正定量错误外,合成标准品可用于标示定性错误(分类漏失)。

无pcr定量条码

如上文提到的,在一些实施方案中,合成标准品可包括允许无pcr定量的条码。无pcr定量消除了pcr介导的扩增偏倚。合成一批20个16srrna基因v4合成标准品,将它们克隆进ptopo载体,转化进大肠杆菌(dh5α),并通过sanger测序验证各个克隆的序列。采用qiagenminiprep试剂盒从20个经序列验证的克隆的每个纯化质粒,并采用picogreen测定定量质粒dna。将来自20个克隆的质粒按等摩尔比例混样,使得每种质粒预期占标准混合样的的5%。接着,用mlyi切割质粒混合样以释放定量条码(图4;也参见图1)。然后采用100bp单端读取测序(single-read)illuminahiseq流动槽的一部分对经mlyi消化的质粒材料直接测序,生成592,728个reads。从得到的reads中修剪掉illumina接头,并采用自定义脚本将reads映射到含有已知条码序列的参照文件。采用这些计数,可测量标准品分子在标准混合样中的实际丰度,对于标准品这必须准确评估以提供定量校正。对于标准品分子,实际丰度大多接近但不恰好是5%,范围在3.4%至6.3%(图5)。

本文描述的该无pcr条码定量技术具有许多实际应用,并且可用于对可插入无pcr条码的工程化dna构建体的基本上任何混合物的可信赖测量。示例性应用例如包括定量质粒混合样;定量shrna、crisprsgrna质粒,或病毒载体(例如可用于大规模遗传筛查)的混合样;定量转座子或其他插入文库,例如tn-seq和相关方法。

为了证实该技术的示例性应用,构建了在转座子内含有随机条码的无pcr条码构建体的tn5转座子文库。克隆该tn5元件并连同tn5转座酶通过电穿孔转化进大肠杆菌以生成>13,000个插入菌株的文库(图30a)。转化前,通过mlyi消化、纯化和对无pcr条码构建体测序来核实tn5文库的条码组成是高度多样的(图30b)。为了使用转座子中的无pcr条码来定量tn-seq文库,通过片段化文库dna、接上接头、并且以转座子中的引物和接头中的引物扩增来富集tn5:基因组连接处,而将条码映射至转座子连接处(transposonjunctions)。一旦条码/基因组关联形成,该文库就可在无pcr时通过使用mlyi简单释放无pcr条码并对它们测序来定量。

对来自纯化的大肠杆菌基因组dna的转座子构建体中的无pcr定量条码盒(barcodecassette)进行测序是可能的。因为整合的转座子上的该条码盒仅占大肠杆菌基因组的小部分(大约1/40,000),所以不清楚对经消化材料的illumina测序在大量非功能性背景dna情况下是否可行。此外,由于对无pcr定量条码分子直接测序,没有居间扩增,所以在大多数情况下可回收的材料的量低于illumina测序仪上样的建议浓度。因此,为了对来自纯化的大肠杆菌基因组dna的转座子构建体中的无pcr定量条码盒进行测序,在以mlyi消化基因组dna后,对经消化样品中转座子的量进行定量。以超过2μg的基因组dna开始,通过qpcr定量评估,回收了112pm浓度的无pcr定量条码构建体,大概是illuminamiseq上样建议浓度的1/20。对这些文库测序需要经修饰的变性规程,其中以等量的hci中和用于在测序前变性dna的naoh,使得样品中过量的naoh不干扰成簇(clustering)和测序。获得了超过三百万个对应来自转座子的无pcr定量条码构建体,其代表了大概15,000个独特丰度条码,与我们基于菌落计数估计的转座子文库复杂度一致(图30b)。

在一些应用中,例如,想评估跨很多实验扰动(experimentalperturbation)的相同文库的应用,可能希望在单一测序槽中多重化这些测量。设计了构建体以试验:是否留下小的单链突出(singlestrandoverhangs)的酶可用于释放无pcr条码构建体,以使得多个标签可被置于单个多联体化的构建体(concatamerizedconstruct)中(图30c-e)。通过制备图30c中4个质粒的平均混合样并通过以mlyi切割以释放4个条码之一,试验了多重无pcr条码构建体的特异性。图30d显示通过mlyi成功释放了条码。

为了证实该技术的另一示例性应用,制备了大小标准品(sizestandards)以表征各种大小分子在不同测序平台上的成簇效率。这些标准品分子在相同质粒上含有两个无pcr定量条码构建体,保证每对以真正等摩尔比例存在。每个质粒含有164bp的mlyi可释放无pcr条码构建体和不同大小的第二mlyi可释放无pcr条码构建体,其范围从150bp至1500bp,以150bp为增量。不同大小的构建体与164bp归一化对照的比例可用于定量和比较每个标准品分子产生的reads数量,使得能直接测量测序平台特异的大小偏倚(下文的合成标准品233-262,seqidno:240至seqidno:269)。

在前文的说明和所附的权利要求书中,术语“和/或”指所列出元素的一个或全部或所列出元素的任意两个或更多个的组合;术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”及其变型应解释为开放型,即另外的元素或步骤为任选的并且可以存在或不存在;除非另有指出,“a”、“an”、“the”以及”atleastone”可互换使用,指一个或一个以上;通过端点对数值范围的叙述包括归纳在该范围内的所有数字(例如,1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5,等等)。

在前面的描述中,为了清楚起见,可以孤立地描述特定实施方案。除非另有明确指明特定实施方案的特征与另一实施方案的特征不相容,否则某些实施方案可包括本文结合一个或多个实施方案描述的相容特征的组合。

对于本文描述的包括分开步骤的任何方法,这些方法可以以任何可行的顺序进行。视情况,两个或多个步骤的任意组合可以同时进行。

通过以下实施例阐释本发明。应当理解,特定的实施例、物质、量,以及操作应根据本文描述的发明的范围和精神在广义上解释。

实施例

实施例1

样品和标准品

模拟群落dna从作为人类微生物组计划的一部分的beiresources,niaid,nih获得:基因组模拟群落b(hm-276d,均匀的,高浓度,v5.1h,和hm-277d,参差的,高浓度,v5.2h)。

使用sgi-dnabioxp3200合成16sv4合成标准品。通过与taq聚合酶和datp在72℃孵育10分钟将这些构建体3’腺苷酸化。接着,根据制造商的规程将合成的dna克隆进topo载体(invitrogen),转化进大肠杆菌(dh5α),并通过sanger测序验证各个克隆的序列。采用qiagenminiprep试剂盒从20个经序列验证的克隆的每个纯化质粒,采用picogreen测定定量质粒dna并按上文所述混样。

采用sgi-dnabioxp3200将全长16srrna标准品、过程控制标准品,以及引物编辑标准品合成为全长质粒(在pucga骨架中)。

di方法

采用两步骤pcr法扩增16srrna的v4区。采用abi7900在qpcr反应中完成初次扩增,以使得该pcr反应的动态可被监测。使用以下的配方:3μl模板dna,0.48μl无核酸酶水,1.2μl5xkapahifi缓冲液(kapabiosystems,woburn,ma),0.18μl10mmdntps(kapabiosystems,woburn,ma),0.3μldmso(fisherscientific,waltham,ma),0.12μlrox(25μm)(lifetechnologies,carlsbad,ca),0.003μl1000xsybrgreen,0.12μlkapahifi聚合酶(kapabiosystems,woburn,ma),0.3μl正向引物(10μm),0.3μl反向引物(10μm)。循环条件为:95℃5分钟,接着为20个循环的98℃20秒、55℃15秒、和72℃1分钟。用于初次扩增的引物含有两16s特异引物(v4515f和v4806r),以及用于在再次扩增中添加索引和illumina流动池接头的接头尾部。

使用以下的引物(16s特异序列为加黑)。

将来自初次pcr的扩增子在无菌、无核酸酶水中1∶100稀释,并进行第二pcr反应以添加illumina流动池接头和索引。采用以下配方完成再次扩增:5μl模板dna,1μl无核酸酶水,2μl5xkapahifi缓冲液(kapabiosystems,woburn,ma),0.3μl10mmdntps(kapabiosystems,woburn,ma),0.5μldmso(fisherscientific,waltham,ma),0.2μlkapahifi聚合酶(kapabiosystems,woburn,ma),0.5μl正向引物(10μm),0.5μl反向引物(10μm)。循环条件为:95℃5分钟,接着为10个循环的98℃20秒、55℃15秒、和72℃1分钟,然后是72℃10分钟的最后延伸。使用以下的索引引物(indexingprimers)(x表示8bp索引的位置):

正向索引引物:

反向索引引物:

稀释系列实验

对于稀释系列实验,将di方法引物(v4_515f_nextera和v4_806r_nextera,见上文)用于所有的比较。使用如下的两种不同聚合酶之一,将hm-276d模拟群落dna的10倍稀释系列扩增20、25、30,或35个循环:kapahifihotstart(kapabiosystems,woburn,ma),或5primehotmastermix(5prime,gaithersberg,md)。用于初次扩增的pcr配方和循环条件如下:

kapahifi初次pcr配方:2.5μldna模板,0.48μl无核酸酶水,2μl5xkapahifi缓冲液(kapabiosystems,woburn,ma),0.3μl10mmdntps(kapabiosystems,woburn,ma),0.5μldmso(fisherscientific,waltham,ma),0.2μlkapahifi聚合酶(kapabiosystems,woburn,ma),0.5μl正向引物(10μm),0.5μl反向引物(10μm)。

kapahifi循环条件:95℃5分钟,接着为20个、25个、30个或35个循环的98℃20秒、55℃15秒、和72℃1分钟,然后是72℃5分钟。

5primetaq循环条件:94℃3分钟,接着为20个、25个、30个或35个循环的94℃20秒、55℃15秒、和72℃1分钟,然后是72℃5分钟。

然后将初次pcrs在无菌、无核酸酶水中1∶100稀释,并进行第二pcr反应以添加illumina流动池接头和索引。对于这些反应,使用如下的配方(聚合酶特异的循环条件与上文相同,只是在索引步骤中使用10个循环):

kapahifi索引pcr配方:5μl1∶100dna模板,5μl模板dna,1μl无核酸酶水,2μl5xkapahifi缓冲液(kapabiosystems,woburn,ma),0.3μl10mmdntps(kapabiosystems,woburn,ma),0.5μldmso(fisherscientific,waltham,ma)0.1μlkapahifi聚合酶(kapabiosystems,woburn,ma),0.5μl正向引物(10μm),0.5μl反向引物(10μm)。

5primetaq索引pcr配方:5μl1:100dna模板,4μl2x5primehotstarthigh-fidelitymastermix,1μl无菌、无核酸酶水,干燥索引引物(每种引物终浓度0.5μm)。

kapahifi浓度试验

对于kapahifi浓度试验,采用以上在稀释系列实验部分描述的kapahifi初次pcr配方和循环条件进行,只是添加至0.5x反应物的kapahifi聚合酶的量减半(0.1μl每10μl反应物)、添加至0.25x反应物的量为1x浓度的1/4(0.05μl每10μl反应物);添加无核酸酶水以补偿缺失的体积。对于这些条件的每个,以0.5x浓度的kapahifi聚合酶进行索引反应,这样在这些条件之间观察到的差异为初次pcr反应中不同kapahifi聚合酶浓度的结果。

kapahifireadymix扩增

使用di引物(v4_515f_nextera和v4_806r_nextera,见上文)和如下配方,按上文描述进行kapahifireadymixpcr:

kapahifireadymixpcr配方:2.5μldna模板,5μl2xkapahifihotstartreadymix,0.5μl正向引物(10μm),0.5μl反向引物(10μm),1.5μl无菌、无核酸酶水。

kapahifireadymix索引pcr配方:5μl1∶100dna模板,5μl2xkapahifihotstartreadymix,干燥索引引物(每种引物终浓度0.5μm)。

扩增c.jejuniv4和v3-v5可变区

使用上文描述的v4515f和v4806r引物以及kapareadymix规程,或者使用kapahifi(1x)规程以用于v3-v5可变区的引物扩增来自纯化的c.jejuni分离株的dna(81-176)。用于初次扩增的v3-v5可变区的引物序列如下(16s特异序列为加黑):

测序文库的归一化和混样

对于测序前的样品归一化,对于不包括合成标准品分子的实验采用picogreendsdna测定(lifetechnologies,carlsbad,ca)定量pcr产物,将样品归一化、混样、并采用1.8xampurexp微珠(beckmancoulter,inc.,brea,ca)将大约1μg的材料浓缩至10μl。接着在caliperxtdna750chip(caliperlifescience,hopkinton,ma)上将混样的样品选择427bp+/-20%大小用于di混合样,或368bp+/-20%用于emp混合样。选择了大小的材料采用ampurexp微珠纯化,并在20μleb缓冲液(10mmtris-hcl,ph8.5)中洗脱。采用picogreendsdna测定定量最终的混样样品。

对于含有合成标准品的实验,采用sequalprep归一化板套件(sequalprepnormalizationplatekit,thermofisher)按制造商的说明在测序前归一化样品。

通过以mlyi(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma)处理标准品质粒混合样(按制造商的建议消化),准备含有无pcr定量条码的文库。采用ampurexp微珠纯化得到的消化物,使用picogreen测定定量。

测序

基于picogreen测量将混合样稀释至2nm,将10μl的该2nm混合样用10μl的0.2nnaoh变性,在illumina’sht1缓冲液中稀释至8pm,掺入15%phix,在96℃热变性2分钟,并采用miseq600cyclev3套件(illumina,sandiego,ca)测序。

分析

模拟群落样品二次抽样至每个样品10,000reads的深度。接着采用trimmomatic(bolger等,2014,bioinformaticsbtu170)修剪测序接头序列,并将pandaseq(masella等,2012,bmcbioinformatics13:31)用于去除引物序列(适用的话)和连接双端reads。采用自定义脚本将fastq文件转变为qiime(caporaso等,2010,nat.methods7:335-336)fastq格式。然后,将各个样品fastq文件串联为一个fasta文件,并采用chimeraslayer的usearch61方法(haas等,2011,genomeres.21:494-504)运行嵌合体检测和去除。将所得的reads映射至hmp模拟群落参照文件(salipante等,2014,appl.environ.microbiol.aem.02206-14-;doi:10.1128/aem.02206-14),用于计算丰度百分比、rmsd和mape值。通过使用自定义python脚本和biopython(cock等,2009,bioinformatics25:1422-1423)对与v4引物序列的错配分类来分析引物校正的分布。采用cutadapt(martin,m.,2011,embnet.journal17:10-12)修剪illumina接头,并采用pandaseq(masella等,2012,bmcbioinformatics13:31)合并成对的reads。为了滤除引物区中来自插入缺失(indels)的噪音,将每个引物序列最大三个错配的阈值用于该分析。通过在未修剪的二次抽样fastq文件中搜索与来自这些out的rep_set序列的准确匹配,分析与nhp和人类数据集中的差异化丰度的otu相关的引物序列。采用自定义python脚本进行无pcr定量条码和合成标准品实验的分析。

实施例2

引物编辑标准品

出于过程质量控制/质量保证的目的,设计了合成标准品,其允许更详细研究和监测引物编辑。这些标准品基于大肠杆菌的v4515f引物区,包括30个质粒,这些质粒含有大肠杆菌16srrna基因v4(可变区4)并在该引物序列的最后10bp中具有每个可能的单碱基错配,以及1个野生型质粒(图27a)。可为任何感兴趣的引物区设计类似的标准品,例如为its2开发的另外的标准品组。合成的引物编辑标准品被合成、克隆进pucga1.0克隆载体,并转化进neb5alpha大肠杆菌感受态细胞。为每个构建体挑取多个克隆,提取dna,并通过sanger测序法对构建体测序以核实合成的dna的序列是正确的。将以下的引物用于这些构建体的sanger核实。

采用quant-itpicogreendsdna定量测定法(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)定量来自31个标准品质粒的dna,并将质粒等质量混合。将质粒中的无pcr定量条码构建体用于核实每个构建体存在于混合样中以及确定构建体丰度的准确比例。以下的限制性消化用于释放无pcr定量条码:17μl引物编辑标准品混合样dna(10ng/μl),2μlcutsmart缓冲液(newenglandbiolabsinc.,ipswich,ma),1μlmlyi(newenglandbiolabsinc.,ipswich,ma)。该消化在37℃孵育1小时,接着向消化物添加30μl水(使体积增加至50μl),然后添加30μl磁性微珠(0.6xampurexp,beckmancoulter,inc.,brea,ca)并将添加的上清液转移至新管(弃去微珠)。采用磁性微珠(1.8xampurexpbeads,beckmancoulter,inc.,brea,ca)纯化限制性消化物(来自0.6x结合的上清液)并在25μl洗脱缓冲液中洗脱。

采用quant-itpicogreendsdna定量测定法(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)和bioanalyzerhs分析发(agilenttechnologies,santaclara,ca)对洗脱的dna定量。将混合样稀释至2nm并在miseq2×300bp槽的一部分(illumina,inc.,sandiego,ca)上按制造商的说明测序(8pm成簇浓度)。采用自定义python脚本确定质粒混合样的组成(条码计数和百分比)。

为了评估这些标准品报告引物编辑的能力和比较不同酶的编辑能力,采用8种不同聚合酶扩增引物编辑标准品混合样:kapahifi(kapabiosystems,woburn,ma),qiagentaq(qiagenusa,germantown,md),q5(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma),phusion(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma),vent(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma),pfudnapolymerase(promegacorp.,madison,wi),accuprimetaq(invitrogen,thermofisherscientific,carlsbad,ca),和taq(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma),其中聚合酶在4个不同浓度(0.25x、0.5x、1x,或2x制造商建议浓度),引物编辑标准品混合样在4个不同浓度(每种标准品250,000个模板分子、25,000个模板分子、2,500个模板分子,或250个模板分子)。将大肠杆菌特异引物(非简并v4515f/v4806r)用于这些扩增:

pcr配方和条件列在下文表1中(体积为微升,温度为摄氏度所有的扩增进行30个pcr循环)。

表1

随后1∶100稀释这些扩增子,并用10个循环的pcr(采用kapahifi0.5x浓度)和索引引物扩增,以添加样品特异索引和illumina流动池接头。索引引物具有如下序列([i5]和[i7]指由illumina使用的索引序列代码,p5和p7流动池接头为加黑):

正向索引引物:

反向索引引物:

采用归一化板(sequalprep,thermofisherscientific,waltham,ma)将加索引的样品归一化,混合等体积的每个样品,以及采用磁性微珠(1xampurexp,beckmancoulter,inc.,brea,ca)纯化和浓缩混合样,并在25μl的洗脱缓冲液中洗脱。采用quant-itpicogreendsdna定量测定法(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)和bioanalyzerhs分析发(agilenttechnologies,santaclara,ca)对洗脱的dna定量。将混合样稀释至2nm并在miseq2×300bp槽的一部分(illumina,inc.,sandiego,ca)上按制造商的说明测序(8pm成簇浓度)。采用自定义python脚本确定质粒混合样的组成(条码计数和百分比)。

用非校对聚合酶(例如,nebtaq、qiagentaq,或accuprimetaq)未观察到引物编辑。所试验的校对聚合酶都能够编辑扩增引物以匹配引物编辑标准品模板,尽管在制造商建议的酶浓度下,1x,不同酶之间发生编辑的程度是可变的(图24b)。通过校对聚合酶观察到的编辑几乎没有明显的序列特异性,可能的例外是在两个3’末端位置中的向g/c编辑的轻微偏倚(图24c)。所观察到的引物编辑的程度依赖于所用的酶浓度(图24d),尽管浓度依赖性的量级也在所研究的不同酶之间变动(数据未示出)。这些数据提供了酶浓度依赖的引物编辑的直接证据。在可可靠检测的浓度时,模板浓度对引物编辑几乎没有可分辨的影响。这些结果证实,引物编辑标准品可用于评估在不同反应条件下发生的引物编辑的量。

然后,采用kapahifi聚合酶(1x反应条件),以含有在引物编辑质粒混合样中编码的31个可能的序列的引物混合样扩增野生型大肠杆菌质粒标准品。突变的引物被编辑以匹配野生型模板序列,其程度和频率类似于用引物编辑标准品在之前的实验中看到的编辑。这证实,引物编辑标准品正确地报告了引物编辑的程度和频率。

为了确定在引物序列的特定位置引入磷硫醇键是否可限制引物编辑的程度,采用在位置15、16、17、18,或19含有单个磷硫醇键的e._coli_v4_515f衍生物连同e._coli_v4_806r引物以kapahifi聚合酶(1x反应条件)扩增引物编辑标准品混合样。如上文所述对这些扩增子加索引并测序。在特定位置引入磷硫醇键导致在磷硫醇键位置的5’任何引物编辑的切断(图25)。这些结果证实,引物编辑可采用磷硫醇修饰的引物调整。

实施例3

生物物理标准品

一组生物物理过程控制标准品设计为报告扩增偏倚,该扩增偏倚通过扩增条件和试剂与模板分子的生物物理性质(例如,gc含量、扩增子大小,和/或二级结构)之间相互作用而发生。这些对照设计为覆盖16srrna基因的v4区中天然遗传变异所涵盖的参数空间,该参数空间如通过greengenes数据库中所有可识别的v4区的gc含量和预测的二级结构所评估(desantis等,2006.applenvironmicrobiol72:5069-72)。(图26a)。接着,在计算机中改动大肠杆菌16rrna分子的序列,添加不同量的gc或at偏倚并生成数百万个变动序列的计算机文库。然后,为这些序列生成二级结构预测,过滤掉与greengenes数据库中的序列有>97%一致性的序列,并选择一组覆盖了天然gc含量范围和二级结构变动的分子(图26a)。也表征了v4区大小的天然出现的分布并制备了涵盖该大小分布的一组标准品,它们可用于检测大小选择或扩增偏倚导致的扩增子大小中的偏倚(图26b)。

如实施例2中为引物编辑标准品所描述的,合成生物物理过程控制标准品、克隆、转化并核实序列。如实施例2中为引物编辑标准品所描述的,将它们归一化、混样、并将无pcr定量条码用于确定准确混合样组成。

为了评估这些标准品报告扩增偏倚的能力和比较不同酶的偏倚,采用8种不同聚合酶扩增生物物理标准品混合样:kapahifi(kapabiosystems,woburn,ma)、qiagentaq(qiagenusa,germantown,md)、q5(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma)、phusion(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)、vent(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma)、pfudnapolymerase(promegacorp.,madison,wi)、accuprimetaq(invitrogen,thermofisherscientific,carlsbad,ca)、和taq(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma),其中聚合酶在4个不同浓度(0.25x、0.5x、1x,或2x制造商建议浓度),生物物理标准品混合样在4个不同浓度(每种标准品250,000个模板分子、25,000个模板分子、2,500个模板分子,或250个模板分子)。

将标准简并v4515f/v4806r用于这些扩增:

pcr配方和条件列在上文实施例2中的表1中。如上文所述对这些扩增子加索引并测序。采用cutadapt(martin,m.,2011.embnet.journal17(1):10-12)修剪序列数据的接头和引物序列,采用pandaseq(masella等,2012.bmcbioinformatics13:31)或pear(zhang等,2014.bioinformatics30(5):614-620)合并双端reads,并采用bowtie2(langmead等,2012.9(4):357-359)将reads映射至生物物理标准品参照文件。通过在read合并后采用自定义python脚本对不同大小的序列计数,对大小标准品进行分析。不同聚合酶产生的数据在gc含量和扩增子大小方面具有独特的模式。这些结果证实,生物物理标准品可用于报告由扩增反应中的扩增子生物物理性质引起的偏倚。

实施例4

全长16srrna基因合成掺入型标准品

在看到与仅靶向16srrna基因可变区v4的合成标准品不一致的结果后,设计了一组20个全长16srrna基因标准品,其中在可变区v3、v4、和v5中带有3个独立的3bp标签。

如上文实施例2中所描述,合成带标签的掺入型标准品、克隆、转化并核实序列。如上文实施例2中描述,将它们归一化、混样、并将无pcr定量条码用于确定准确混合样组成。

为了试验这些全长16srrna基因合成标准品校正扩增偏倚的能力,在存在或不存在带标签的合成掺入型标准品时扩增商业上可获得的模拟群落参照标准品。带标签的合成掺入型标准品混合样含有对应于该模拟微生物群落中8种菌株中的5种的质粒。采用上文描述的kapahifi1x,或qiagentaq1x反应条件以靶向细菌16srrna基因可变区v1-v3、v3-v4、v4、和v5-v6的引物扩增这些样品,引物组显示在表2中。

表2

如上文所述对这些扩增子加索引并测序。将自定义python脚本用于鉴定含有3bp序列标签(将read标记为与掺入型标准品对应)的reads,并将掺入型标准品和非掺入型标准品reads分至两个单独的fastq文件中。如上文实施例3中所描述,随后将这些reads修剪、合并、并映射至它们各自的参照文件。然后,将对应于带标签的合成掺入型标准品的reads的丰度值与它们的预期值(采用来自标准品混合样的无pcr条码计数确定)比较,以便为每个构建体确定所观察到的扩增偏倚程度。将每个构建体的观察丰度与预期丰度的比例用于计算校正因子,并针对每个样品(针对带标签的掺入型标准品所靶向的5个菌株)将该校正因子应用于模拟群落数据,同时归一化数据以保持所有生物体的总百分比为100%(图27a)。如在图27b-e中可看到的,当将计算的校正因子应用至数据时,对带标签的掺入型标准品靶向的菌株的测量(深色圆点)通常明显地更准确。此外,当应用校正因子时,也改善了对整个模拟群落(包括用于非靶向菌株的数据点,浅色圆点)测量的整体准确性(图27d-e)。

实施例5

采用上文实施例1中描述的由20个带标签的合成掺入型构建体构成的标准品混合样试验该无pcr条码定量技术的精确性和准确性,所述构建体靶向16srrna基因可变区v4并且每个含有独特的20bp无pcr定量条码构建体。

无pcr定量条码测量的精确性

如下用mlyi切割20个构建体的标准品混合样:

10μl质粒dna(来自混合样-50ng/μl)

2μlcutsmart缓冲液(newenglandbiolabsinc.,ipswich,ma)

7μl水

1μlmlyi限制酶(newenglandbiolabsinc.,ipswich,ma)

让反应在37℃孵育1小时。接着,添加14μl的固相可逆固定微珠(spri0.7x,beckmancoulter,inc.,brea,ca)。将上清液(35μl)转移至具有70μlspri微珠(2x)的管,用80%乙醇洗涤两次,晾干10分钟,然后在20μl洗脱缓冲液中洗脱。采用quant-itpicogreendsdna定量测定法(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)和bioanalyzerhs分析发(agilenttechnologies,santaclara,ca)对洗脱的dna定量。将混合样稀释至2nm并在miseq2×300bp槽的一部分(illumina,inc.,sandiego,ca)上按制造商的说明测序(8pm成簇浓度)。采用自定义python脚本确定条码计数(图28a)。

基于这种初步的测序数据,制备的这些标准品的另外两个混合样:再混合的均匀混合样(每个构建体靶向5%丰度)和参差混合样(对每个构建体有一系列被靶向丰度,跨度大约4个log)。如上所述加工该均匀的再混合样品并测序,产生的数据显示混合样中构建体平衡得到改善(图28b)。

为了试验该无pcr条码定量技术的精确性,同上进行了该再混合的均匀标准品混合样的三个独立消化、纯化和测序。这三个技术性重复产生了近乎相同的数据,说明这种无pcr条码定量技术为高度精确的(图28c)。

无pcr定量条码测量的准确性

接着,通过首先将这些测量值与采用pcr扩增条码盒获得的那些进行比较,然后将无pcr和pcr测量值与微滴式数字pcr(dropletdigitalpcr)测量值进行比较,来评估无pcr条码定量方法的准确性。

如上文所述进行最初的再混合均匀混合物和参差混合样的无pcr条码测量,除了对于参差混合物的情况:以mlyi消化197.2ng,而不是500ngdna。为了准备该pcr反应,将混合的dna稀释至1ng/μl,每50μlpcr反应向其中加入1ngdna(1μl在24μl水中稀释)。用以下的引物(靶向无pcr条码构建体),将1xqiagentaq条件用于扩增10个循环、20个循环、30个循环,或40个循环:

如下扩增混合物:

95℃-5分钟

x循环

94℃-30秒

60℃-30秒

72℃-30秒

72℃-10分钟

4℃-保持。

采用磁性微珠(0.8xampurexpbeads,beckmancoulter,inc.,brea,ca)纯化pcr反应物并在25μl洗脱缓冲液中洗脱经纯化的dna。采用quant-itpicogreendsdna定量测定法(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)和bioanalyzerhs分析发(agilenttechnologies,santaclara,ca)对洗脱的dna定量。将混合样稀释至2nm并在miseq2×300bp槽的一部分(illumina,inc.,sandiego,ca)上按制造商的说明测序(8pm成簇浓度)。采用自定义python脚本确定条码计数。

增加的pcr循环数量导致与针对均匀和参差质粒混合样的预期值以及无pcr条码定量方法测量的值的定量偏差增加(图29a-d)。

为了进一步核实该无pcr条码定量方法的准确性,我们将这些测量值与作为准确定量金标准的微滴式数字pcr(ddpcr)测量值比较。为了通过ddpcr在均匀和参差混合样中测量每个条码的相对量,设计了一批40个引物组,它们在质粒骨架和每个独特的20bp条码序列之间以正向方向和反向方向扩增。通过qpcr以全部40个可能的引物组扩增每个单独的质粒构建体,来确定这些引物组的特异性。采用qx200微滴式数字pcr系统(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca)按制造商的说明进行ddpcr反应。使用以下的反应配方:

5μl-模板(1ng/μl质粒混合样模板的1∶10,000稀释物。注:对于参差模板,为不同的测定准备不同的稀释物以确保所有的测量都在仪器的定量范围内)

0.44μl引物1

0.44μl引物2

5.12μl水

11μl染料(evagreen,biotium,fremont,ca)

线性化质粒的2μli-scei(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma)添加至反应主混合物(mastermix)。

将反应物分配成乳剂,然后采用以下的pcr条件循环(热盖温度(lidtemp)=105℃):

95℃-10分钟

40个循环的:

95℃30秒

55℃1分钟

72℃5分钟

12℃保持

采用quantasofti软件(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca)分析结果。在阳性和阴性微滴信号明显分开的情况下,绘制了分开这些微滴群的阈值,以便为每个测定产生分子计数。不分析没有显示阳性和阴性微滴信号明显分开的测定。对于任何重复以及对于每个构建体的正向和反向方向测定,将数据进行平均以产生对每个条码构建体的一次测量。

均匀质粒混合样的ddpcr测量与无pcr条码测量非常相关,但是与以10至40个pcr循环进行的条码构建体测量不太相关(图29e)。对参差质粒混合样获得了类似的结果。ddpcr测量与无pcr条码测量的强相关性证实该无pcr条码定量方法为高度准确的。

将本文提及的所有专利、专利申请和出版物以及电子可用材料(例如,包括例如genbank和refseq中的核苷酸序列提交,例如swissprot、pir、prf、pdb中氨基酸序列提交,以及genbank和refseq中来自注释编码区域的翻译)的完整公开通过引用以其全文并入。如果本申请的公开与通过引用并入本文的任何文献的公开之间存在任何不一致,则本申请的公开将适用。仅出于清楚理解的目的给出了前文的详细说明和实施例。不应从中理解不必要的限制。本发明不限于所示和所描述的精确细节,因为本领域技术人员显而易见的变化将被包括在由权利要求书所定义的发明内。

除非另有说明,在说明书和权利要求书中使用的表示组分数量、分子量等的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此,除非有相反说明,在说明书和权利要求书中列出的数值参数为近似值,它们可以随本发明所寻求获得的期望性能而变化。最起码,并且并非试图将等同原则的应用限于权利要求的范围,每一数值参数应至少按照所报告的有效数以及应用普通舍入法来理解。

尽管陈述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值,但是具体实施例中列出的数值为尽可能精确地报告。然而,所有数值固有地包含由其各自测量中发现的标准偏差所必然产生的范围。

除非另有说明,所有的标题都是为了方便阅读者,而不应用于限制该标题后文本的含义。

序列表自由文本

合成标准品序列-最初16srrna基因v4区试验(hmp模拟群落)

序列标签为加黑

illumina接头为小写字母

16srrna基因v4过程标准品序列

illumina接头为小写字母

合成标准序列-全长16srrna基因试验(hmp模拟群落)

序列标签为加黑

illumina接头为小写字母

16srrna基因v4引物编辑标准品序列

illumina接头为小写字母

its2引物编辑标准品序列illumina接头为小写字母

its2过程标准品序列

illumina接头为小写字母

合成标准品序列-全长16srrna基因试验(选择人肠道微生物)

illumina接头为小写字母

大小标准品序列

illumina接头为小写字母

序列表

<110>明尼苏达大学董事会

k·贝克曼

d·戈尔

<120>分析标准品及其使用方法

<130>110.04840201

<150>us62/332,879

<151>2016-05-06

<160>328

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>52

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<400>1

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<210>2

<211>54

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<400>2

gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagggactachvgggtwtctaat54

<210>3

<211>51

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(37)

<223>n为a,c,g,或t

<400>3

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<211>47

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<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(32)

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<210>5

<211>50

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<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<400>5

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<210>6

<211>52

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<400>6

gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagccgtcaattcmtttragt52

<210>7

<211>12

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<400>7

aatcagtctcgt12

<210>8

<211>521

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<400>8

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<210>9

<211>521

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<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

<400>9

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gtctcgtatctcgtatgccgtcttctgcttgttgtcgactc521

<210>10

<211>521

<212>dna

<213>人工

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<223>多核苷酸

<400>10

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ttaatcgtacaaatttcgaaaagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaatca480

gtctcgtatctcgtatgccgtcttctgcttgttgtcgactc521

<210>11

<211>521

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>多核苷酸

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