取代的羟基均二苯乙烯及其治疗应用的制作方法

本发明涉及取代的羟基均二苯乙烯及其治疗应用。
背景技术：
：炎性反应由细胞因子介导，细胞因子活性和表达又由激酶调节。激酶和细胞因子活性异常在慢性和急性炎性疾病中起关键作用。激酶和细胞因子活性异常也是引发自身免疫疾病和不同类型癌症的基础。激酶抑制剂是一类确定的抗癌药物(chen，jnatprod，2012，75(12)：2269-2269)和抗炎药物(wang等人，jimmunol，2013，191(3)：1164-1174)。例如，janus激酶2(jak2)和janus激酶3(jak3)是酪氨酸激酶，它们调节参与生长和增殖的各种靶基因的转录(reiter等人，cancerres，2005年，65(7)：2662-2667；takemoto等人，procnatlacadsciusa，1997，94(25)：13897-13902)。jak2和jak3还参与介导炎症中涉及的许多炎性细胞因子的信号传导(wang等人，jimmunol，2013，191(3)：1164-1174)。因此，jak2和jak3抑制剂可用于治疗癌症、自身免疫疾病和炎性疾病(fridman等人，jinvestdermatol，2011年，131(9)：1838-1844)。p38α(p38丝裂原活化蛋白激酶α)是一种map(丝裂原活化蛋白)激酶，其也介导炎症中涉及的许多炎性细胞因子的信号传导。因此，p38α的激酶活性的抑制剂是有用的抗炎剂(daniele等人，cellsignal，2015年，27(8)：1609-1629)。糖原合酶激酶3β(gsk3β)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，其调节增殖细胞诸如癌细胞中的p53功能(wo2006/006939)并且对其进行抑制可下调炎性细胞因子(li等人，cellphysiolbiochem，2013，32(6)：1720-1728)。淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)是一种参与t细胞活化和增殖的src酪氨酸激酶(hanke等人，inflammres，1995，44：357；bolen等人，annrevimmunol，1997，15：371)。对lck进行抑制已在治疗炎性疾病上取得成功(brisslert等人，biochembiophysacta，2014，1842(11)：2049-2059)。对ikk激酶酶复合物中的iκb激酶(ikk)β亚基进行抑制也与抗炎作用有关(novoselova等人，mediatorsinflamm，2014，2014：724838)。clk(cdc2样激酶)在基因剪接中起重要作用，并且是阿尔茨海默病的潜在治疗靶标(jain等人，currdrugtargets，2014，15(5)：539-550)。细胞因子在启动和调节免疫应答中起重要作用，因此对它们进行抑制是控制自身免疫和炎性疾病的公认方法(kopf等人，naturereviewsdrugdiscovery，2010年9月，9：703-718)。示例性细胞因子靶标包括白介素-1β(il-1β)(xu等人，clinexppharmacolphysiol，2015，42(10)：1075-1083)、白介素-2(il-2)(roediger等人，jallergyclinimmunol，2015，136(6)：1653-1663)、白介素-6(il-6)(scheller等人，biochembiophysicaacta(bba)-molecularcellresearch，2011年5月，1813(5)：878-888)、白介素-8(il-8)(aghazarian等人，urology，2015，86(1)：52-56)、干扰素γ(ifn-γ)(dibari，clinter，2015，166(3))、肿瘤坏死因子α(tnf-α)(roubille等人，annrheumdis，2015，74(3)：480-489)和巨噬细胞炎性蛋白1α(mip-1α)(dapunt，mediatorsinflamm，2014，2014：728619)。已知对pde4进行抑制可改善对许多炎性、呼吸和过敏性疾病和病症的治疗(us6649633b2；keren等人，jdermatolsci，2015年1月，77(1)：74-76)。本领域需要用于治疗癌症、自身免疫疾病和炎性疾病的新型改进化合物和组合物。附图说明附图说明了本发明的非限制性示例实施方案。图1描述了根据本发明的实施方案的化合物的构成。图2示出了根据本发明的实施方案的化合物的结构。图3示出了用于制备根据本发明的实施方案的化合物的合成过程。图4示出了根据本发明的实施方案的化合物在小鼠中的葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的炎性肠病(ibd)/结肠炎模型中的功效。技术方案在整个以下描述中，阐述了具体细节以便更透彻地理解本发明。然而，可在没有这些细节的情况下实践本发明。在其他情况下，没有详细示出或描述公知的要素以避免不必要地模糊本发明。因此，应将说明书和附图视为说明性的而非限制性的。本文所用的术语“自身免疫疾病”是指哺乳动物中通常以免疫系统对不适当靶标诸如正常组织起反应为特征的生理状况。术语“自身免疫疾病”包括艾迪生病、强直性脊柱炎、乳糜泻、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、全身性红斑狼疮、1型糖尿病、ibd、银屑病、白癜风、斑秃和血管炎。如本文所用的术语“癌症”是指哺乳动物中通常以细胞生长不受调节为特征的生理状况。术语“癌症”包括任何起源的癌症，包括良性和恶性癌症、转移性和非转移性癌症以及原发性和继发性癌症。术语“癌症”包括对癌细胞的提及。癌症的示例包括但不限于膀胱癌、骨癌、脑/中枢神经系统癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、十二指肠癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、心癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌以及艾滋病相关的癌症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、白血病(包括淋巴细胞白血病、毛细胞白血病和急性骨髓白血病)、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤。如本文所用的术语“有效量”是指足以引发希望的生物反应或等效地抑制不希望的生物反应的活性剂量。有效的特定活性剂的量可根据以下因素而变化：诸如希望的生物反应、疾病的严重程度、待递送活性剂的活性、施用的途径、所用活性剂的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定活性剂组合使用的其他药物、化合物或材料、受试者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和受试者的既往病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。一般来讲，“有效量”是作为有效产生希望的生物反应的最低剂量的活性剂的量。这种“有效量”通常取决于上述因素。一般来讲，“有效量”的范围为每天每千克体重约1至约400mg，更优选每天每千克约10至约50mg。如果需要，可将“有效量”中的日剂量作为一个剂量施用，或者作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量在一天中以适当的间隔单独施用，任选地以单位剂型施用。如本文所用的术语“炎性疾病”是指哺乳动物中通常以免疫系统对无害靶标起过度反应或对不适当靶标起反应为特征的生理状况。术语“炎性疾病”包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自身免疫疾病、湿疹、炎性肠病、间质性膀胱炎、肠易激综合征、骨关节炎、帕金森病、牙周病、银屑病和晒伤。如本文所用的术语“包装说明书”是指通常包含在药物的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装产品组合的其他药物和/或有关使用此类药物的警告等的信息。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指适合与以所用剂量和浓度暴露于其中的受试者一起使用而不会产生与合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(诸如，毒性、刺激和过敏反应)的一种或多种赋形剂、稳定剂、填充剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、乳化剂、防腐剂、增溶剂、悬浮剂等。药学上可接受的载体的示例包括水、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、琼脂、碳酸钙、海藻酸、碳酸钠、石蜡、季铵化合物、鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、高岭土和膨润土、滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油、四氢呋喃醇、脂肪酸酯、硫代羟基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝和黄蓍胶及其混合物，以及本领域技术人员熟知的其他成分。如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指活性剂的毒理学相容的有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐“甲磺酸盐”、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。如果活性剂是碱，则可通过本领域可用的任何合适的方法制备所需的药学上可接受的盐，例如用无机酸或有机酸处理游离碱，所述无机酸为诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，所述有机酸为诸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(诸如，葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羟基酸(诸如，柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(诸如，天冬氨酸或谷氨酸)、芳香酸(诸如，苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(诸如，对甲苯磺酸或乙磺酸)等。如果活性剂是酸，则可通过任何合适的方法制备所需的药学上可接受的盐，例如用无机或有机碱处理游离酸，所述无机或有机碱为诸如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等。合适的盐的说明性示例包括但不限于衍生自氨基酸(诸如，甘氨酸和精氨酸)、氨、伯胺、仲胺、叔胺和环胺(诸如，哌啶、吗啉和哌嗪)的有机盐，以及衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。如本文所用的术语“增殖性疾病”是指哺乳动物中以细胞过度增殖和细胞基质更新为特征的生理状况。术语“增殖性疾病”包括癌症、移植物抗宿主病、再狭窄、错构瘤综合征(例如，结节性硬化症或cowden综合征)、脑脊髓炎、关节炎、硬皮病、肺纤维化、肾纤维化、囊性纤维化、肺动脉高压、肥厚性心肌病、帕金森-怀特式综合征以及湿性和干性黄斑变性。如本文所用的术语“受试者”是指活性剂将被递送到其中例如用于治疗目的的个体。术语“受试者”包括哺乳动物，特别是人和其他哺乳动物，包括伴侣动物诸如猫和狗，家畜动物诸如牛、猪、马、绵羊和山羊，动物园动物以及研究动物诸如啮齿动物。“受试者”还包括体外培养的细胞。如本文所用的术语“治疗”是指获得希望的临床结果的方法。希望的临床结果可包括但不限于减少或减轻疾病的至少一种症状。例如，治疗可以是减少疾病的至少一种症状、减轻疾病程度、稳定疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、缓和疾病、减少疾病复发、缓解疾病、延长疾病个体的存活率或完全根除疾病。缩写词：akt1：rac-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶clk4：cdc2-样激酶4dcm：二氯甲烷dmf：二甲基甲酰胺dppe：二苯基磷基乙烷g-csf：粒细胞集落刺激因子gm-cse：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子gsk3β：糖原合成酶激酶3βibd：炎性肠病ifn-γ：干扰素γikkβ：核因子κ-b激酶亚基β抑制剂il-1β：白介素-1βil-2：白介素-2il-8：白介素-8jak2：janus激酶2jak3：janus激酶3lck：淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶map：丝裂原活化蛋白mip-1α：巨噬细胞炎性蛋白1αpbmc：外周血单核细胞p38α：p38丝裂原活化蛋白激酶αp38β：p38丝裂原活化蛋白激酶βpde4：磷酸二酯酶4pde4b1：磷酸二酯酶4b1pha：植物血凝素pma：佛波醇12-肉豆蔻酯-13-乙酯syk：脾酪氨酸激酶thf：四氢呋喃tnf-α：肿瘤坏死因子α各方面涉及具有式i的化合物：其中：r1选自h、卤素和cn；r2选自h、卤素和cn；r3选自h、卤素和cn；r4是h；r5选自h、卤素和cn；并且r6是烷基或环烷基，或者其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该化合物可以是图1中列出的示例性化合物1至27中的一种。图2示出了示例性化合物1、2、7、10、12、18、20、24和27的结构。在一些实施方案中，该化合物可具有式i，其中r1选自h、f和cn；r2是h或cn；r3选自h、f和cn；r4是h；r5是h或f；并且r6选自异丙基、环丙基、环戊基、环己基和环庚基。在一些实施方案中，该化合物可具有式i，其中r1是h；r2是h或cn；r3选自h、f和cn；r4是h；r5是h；并且r6选自异丙基、环丙基、环戊基、环己基和环庚基。在一些实施方案中，该化合物可具有式i，其中r1是h；r2是h；r3是f；r4是h；r5是h；并且r6选自异丙基、环丙基和环戊基。在一些实施方案中，该化合物可以是3-羟基-4-异丙基-4′-氟-(e)-均二苯乙烯。在一些实施方案中，具有式i的化合物可作为药学上可接受的盐提供。各方面涉及包含具有式i的化合物以及药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，包含式i的化合物的组合物可以单位剂型提供。可与药学上可接受的载体组合以产生单一剂型的式i的化合物的量通常是产生治疗效果的量。在一些实施方案中，在百分之百中，该量的范围为活性剂的约0.1％至约99％、活性剂的约5％至约70％或者活性剂的约10％至约30％。各方面涉及通过向受试者施用有效量的具有式i的化合物来治疗病症的方法。虽然可以单独施用式i的化合物，但是可能优选的是将它们与一种或多种药学上可接受的载体组合作为组合物施用。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者单独或与至少一种另外的治疗剂组合施用至少一种具有式i的化合物。如下所示，具有式i的化合物抑制细胞增殖、抑制pde4、抑制一系列激酶并抑制一系列细胞因子。因此，可用具有式i的化合物治疗多种疾病。可治疗的合适疾病包括癌症、自身免疫疾病和炎性疾病。待治疗的受试者可以是被诊断为具有指定病症之一的任何受试者。由于要对病症进行诊断或者由于要对发展病症的风险进行评估，待治疗的受试者可能需要针对指定病症之一进行治疗。可使用众所周知的诊断或临床测试来诊断受试者的病症。可使用不同的诊断或临床测试来诊断不同的疾病。诊断工具包括但不限于体格检查、患病史和家族史、筛查测试、实验室测试、成像工具、体格测试、认知测试等。在一些实施方案中，式i的化合物单独或在组合物中的施用途径就效果而言可以是局部或全身(肠内或肠胃外)，并且就位置而言可以是例如颊、表皮、硬膜外、动脉内、心脏内、海绵窦内、大脑内、脑室内、真皮内、肌肉内、骨内、腹膜内、鞘内、子宫内、阴道内、静脉内、膀胱内、玻璃体内、鼻腔、口腔、直肠、皮下、舌下、唇下、经皮、经粘膜等。在一些实施方案中，口服施用可以是胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂、糊剂、粉剂、颗粒剂的形式，或者可作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳液，或作为酏剂或糖浆，或作为糖果锭剂或作为漱口剂等。在一些实施方案中，用于口服施用的固体剂型的组合物包括胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂等。固体剂型可用包衣和外壳(诸如，肠溶衣和其他包衣)刻痕或制备。它们也可被配制成提供式i的化合物的缓释或控释。在一些实施方案中，用于口服施用的液体剂型的组合物包括乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。在一些实施方案中，局部或经皮施用可以是粉剂、喷雾、膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、控释片和吸入剂的形式。在一些实施方案中，肠胃外施用(例如，静脉内施用)可以是生理学上相容的缓冲液中的溶液形式。无论选择何种施用途径，在一些实施方案中，都可通过常规方法将式i的化合物配制成药学上可接受的剂型。各方面涉及一种包含式i的化合物和包装说明书的试剂盒，所述包装说明书包含使用式i的化合物来治疗受试者病症的说明书。可治疗的合适病症包括癌症、自身免疫疾病和炎性疾病。具体实施方式通过参考以下实施例可进一步理解本发明，这些实施例是以说明方式提供，并不意味着限制。实施例1图3说明了用于制备根据本发明的实施方案的式i的化合物的合成方法。如下由可商购的起始物质3-甲氧基苄醇在六个步骤中合成该化合物。步骤1：在室温下用一摩尔当量的n-溴代琥珀酰亚胺的四氢呋喃(thf)溶液溴化3-甲氧基苄醇，得到4-溴-3-甲氧基苄醇。步骤2：在室温下用过量的亚硫酰氯的二甲基甲酰胺(dmf)溶液将4-溴-3-甲氧基苄醇转化为对应的苄基氯。步骤3：在150℃下加热16小时后，用过量的亚磷酸三乙酯将步骤2的苄基氯转化为4-溴-3-甲氧基苄基膦酸二乙酯。步骤4：将步骤3的4-溴-3-甲氧基苄基膦酸二乙酯与过量的氢化钠和取代的苯甲醛的thf溶液反应，得到取代的反式-4-溴-3-甲氧基均二苯乙烯(horner-wadsworth-emmons反应)。步骤5：在存在催化量的nicl2dppe(二苯基磷基乙烷)的二乙醚溶液时，在室温下将步骤4的取代的反式-4-溴-3-甲氧基均二苯乙烯与烷基格氏试剂反应，得到对应的取代的反式-4-烷基-3-甲氧基均二苯乙烯(镍(ii)-催化的kumada交叉偶联反应)。步骤6：在室温下将步骤5的取代的反式-4-烷基-3-甲氧基均二苯乙烯与过量的三溴化硼的二氯甲烷(dcm)溶液反应，得到取代的反式-4-烷基-3-羟基均二苯乙烯。实施例2下面给出了根据本发明的一个实施方案的3-羟基-4-异丙基-4′-氟-(e)-均二苯乙烯(化合物2)的合成工序。可使用该过程来制备本发明的所有化合物。4-溴-3-甲氧基苄醇向3-甲氧基苄醇(20.0g，145mmol)的thf(400ml)溶液中加入n-溴代琥珀酰亚胺(26g，146mmol)，将所得的混合物在室温下搅拌8小时。加入乙醚(500ml)并将混合物用水(3×100ml)洗涤。将溶液用硫酸镁干燥并浓缩，得到标题化合物(31.2g，99％)，将其原样用于下一步骤。4-溴-3-甲氧基苄基膦酸二乙酯在0℃下，在20分钟内向4-溴-3-甲氧基苄醇(31.0g，143mmol)的dmf(200ml)溶液中逐滴加入亚硫酰氯(17.5ml，241mmol)。将所得的混合物温热至室温并继续搅拌24小时。用水淬灭反应并用乙醚萃取。将合并的有机萃取物用水洗涤并用硫酸镁干燥，然后真空浓缩。将残余物溶于亚磷酸三乙酯(200ml)中，并将溶液加热至150℃，保持4小时。真空除去过量的亚磷酸三乙酯，得到粗产物，将其通过真空蒸馏纯化，得到标题化合物，为无色油状物，静置后固化(34.7g，72％)。4-溴-5-甲氧基-4′-氟-(e)-均二苯乙烯在室温下，在30分钟内向搅拌的(4-溴-3-甲氧基苄基)膦酸二乙酯(13.50g，40.0mmol)和4-氟苯甲醛(5.68g，40.0mmol)的thf(125ml)溶液中逐滴加入氢氧化钠(50％，8.0ml)的水性溶液。将所得的溶液搅拌过夜。将反应混合物用水(200ml)处理并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥并真空浓缩，得到粗产物，将其通过从己烷中重结晶纯化，得到标题化合物，为白色结晶固体(9.8g，80％)。3-甲氧基-4-异丙基-4′-氟-(e)-均二苯乙烯向4-溴-5-甲氧基-4′-氟-(e)-均二苯乙烯(1.5g，4.9mmol)的乙醚(30ml)溶液中加入[1，2-双(二苯基膦基)乙烷]二氯镍(ii)(52mg，0.098mmol)。然后在5分钟内逐滴加入异丙基氯化镁的thf(2.0m，2.7ml，5.4mmol)溶液，并将所得的溶液搅拌24小时。将反应混合物用水(5ml)淬灭，用另外的乙醚(60ml)稀释，并将所得的混合物先用硫代硫酸钠的饱和水性溶液洗涤，然后用水洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥并真空浓缩，得到粗产物，将其通过从己烷中重结晶纯化，得到标题化合物，为浅黄色结晶固体(874mg，66％)。3-羟基-4-异丙基-4′-氟-(e)-均二苯乙烯向3-甲氧基-4-异丙基-4′-氟-(e)-均二苯乙烯(500mg，1.85mmol)的dcm(45ml)溶液中加入三溴化硼(1.4ml，15mmol)，并将所得的混合物搅拌2小时。通过缓慢加入水淬灭反应，并用dcm萃取。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥并真空浓缩，得到粗产物，将其通过从己烷中重结晶纯化，得到标题化合物，为白色结晶固体(327mg，69％)。实施例3-对细胞活力的影响在含有10％fbs的rpmi-1640(jurkat和thp-1)或含有10％fbs的dmem(a549和mda-mb-435)中培养细胞。第1天，将100μl含有0.5％fbs的细胞培养基中以每个孔1-5×104个细胞接种到96孔平底板中。第2天，将测试化合物以不同浓度一式三份加入培养物中。对照包括不含化合物处理和不含细胞的细胞培养基各一式三份。将细胞在37℃下以5％co2温育48小时。第4天，将mts试剂加入每个孔中并在37℃下温育4小时。在490nm处读取吸光度。使用以下公式计算抑制百分比：[1-(实验读数-背景读数)/(阴性对照读数-背景读数)]×100。所确定的细胞活力ic50值在表1中列出。表1.化合物对mb435、jurkat、thp1和a549细胞的细胞活力ic50值。实施例4-对细胞增殖的影响在含有10％fbs的rpmi-1640(jurkat)或含有10％fbs的dmem(mda-mb-435)中培养细胞。第1天，将1×104个细胞接种到具有0.5％fbs的96孔白色isoplatetm的一个孔中。将细胞在37℃下以5％co2培养过夜。第2天，将稀释的测试化合物以100μl细胞培养基的总体积加入每个孔中。对于每个细胞系，将含有细胞且仅含有稀释的dmso的三个孔设置为阴性(载体)对照，将不含细胞但含有相同体积和类型的细胞培养基的三个孔设置为背景对照。将细胞在37℃下以5％co2温育24小时。第3天，将1μl[3h]-胸苷加入每个孔中并在37℃下以5％co2继续温育另外24小时。第4天，将30μl50％tca加入每个孔中并在4℃下温育4小时。将板用ddh2o洗涤四次，然后风干30分钟，之后将100μl闪烁液加入每个孔中。使用microbetatriluxtm读取放射性。使用以下公式计算抑制百分比：[1-(实验读数-背景读数)/(阴性对照读数-背景读数)]×100。所确定的抗增殖性ic50值在表2中示出。表2.化合物对mb435和jurkat细胞的抗增殖性ic50值。实施例5-对蛋白激酶活性的影响在5μmatp下针对化合物使用不同重组激酶靶标进行激酶谱分析。所测试的激酶包括akt1(rac-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1)、jak2、jak3、p38α、p38β(p38丝裂原活化蛋白激酶β)、gsk3β、syk(脾酪氨酸激酶)、lck、ikkα和ikkβ以及clk4。测试化合物以5μm和50μm一式三份进行测试。结果在表3中示出。表3.化合物对所测试的激酶活性的影响。其中“-”表示抑制小于20％，“+”表示抑制为20-30％，“++”表示抑制为31-50％，“+++”表示抑制大于50％。实施例6-对磷酸二酯酶4(pde4)活性的影响使用在杆状病毒系统中表达的重组人pde4b1酶进行测定。放射计量测定法是thompson和appleman的两步法(biochemistry10，1971年，第311-316页)的改进。反应在1μmcamp下进行。测试制品各自以0.2μm和20μm一式三份进行测试。还测定了参考抑制剂咯利普兰的抑制百分比值，并将其与历史测定值进行比较，以确保其处于可接受的范围内。结果在表4中示出。表4.对pde4b1酶的抑制活性。化合物0.2μm20μm2++++12++++20++++27++++咯利普兰++++++其中“-”表示抑制小于15％，“+”表示抑制为15-30％，“++”表示抑制为31-50％，并且“+++”表示抑制大于50％。实施例7-对人细胞因子产生的影响使用可商购的pbmc细胞来测试化合物对产生多种细胞因子的影响。将约1亿个人pbmc(1×108)在37℃水浴中解冻，并通过在co2温育箱中在37℃下在含有10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640中培养3小时进行回收。在化合物处理后30分钟，用pma和pha的组合诱导细胞因子产生。用不同浓度的化合物在37℃下处理细胞24小时。为了确定pbmc细胞分泌到培养基中的细胞因子产生，从药物处理或对照样品中收集培养物上清液。使用商业elisa试剂盒(qiagentmelisaarray试剂盒)进行定量。所测试的细胞因子包括：il-1α、il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-12、il-13、il-17a、ifn-γ、tnf-α、g-csf(粒细胞集落刺激因子)、gm-csf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、tgf-β1和mip1α。化合物对那些被证实由佛波醇12-肉豆蔻酯-13-乙酯(pma)和多羟基脂肪酸(pha)一致刺激的细胞因子的影响在表5中示出。表5.对人pbmc细胞中pma和pha诱导的细胞因子产生的抑制。其中“-”表示无抑制，“+”表示10μm下抑制＞50％，“++”表示1μm下抑制＞50％实施例8-对小鼠炎性肠病(ibd)/结肠炎的影响在雌性balb/c小鼠中的葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的炎性肠病(ibd)/结肠炎模型中测试化合物2的功效。在该实验中使用咯利普兰作为阳性对照。从第0天到第8天，通过提供含有dss(3.5％，分子量为30,000-50,000)的饮用水在小鼠中诱导结肠炎。从第0天开始到第8天，将测试化合物以特定剂量水平按照它们各自的组施用。化合物2以10mg/kg和30mg/kg进行测试，并且咯利普兰以5mg/kg进行测试。在大多数小鼠中都一致地诱导了结肠炎，其中从第2天开始发病(粪便稠度)，并且在第5-7天出现体重显著降低、腹泻和严重的直肠出血，这表明疾病的严重性。对于给药，将化合物2以3mg/ml和1mg/ml溶解在载体(1.5％cremophorel)中，分别用于30mg/kg和10mg/kg剂量。将咯利普兰以0.5mg/ml溶解在1％dmso/99％pbs中，用于5mg/kg剂量。所有剂量都通过口服强饲法施用。与正常对照组(1.9+2.4)相比，dss对照组(24.2+5.7)的疾病活动指数(dai)(体重、粪便稠度和直肠出血的累积评分)增长显著，表明疾病诱导效果非常好。在治疗组中，与dss对照组(24.2+5.7)相比，10mg/kg(17.4+12.0)和30mg/kg(15.4+4.9)的化合物2表现出非常好的dai降低。与dss对照组(24.2+5.7)相比，5mg/kg剂量(13.8+8.1)的阳性对照咯利普兰显示出对dai的非常好的抑制效果。结果在图4中示出。实施例9-对炎性皮肤病症银屑病和湿疹的功效如下制备含有化合物2的局部乳膏：将化合物2以11.0％w/w的浓度溶解在丙二醇中，然后将该溶液与适量的glaxal基础乳膏混合，得到1.0％w/w的化合物2的乳膏。为了测试该乳膏对炎性皮肤病症银屑病和湿疹的功效，10名患有银屑病的受试者和5名患有湿疹的受试者每天用该乳膏治疗两次，持续2-12周。在10名患有银屑病的受试者中，其中有8名在治疗8周后表现出皮肤厚度(硬结)、红斑和鳞屑显著减少。在治疗12周后，大部分受试者的病灶被清除。所有5名患有湿疹的受试者早在治疗2周后就开始对治疗有反应，表现为皮肤炎症和瘙痒显著减轻。如本领域技术人员将理解的，本文描述的方法和用途仅是可应用本发明来产生治疗益处的许多病症的示例。观察到的特定药理学反应可根据并取决于所选择的具体活性剂和/或药学上可接受的载体，以及所用的制剂类型和施用方式而变化，并且可以根据本发明的实践设想结果的这类预期变化或差异。当前第1页12