具有增强的激动活性的Fc工程化抗TNFR超家族成员抗体及其使用方法与流程

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背景技术：
：刺激抗肿瘤免疫作用的单克隆抗体正在成为一类重要的癌症治疗剂。它们中的许多是针对免疫刺激性肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员。最近的研究表明，抗tnfr超家族成员抗体的激动和治疗活性依赖于通过fc与fcγ受体(fcγr)的交联(li等人(2011)science333:1030-4；white等人(2013)cancerimmunolimmunother62:941-8)。fcγ受体，特别是fcγriib，作为支架促进抗体多聚化，抗体多聚化会促进受体聚集，这是激活下游细胞内信号传导的先决条件(bruhns等人(2009)blood113:3716-25)。进一步优化抗tnfr超家族成员抗体的抗肿瘤活性的方法是工程化抗体的fc区以改善其fcγriib接合。已报道取代s267e/l328f和e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330r选择性地增强fcγriib接合(chu等人(2008)molimmunol45:3926-33；mimoto等人(2013)proteinengdessel26:589-98)。虽然优化fcγriib接合是可行的方法，但是此类工程化抗体的激动活性取决于局部肿瘤微环境中表达fcγr的细胞的密度，因此此类抗体的功效可能有些限制。因此，需要另外优化的抗tnfr超家族成员抗体。技术实现要素：本发明提供一种分离的抗肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员抗体，其中所述抗体包含e345r突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无所述突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。本发明还提供一种包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供增强受试者中抗tnfr超家族成员抗体的激动活性的方法，包括将e345r突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y突变引入所述抗体中以产生特异性结合tnfr超家族成员的工程化抗体，并将所述工程化抗体施用给所述受试者。本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用包含e345r突变、e430g突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y的抗tnfr超家族成员抗体持续足以治疗所述癌症的时间。本发明还提供一种分离的用于治疗癌症的抗肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员抗体，所述抗体包含e345r突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无所述突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。本发明还提供分离的抗肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员抗体的用途，所述抗体包含e345r突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y突变，残基根据eu索引进行编号，所述抗体用于制造用于治疗癌症的药物。附图说明图1a示出抗ox40抗体的激动活性是交联依赖性的。在hek-bluetmnfκb报告基因测定中，ox40sf2igg1仅在存在交联蛋白g珠的情况下诱导信号传导。在不存在或存在蛋白g珠的情况下，将渐增浓度(1ng/ml至1000ng/ml)的ox40配体或ox40sf2igg1与稳定表达ox40的hek-bluetm细胞和在nfκb-诱导型启动子的控制下分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)报告基因一起温育。将反映seap报告基因表达的650nm处的od相对于测试试剂的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝4。图1b示出与raji细胞的共培养不能显著增强利用天然人igg1fc的sf2抗体的激动活性。将递增浓度(10至1000ng/ml)的ox40sf2igg1抗体与hek-blue：ox40细胞在有或没有与raji细胞共培养的情况下一起温育，并且通过hek-bluenf-κb报告基因测定评估它们的激动活性。将抗ox40抗体的激动活性(标准化为相对于由1μg/mlox40配体驱动的活性的活性百分比)相对于测试抗体的浓度作图(数据表示为平均值±sem，n＝14)。图2a示出与野生型igg1(ox40sf2igg1)相比，ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12与fcγriib的结合增强。将表达fcγriib的expi293f细胞与递增浓度(1ng/ml至10000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12一起温育，并使用流式细胞术评估抗体的结合。将平均荧光信号对测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝2图2b示出与野生型igg1(ox40sf2igg1)相比，ox40sf2igg1s267e/l328f与fcγriia的结合增强，而ox40sf2igg1v12具有相当的结合。将表达fcγriia的expi293f细胞与递增浓度(1ng/ml至10000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12一起温育，并使用流式细胞术评估抗体的结合。将平均荧光信号对测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝2图2c示出与野生型igg1(ox40sf2igg1)相比，ox40sf2igg1v12与fcγri的结合增强，而ox40sf2igg1s267e/l328f具有相当的结合。将表达fcγri的expi293f细胞与递增浓度(1ng/ml至10000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12一起温育，并使用流式细胞术评估抗体的结合。将平均荧光信号对测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝2图2d示出ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12已消除与fcγriiia的结合。将表达fcγriiia的expi293f细胞与递增浓度(1ng/ml至10000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12一起温育，并使用流式细胞术评估抗体的结合。将平均荧光信号对测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝2图3a示出与野生型igg1(ox40sf2igg1)相比，ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12与表达fcγriib受体的raji细胞的结合增强。通过流式细胞术测定评估递增浓度(3ng/ml至10000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12与raji细胞的结合。将平均荧光信号对测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝3。图3b示出ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12与raji细胞的结合是fcγriib依赖性的。用5μg/ml抗fcγriib抗体2b6预处理raji细胞，并通过流式细胞术评估1μg/ml抗体与raji细胞的结合。如所示，在用2b6抗体预阻断或无预阻断的情况下结合的平均荧光信号在条形图中表示为平均值±sem，n＝3。图3c示出ox40sf2igg1s267e/l328f的激动活性依赖于fcγriib对raji细胞的抗体交联。将递增浓度(10ng/ml至1000ng/ml)的ox40sf2igg1s267e/l328f与稳定表达ox40的hek-bluetm细胞在有或没有raji细胞共培养的情况下一起温育，raji细胞在一些测定中在开始共培养之前与5μg/ml抗fcγriib抗体2b6抗体预温育。y轴示出抗ox40抗体的激动活性，其标准化为由1μg/mlox40配体介导的活性百分比。数据表示为平均值±sem，n≥6.图3d示出ox40sf2igg1v12的激动活性依赖于fcγriib对raji细胞的抗体交联。将递增浓度(10ng/ml至1000ng/ml)的ox40sf2igg1v12与稳定表达ox40的hek-bluetm细胞在有或没有raji细胞共培养的情况下一起温育，raji细胞在一些测定中在开始共培养之前与5μg/ml抗-fcγriib(2b6)抗体预温育。y轴示出抗ox40抗体的激动活性，其标准化为由1μg/mlox40配体介导的活性百分比。数据表示为平均值±sem，n≥6.图4a示出ox40sf2igg1v12和ox40sf2igg1s267e/l328f已消除adcc。将递增浓度(10ng/ml至1000ng/ml)的ox40sf2igg1s267e/l328f、ox40sf2igg1v12和ox40sf2igg1与稳定表达ox40的hek-bluetm细胞一起温育，该细胞与效应细胞共培养，并进行adcc报告基因生物测定。将adcc活性的倍数激活(相对于没有添加抗体的对照样品)相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n≥6.图4b示出ox40sf2igg1v12和ox40sf2igg1s267e/l328f保留其adcp活性。将递增浓度(1ng/ml至1000ng/ml)的ox40sf2igg1s267e/l328f、ox40sf2igg1v12和ox40sf2igg1与稳定表达ox40的gfp阳性hek-bluetm细胞一起温育，该细胞与分化的巨噬细胞共培养，并通过流式细胞术测定评估gfp阳性靶细胞的吞噬作用。将反映adcp活性的gfp阳性细胞的消除百分比相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n≥6.图4c示出与野生型抗体(ox40sf2igg1)相比，ox40sf2igg1v12与分化的巨噬细胞的结合降低，而ox40sf2igg1s267e/l328f以相似的水平与巨噬细胞结合。将递增浓度(1ng/ml至1000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12抗体与分化的巨噬细胞一起温育，并使用流式细胞术测定评估它们的结合。将平均荧光信号对测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝2。图4d示出ox40sf2igg1v12和ox40sf2igg1s267e/l328f不介导cdc。将递增浓度(10至10,000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12抗体在兔补体存在下与稳定表达ox40的hek-bluetm细胞一起温育。通过测量从裂解细胞的胞质溶胶释放的乳酸脱氢酶(ldh)活性来定量cdc活性，并表示为相对于tritonx-100裂解的细胞毒性的细胞毒性百分比(数据表示为平均值±s.e.，n＝7)。图5示出从nanobrettmppi测定获得的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg1e430g、ox40sf2igg1e345r/e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y的校正生物发光共振能量转移(bret)比率，表明表达ox40的细胞表面上的抗体多聚化程度。ox40sf2igg1-n、ox40sf2igg1e345r-n、ox40sf2igg1e430g-n、ox40sf2igg1e345r/e430g-n和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y-n是与c末端nanoluc序列符合读框的构建体。ox40sf2igg1-h、ox40sf2igg1e345r-h、ox40sf2igg1e430g-h、ox40sf2igg1e345r/e430g-h和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y-h是与c末端halotag序列符合读框的构建体。将递增浓度(10ng/ml至1000ng/ml)的供体抗体和halo受体抗体应用于稳定表达ox40细胞的hek-bluetm细胞，并进行nanobretppi测定。将平均校正的bret比率与测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n≥2。图6a示出在hek-bluetmnfκb报告基因测定中当与ox40sf2igg1比较时，ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg1e430g、ox40sf2igg1e345r/e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y的增强的激动活性。将递增浓度(10ng/ml至1000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg1e430g、ox40sf2igg1e345r/e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y抗体应用于稳定表达ox40的hek-bluetm细胞，并测量seap分泌。将激动活性标准化为相对于由1μg/mlox40配体驱动的活性的活性百分比，并相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n≥9.图6b示出ox40sf2igg1e345r与raji细胞的交联进一步加强了hek-bluetmnfκb报告基因测定中抗体的激动活性。通过抗fcγriib抗体2b6对raji细胞上的fcγriib预阻断消除了加强。将激动活性标准化为相对于由1μg/mlox40配体驱动的活性的活性百分比，并相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝8.图6c示出ox40sf2igg2σ抗体在hek-bluetmnfκb报告基因测定中没有激动活性，该抗体单独或在raji细胞存在下交联与fc受体的结合中沉默。将激动活性标准化为相对于由1μg/mlox40配体驱动的活性的活性百分比，并相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝8.图6d示出e345r突变在hek-bluetmnfκb报告基因测定中营救了ox40sf2igg2σ的激动活性。然而，与raji细胞的交联未能进一步加强其激动活性。将激动活性标准化为相对于由1μg/mlox40配体驱动的活性的活性百分比，并相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n＝8.图7a示出，当与野生型抗体(ox40sf2igg1)相比时，ox40sf2igg1e345r具有增强的adcc，并且fc沉默的ox40sf2igg2σ和ox40sf2igg2σe345r抗体具有消除的adcc。将递增浓度(10ng/ml至1000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg2σ和ox40sf2igg2σe345r与稳定表达ox40的hek-bluetm细胞一起温育，该细胞与效应细胞共培养，并进行adcc报告基因生物测定。与没有抗体的样品相比，adcc的活化倍数相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n≥4.图7b示出ox40sf2igg1e345r具有能与野生型igg1(ox40sf2igg1)相比的adcp，并且e345r营救效应子沉默的抗体(ox40sf2igg2σe345r)。将递增浓度(1ng/ml至10000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg2σ和ox40sf2igg2σe345r抗体与稳定表达ox40的gfp阳性hek-bluetm细胞与分化的巨噬细胞一起温育，并通过流式细胞术测定评估gfp阳性靶细胞的吞噬作用。将反映adcp活性的gfp阳性细胞的消除百分比相对于测试抗体的浓度作图。数据表示为平均值±sem，n≥9.图7c示出e345r突变导致ox20sf2igg1e345r的cdc活性增强，但对效应子沉默的ox40sf2igg2σe345r没有影响。将递增浓度(10至10,000ng/ml)的ox40sf2igg1、ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg2σ和ox40sf2igg2σe345r抗体在兔补体存在下与稳定表达ox40的hek-bluetm细胞一起温育。通过测量从裂解细胞的胞质溶胶释放的ldh活性来定量cdc活性，并表示为相对于tritonx-100裂解的细胞毒性的细胞毒性百分比(数据表示为平均值±s.e.，n＝6)。具体实施方式本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。“抗肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员抗体”或“抗tnfr超家族成员抗体”是指特异性结合tnfr超家族成员的抗体。“tnfr超家族成员”包括属于tnfr超家族的受体，包括表1中所示的受体，包括天然存在的tnfr变体。tnfr通常表达为i型跨膜蛋白，并且在其细胞外域中含有一至六个富含半胱氨酸的域。信号传导作为tnfr三聚体发生。表1中示出每种tnfr的一种同种型的氨基酸序列。tnfr的配体也示于表1中。表1.“特异性结合”、“特异性地结合”或“结合”是指抗tnfr超家族成员抗体以比针对其他抗原更高的亲和力结合至特定tnfr超家族成员或该tnfr超家族成员内的表位。通常，当结合的平衡解离常数(kd)为约1×10-8m或更小(例如约1×10-9m或更小、约1×10-10m或更小、约1×10-11m或更小、或者约1×10-12m或更小)时，抗体“特异性结合”，通常该kd为该抗体结合至非特异性抗原(如bsa、酪蛋白)的kd的至少百分之一。可使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性结合至特定tnfr超家族成员或该特定tnfr超家族成员内的表位的抗tnfr抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(macacafascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(pantroglodytes)(chimpanzee,chimp))或狨猴(callithrixjacchus)(commonmarmoset,marmoset)的相同抗原具有交叉反应性。虽然单特异性抗体特异性结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体特异性结合两个不同的抗原或两个不同的表位。“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗体片段，双特异性或多特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体分子”包含由二硫键互连的两条重链(hc)与两条轻链(lc)以及它们的多聚体(例如igm)。每条重链均由重链可变区(vh)和重链恒定区(由域ch1、铰链、ch2和ch3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)构成。vh和vl区可进一步细分为超变区，称为互补决定区(cdr)，间插有框架区(fr)。各个vh和vl由三个cdr和四个fr片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。“互补决定区(cdr)”为抗体中的“抗原结合位点”。使用不同术语来定义cdr：(i)三个在vh中(hcdr1、hcdr2、hcdr3)且三个在vl中(lcdr1、lcdr2、lcdr3)的互补决定区(cdr)是基于序列变异性(wu等人(1970)jexpmed132:211-50；kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)。(ii)三个在vh中(h1、h2、h3)且三个在vl中(l1、l2、l3)的“高变区”、“hvr”或“hv”是指抗体可变域的在结构上高变的区域，如chothia和lesk所定义(chothia等人(1987)jmolbiol196:901-17)。国际免疫遗传学(imgt)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。cdr、hv和imgt描绘(delineation)之间的对应性描述于(lefranc等人(2003)devcompimmunol27:55-77中。除非另有明确地说明，本文所用的术语“cdr”、“hcdr1”、“hcdr2”、“hcdr3”、“lcdr1”、“lcdr2”和“lcdr3”包括由任何上述方法(kabat、chothia或imgt)定义的cdr。免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即iga、igd、ige、igg和igm。iga和igg进一步亚分类为同种型iga1、iga2、igg1、igg2、igg3和igg4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。“抗体片段”是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链抗原结合位点和/或轻链抗原结合位点，诸如重链互补决定区(hcdr)1、2和3，轻链互补决定区(lcdr)1、2和3，重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)。抗体片段包括熟知的fab、f(ab')2、fd和fv片段以及由一个vh域组成的域抗体(dab)。vh和vl域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在vh和vl域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，vh/vl域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链fv(scfv)或双价抗体；例如在国际专利公布wo1998/44001、wo1988/01649、wo1994/13804和wo1992/01047中有所描述。“单克隆抗体”是指在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成的抗体群，除了可能的熟知改变，诸如从抗体重链中除去c末端赖氨酸或由于氨基酸的翻译后修饰诸如甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱氨化所致的改变之外。单克隆抗体通常结合一个抗原表位，而双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，或者是单价的、二价的或多价的。术语“单克隆抗体”中包括双特异性抗体。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或抗体片段(例如，特异性结合例如ox-40的分离的抗体基本上不含特异性结合ox-40之外的抗原的抗体)。“分离抗体”涵盖分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含取代，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点均来源于人起源的序列并且优化为当施用给人类受试者时具有最小免疫应答。如果抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人起源的序列。如果人抗体的可变区来源于使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区或轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。由于用于获得抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，体细胞突变的引入或有意将取代引入框架或抗原结合位点或两者，“人抗体”与人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因相比可能含有氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列，例如在(knappik等人(2000)jmolbiol296:57-86)中所描述，或并入噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库的合成hcdr3，例如在(shi等人(2010)jmolbiol397:385-96)和在国际专利公布wo2009/085462中所描述。来源于人免疫球蛋白序列的人抗体可使用系统诸如噬菌体展示结合合成的cdr和/或合成的框架来生成，或者可对其进行体外诱变以改善抗体特性，从而得到不由体内整套人抗体种系表达的抗体。“人抗体”的定义中不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。“重组体”是指以重组手段制备、表达、创建或分离的抗体及其它蛋白质。“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。抗体“表位”取决于用来鉴定表位的方法。“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(macacafascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(pantroglodytes)(chimpanzee,chimp)或狨猴(callithrixjacchus)(commonmarmoset,marmoset))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个抗原之间所共享的表位。“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或同一抗原内的两个或更多个不同表位的抗体。“载体”是指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有元件诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记物，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统，例如细胞、病毒、动物、植物、以及利用能够复制载体的生物组分的重组生物系统中的复制或保持。载体多核苷酸可为单链或双链dna或rna分子或这些分子的杂合分子。“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。“多核苷酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其它等同共价化学物的合成分子。cdna是合成多核苷酸的典型示例。“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。如本文使用，“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指在体内、离体、或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。然而转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标记物水平调节、侵入、肿瘤生长(freshney,cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique(第3版，1994))。“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。“价”是指在分子中存在对于抗原为特异性的结合位点的指定数目。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别是指在分子中存在对于抗原为特异性的一个、两个、四个和六个结合位点。“激动剂”是指诱导tnfr超家族成员的至少一种生物活性的抗体，所述tnfr超家族成员与tnfr超家族成员的天然配体诱导的结合。示例性的激动活性包括在体外测定中诱导产生在nfκb诱导型启动子控制下表达的分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)，通过树突细胞(dc)上增加的cd80、cd83、cd86和hla-dr表面表达评估的dc分化的诱导，通过增加的b细胞增殖或b细胞上cd23、cd80、cd83、cd86和hla-dr表面表达增加评估的b细胞的活化，通过从先前暴露于抗原的患者中分离的pbmc产生干扰素γ(ifn-γ)评估的抗原特异性t细胞回忆应答的诱导，以及cd4+或cd8+t细胞增殖的诱导。激动活性(例如，激动作用)可以是交联依赖性或与抗体交联无关。“增强的激动活性”或“增强的激动作用”是指当与亲本野生型抗体相比时，工程化抗tnfr超家族成员抗体的激动作用的改善，当激动活性是通过抗tnfr超家族成员抗体诱导的在nfκb诱导型启动子的控制下表达的分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)产生来测量。当工程化抗体以交联依赖性或与交联无关方式诱导在与抗体浓度为1μg/ml的野生型亲本抗体相比高至少20％的水平下的seap产生时，该工程化抗体具有“增强的激动活性”。“交联”是指抗tnfr超家族成员抗体在表达tnfr超家族成员的细胞上的高阶多聚化，其由抗体结合fcγr(例如fcγriib顺式或反式)诱导，导致抗体诱导的tnfr多聚化和tnfr激动活性的诱导。可以通过使用抗人f(ab')2作为交联剂或表达fcγriib的细胞(例如本文所述的raji细胞)在体外评估交联。“与抗体交联无关的激动活性”是指抗体在不存在表达fcγr(例如fcγriib)的raji细胞下在溶液中在如本文实施例3中所述的hek-bluetm报告基因测定中诱导产生seap。“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另有明确说明，否则在整个说明书中，抗体恒定区中的氨基酸残基根据eu索引进行编号，如kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)中有所描述。本文使用如表2中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。表2.氨基酸三字母代码单字母代码丙氨酸alaa精氨酸argr天冬酰胺asnn天冬氨酸aspd半胱氨酸cysc谷氨酸glne谷氨酰胺gluq甘氨酸glyg组氨酸hish异亮氨酸ilei亮氨酸leul赖氨酸lysk甲硫氨酸metm苯丙氨酸phef脯氨酸prop丝氨酸sers苏氨酸thrt色氨酸trpw酪氨酸tyry缬氨酸valv物质的组成本发明提供了工程化抗tnfr超家族成员抗体，其具有改善的性质，显示出增强的激动活性，与抗体效应子功能的同种型依赖性调节相结合。本发明至少部分基于以下发现：在表面细胞上多聚化抗tnfr超家族成员抗体的取代增强抗体的激动活性而与交联无关。本发明提供一种分离的抗肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员抗体，其中所述抗体包含e345r突变，任选地还包含e430g突变、s440y突变或e430g/s440y突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无所述突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。本发明提供一种分离的抗肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员抗体，其中所述抗体包含e345r突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无所述突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。本文显示e345r取代增强抗tnfr超家族成员抗体的激动活性。本文显示e430g取代增强抗tnfr超家族成员抗体的激动活性。本文显示e345r/e430g取代增强抗tnfr超家族成员抗体的激动活性。本文显示e345r/e430g/s440y取代增强抗tnfr超家族成员抗体的激动活性。本发明提供一种分离的抗tnfr超家族成员抗体，其中所述抗体包含e345r突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无e345r突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。本发明提供一种分离的抗tnfr超家族成员抗体，其中所述抗体包含e430g突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无e430g突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。本发明提供一种分离的抗tnfr超家族成员抗体，其中所述抗体包含e345r/e430g突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无e345r/e430g突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。本发明提供一种分离的抗tnfr超家族成员抗体，其中所述抗体包含e345r/e430g/s440y突变，残基根据eu索引进行编号，并且所述抗体当与无e345r/e430g/s440y突变的亲本抗体进行比较时具有增强的激动活性。在一些实施方案中，本发明的抗tnfr超家族成员抗体具有与fcγr抗体交联无关的激动活性。因此，具有与fcγr交联无关的激动活性的本发明抗体的激动活性不依赖于在肿瘤微环境中表达fcγr的细胞的生物利用度和密度，并且可以在缺乏足够fcγr细胞浸润的环境中诱导tnfr信号传导。本发明的抗tnfr超家族成员抗体可以表现出比天然配体低的激动水平，因此可以提供改善的安全特性。“亲本抗体”是指用于产生本发明的工程化抗体的抗tnfr超家族成员抗体。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞吞噬(adcp)。在一些实施方案中，抗体介导cdc。在一些实施方案中，包含e345r突变的本发明的抗体可以进一步包含减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变。因此，包含e435r突变和减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变的本发明抗体可用于不希望耗尽表达tnfr的细胞的情况。示例性的此类情况是用抗cd40或抗cd27抗体的治疗性治疗。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234f/l235e/d265a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含k214t/e233p/l234v/l235a/g236缺失/a327g/p331a/d365e/l358m突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg1同种型，并且当与野生型igg1比较时，还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg2同种型，并且当与野生型igg2比较时，还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含h268q/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg3同种型。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g236缺失/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且是igg4同种型，并且当与野生型igg4比较时包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且具有与抗体交联无关的激动活性，其中通过测量在nfκb诱导型启动子控制下表达的分泌性胚胎碱性磷酸酶(seap)从hek-293细胞的抗体诱导产生来测量激动活性。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并结合tnfr超家族成员肿瘤坏死因子受体1(seqidno:1)、肿瘤坏死因子受体2(seqidno:2)、淋巴毒素β受体(seqidno:3)、ox40(seqidno:4)、cd40(seqidno:5)、fas受体(seqidno:6)、诱饵受体3(seqidno:7)、cd27(seqidno:8)、cd30(seqidno:9)、cd137(seqidno:10)、死亡受体4(seqidno:11)、死亡受体5(seqidno:12)、诱饵受体1(seqidno:13)、诱饵受体2(seqidno:14)、rank(seqidno:15)、骨保护素(seqidno:16)、tweak受体(seqidno:17)、taci(seqidno:18)、baff受体(seqidno:19)、疱疹病毒进入介质(seqidno:20)、神经生长因子受体(seqidno:21)、b细胞成熟抗原(seqidno:22)、gitr(seqidno)：23)、troy(seqidno:24)、死亡受体6(seqidno:25)，死亡受体3(seqidno:26)或外异蛋白a2受体(seqidno:27)。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)、cd27(seqidno:8)、cd40(seqidno:5)、cd137(seqidno:10)或gitr(seqidno:23)。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且结合tnfr超家族成员cd27(seqidno:8)。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且结合tnfr超家族成员cd40(seqidno:5)。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且结合tnfr超家族成员cd137(seqidno:10)。在一些实施方案中，抗体包含e345r突变并且结合tnfr超家族成员gitr(seqidno:23)。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(nsclc)。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状nsclc。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗腺癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(rcc)(例如，肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(npc)。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或去势抵抗性前列腺癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗泌尿生殖系统癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。该包含e345r突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞吞噬(adcp)。在一些实施方案中，抗体介导cdc。在一些实施方案中，包含e430g突变的本发明的抗体可以进一步包含减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变。因此，包含e430g突变和减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变的本发明抗体可用于不希望耗尽表达tnfr的细胞的情况。示例性的此类情况是用抗cd40或抗cd27抗体的治疗性治疗。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234f/l235e/d265a突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含k214t/e233p/l234v/l235a/g236缺失/a327g/p331a/d365e/l358m突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg1同种型，并且当与野生型igg1比较时，还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg2同种型，并且当与野生型igg2比较时，还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含h268q/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg3同种型。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g236缺失/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且是igg4同种型，并且当与野生型igg4比较时包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且具有与抗体交联无关的激动活性，其中通过测量在nfκb诱导型启动子控制下表达的分泌性胚胎碱性磷酸酶(seap)从hek-293细胞的抗体诱导产生来测量激动活性。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并结合tnfr超家族成员肿瘤坏死因子受体1(seqidno:1)、肿瘤坏死因子受体2(seqidno:2)、淋巴毒素β受体(seqidno:3)、ox40(seqidno:4)、cd40(seqidno:5)、fas受体(seqidno:6)、诱饵受体3(seqidno:7)、cd27(seqidno:8)、cd30(seqidno:9)、cd137(seqidno:10)、死亡受体4(seqidno:11)、死亡受体5(seqidno:12)、诱饵受体1(seqidno:13)、诱饵受体2(seqidno:14)、rank(seqidno:15)、骨保护素(seqidno:16)、tweak受体(seqidno:17)、taci(seqidno:18)、baff受体(seqidno:19)、疱疹病毒进入介质(seqidno:20)、神经生长因子受体(seqidno:21)、b细胞成熟抗原(seqidno:22)、gitr(seqidno)：23)、troy(seqidno:24)、死亡受体6(seqidno:25)，死亡受体3(seqidno:26)或外异蛋白a2受体(seqidno:27)。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)、cd27(seqidno:8)、cd40(seqidno:5)、cd137(seqidno:10)或gitr(seqidno:23)。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且结合tnfr超家族成员cd27(seqidno:8)。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且结合tnfr超家族成员cd40(seqidno:5)。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且结合tnfr超家族成员cd137(seqidno:10)。在一些实施方案中，抗体包含e430g突变并且结合tnfr超家族成员gitr(seqidno:23)。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(nsclc)。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状nsclc。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗腺癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(rcc)(例如，肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(npc)。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或去势抵抗性前列腺癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗泌尿生殖系统癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。该包含e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞吞噬(adcp)。在一些实施方案中，抗体介导cdc。在一些实施方案中，包含e345r/e430g突变的本发明的抗体可以进一步包含减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变。因此，包含e345r/e430g突变和减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变的本发明抗体可用于不希望耗尽表达tnfr的细胞的情况。示例性的此类情况是用抗cd40或抗cd27抗体的治疗性治疗。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234f/l235e/d265a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含k214t/e233p/l234v/l235a/g236缺失/a327g/p331a/d365e/l358m突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg1同种型，并且当与野生型igg1比较时，还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg2同种型，并且当与野生型igg2比较时，还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含h268q/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg3同种型。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g236缺失/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且是igg4同种型，并且当与野生型igg4比较时包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且具有与抗体交联无关的激动活性，其中通过测量在nfκb诱导型启动子控制下表达的分泌性胚胎碱性磷酸酶(seap)从hek-293细胞的抗体诱导产生来测量激动活性。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并结合tnfr超家族成员肿瘤坏死因子受体1(seqidno:1)、肿瘤坏死因子受体2(seqidno:2)、淋巴毒素β受体(seqidno:3)、ox40(seqidno:4)、cd40(seqidno:5)、fas受体(seqidno:6)、诱饵受体3(seqidno:7)、cd27(seqidno:8)、cd30(seqidno:9)、cd137(seqidno:10)、死亡受体4(seqidno:11)、死亡受体5(seqidno:12)、诱饵受体1(seqidno:13)、诱饵受体2(seqidno:14)、rank(seqidno:15)、骨保护素(seqidno:16)、tweak受体(seqidno:17)、taci(seqidno:18)、baff受体(seqidno:19)、疱疹病毒进入介质(seqidno:20)、神经生长因子受体(seqidno:21)、b细胞成熟抗原(seqidno:22)、gitr(seqidno)：23)、troy(seqidno:24)、死亡受体6(seqidno:25)，死亡受体3(seqidno:26)或外异蛋白a2受体(seqidno:27)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)、cd27(seqidno:8)、cd40(seqidno:5)、cd137(seqidno:10)或gitr(seqidno:23)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且结合tnfr超家族成员cd27(seqidno:8)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且结合tnfr超家族成员cd40(seqidno:5)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且结合tnfr超家族成员cd137(seqidno:10)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g突变并且结合tnfr超家族成员gitr(seqidno:23)。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(nsclc)。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状nsclc。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(rcc)(例如，肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(npc)。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或去势抵抗性前列腺癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗泌尿生殖系统癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。该包含e345r/e430g突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)。在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞吞噬(adcp)。在一些实施方案中，抗体介导cdc。在一些实施方案中，包含e345r/e430g/s440y突变的本发明的抗体可以进一步包含减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变。因此，包含e345r/e430g/s440y突变和减少或消除抗体fc介导的效应子功能的第二突变的本发明抗体可用于不希望耗尽表达tnfr的细胞的情况。示例性的此类情况是用抗cd40或抗cd27抗体的治疗性治疗。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234f/l235e/d265a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含k214t/e233p/l234v/l235a/g236缺失/a327g/p331a/d365e/l358m突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg1同种型，当与野生型igg1比较时，任选地还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg1同种型，并且当与野生型igg1比较时，还包含l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg2同种型，并且当与野生型igg2比较时，还包含v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含v234a/g237a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg2同种型，当与野生型igg2比较时，任选地还包含h268q/v309l/a330s/p331s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg3同种型。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a/g236缺失/g237a/p238s突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg4同种型，当与野生型igg4比较时，任选地还包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且是igg4同种型，并且当与野生型igg4比较时包含s228p/f234a/l235a突变。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且具有与抗体交联无关的激动活性，其中通过测量在nfκb诱导型启动子控制下表达的分泌性胚胎碱性磷酸酶(seap)从hek-293细胞的抗体诱导产生来测量激动活性。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并结合tnfr超家族成员肿瘤坏死因子受体1(seqidno:1)、肿瘤坏死因子受体2(seqidno:2)、淋巴毒素β受体(seqidno:3)、ox40(seqidno:4)、cd40(seqidno:5)、fas受体(seqidno:6)、诱饵受体3(seqidno:7)、cd27(seqidno:8)、cd30(seqidno:9)、cd137(seqidno:10)、死亡受体4(seqidno:11)、死亡受体5(seqidno:12)、诱饵受体1(seqidno:13)、诱饵受体2(seqidno:14)、rank(seqidno:15)、骨保护素(seqidno:16)、tweak受体(seqidno:17)、taci(seqidno:18)、baff受体(seqidno:19)、疱疹病毒进入介质(seqidno:20)、神经生长因子受体(seqidno:21)、b细胞成熟抗原(seqidno:22)、gitr(seqidno)：23)、troy(seqidno:24)、死亡受体6(seqidno:25)，死亡受体3(seqidno:26)或外异蛋白a2受体(seqidno:27)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)、cd27(seqidno:8)、cd40(seqidno:5)、cd137(seqidno:10)或gitr(seqidno:23)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且结合tnfr超家族成员ox40(seqidno:4)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且结合tnfr超家族成员cd27(seqidno:8)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且结合tnfr超家族成员cd40(seqidno:5)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且结合tnfr超家族成员cd137(seqidno:10)。在一些实施方案中，抗体包含e345r/e430g/s440y突变并且结合tnfr超家族成员gitr(seqidno:23)。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(nsclc)。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状nsclc。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(rcc)(例如，肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(npc)。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或去势抵抗性前列腺癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗泌尿生殖系统癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。该包含e345r/e430g/s440y突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的fcγ受体(fcγr)发生的相互作用。例如，nk细胞表达fcγriiia，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriiia。因为效应子细胞通过分泌膜孔形成蛋白和蛋白酶而具有的活性会导致抗体包被靶细胞诸如表达tnfr的细胞发生死亡。为评估本发明抗体的adcc活性，可将抗体与免疫效应细胞联合加入到表达tnfr的细胞中，该免疫效应细胞可被抗原抗体复合物激活，从而使靶细胞发生细胞裂解。根据从裂解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞裂解。用于此类测定法的示例性效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和nk细胞。示例性靶细胞包括内源性或重组表达tnfr的细胞，诸如treg。在示例性测定中，可以按1个靶细胞与50个效应细胞的比率使用靶细胞。将靶细胞用batda(perkinelmer)在37℃预标记20分钟，洗涤两次并重悬浮于dmem、10％热灭活的fbs、2mml-谷氨酰胺(均来自invitrogen)中。组合靶(1×104个细胞)和效应细胞(0.5×106个细胞)，并且将100μl细胞加入96孔u形底板的孔中。在具有或不具有测试抗体情况下添加另外100μl。将板以200g离心3分钟，在37℃温育2小时，随后再次以200g离心3分钟。从每个孔中取出总共20μl的上清液，然后加入200μl基于delphiaeuropium的试剂(perkinelmer)并测定细胞溶解。使数据针对使用0.67％tritonx-100(sigmaaldrich)的最大细胞毒性和通过在不存在任何抗体的情况下来自靶细胞的batda自发释放测定的最小对照标准化。另选地，可以如本文所述通过评估报告基因测定中fcγriiia的活化来评估adcc活性，其中受体的活化导致荧光素酶报告基因的表达。“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“adcp”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。adcp可通过如下方式评估：使用单核细胞来源的巨噬细胞作为效应细胞，并使用daudi细胞(ccl-213tm)或者表达tnfr的b细胞白血病或淋巴瘤肿瘤细胞作为被工程化为表达gfp或另一标记分子的靶细胞。效应细胞:靶细胞比例可为例如4:1。可在含或不含本发明抗体的情况下，将效应细胞与靶细胞一起温育4小时。在温育后，可使用细胞消化液(accutase)分离细胞。可使用偶联至荧光标记的抗-cd11b抗体和抗-cd14抗体鉴定巨噬细胞，并且可使用标准方法基于cd11+cd14+巨噬细胞中的gfp荧光％确定吞噬百分比。本发明抗体的效应子功能，例如adcc、adcp和/或cdc，还可通过将另外的突变引入抗体fc中来增强，这增强了抗体与活化fcγ受体(fcγr)或互补序列的结合。可被突变以增加本发明抗体与活化fcγ的结合和/或增强抗体效应子功能的fc位置是例如描述于美国专利6,737,056；美国专利公布2015/0259434，shields等人(2001)jbiolchem276:6591-604,lazar等人(2006)procnatlacadsciusa103:4005-10，stavenhagen等人(2007)cancerres67:8882-90,richards等人(2008)molcancerther7:2517-27和diebolder等人(2014)science343:1260-3并且包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、360、339、378、396或430(残基根据eu索引进行编号)。可单独地或组合进行的示例性突变为g236a、s239d、f243l、t256a、k290a、r292p、s298a、y300l、v305l、k326a、a330k、i332e、e333a、k334a、a339t和p396l突变。导致adcc或adcp增加的抗体的示例性组合突变为igg1上的s239d/i332e、s298a/e333a/k334a、f243l/r292p/y300l、f243l/r292p/y300l/p396l、f243l/r292p/y300l/v305i/p396l和g236a/s239d/i332e突变。可被突变以增强本发明抗体cdc的fc位置是描述于例如国际专利申请wo2014/108198，idusogie等人(2001)jimmunol166:2571-5和moore等人(2010)mabs2:181-9中所述的那些，并且包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独地或组合进行的示例性突变为s267e、h268f、s324t、k326a、k326w、e333a、e430s、e430f和e430t突变。导致cdc增加的抗体的示例性组合突变为igg1上的k326a/e333a、k326w/e333a、h268f/s324t、s267e/h268f、s267e/s324t和s267e/h268f/s324t突变。“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的fc效应域结合并激活补体成分c1q，c1q继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，cr3)来促进adcc。可例如通过如下方式测量表达tnfr的细胞的cdc：将daudi细胞以1×105个细胞/孔(50μl/孔)接种到rpmi-b(补充有1％bsa的rpmi)中，将50μl测试抗体以0-100μg/ml之间的最终浓度加入到孔中，将反应在室温下温育15分钟，将11μl的混合人血清加入到孔中，然后将反应在37℃下温育45分钟。可使用标准方法在facs测定法中检测碘化丙啶染色细胞％作为裂解细胞百分比(％)。本发明抗体诱导adcc的能力也可通过工程化其低聚糖组分来增强。人igg1或igg3在asn297处被熟知的双分枝g0、g0f、g1、g1f、g2或g2f形式的大多数聚糖n-糖基化。未工程化的cho细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的fcγriiia结合来增强抗体的adcc，而不会改变抗原结合或cdc活性。此类mab可以使用报道的不同方法实现，所述方法导致成功表达具有双分枝复合物型fc寡糖的相对高的去核糖基化抗体，诸如培养渗透压的控制(konno等人(2012)cytotechnology64:249-65)，应用变体cho系lec13作为宿主细胞系(shields等人(2002)jbiolchem277:26733-40)，应用变体cho系eb66作为宿主细胞系(olivier等人(2010)mabs2:405-15)应用大鼠杂交瘤细胞系yb2/0作为宿主细胞系(shinkawa等人(2003)jbiolchem278:3466-73)，引入了特异性针对α1,6-岩藻糖基转移酶(fut8)基因的小干扰rna(mori等人(2004)biotechnolbioeng88:901-8)，或共表达β-1,4-n-乙酰葡糖胺基转移酶iii和高尔基α-甘露糖苷酶ii或有效的α-甘露糖苷酶i抑制剂kifunensine(ferrara等人(2006)jbiolchem281:5032-6；ferrara等人(2006)biotechnolbioeng93:851-61；zhou等人(2008)biotechnolbioeng99:652-65)。在一些实施方案中，本发明的抗tnfr超家族成员抗体包含增强抗体的adcc、adcp和/或cdc的第二突变。在一些实施方案中，本发明的抗tnfr超家族成员抗体包含增强抗体的adcc、adcp和/或cdc的第二突变，所述第二突变选自g236a突变、s239d突变、f243l突变、t256a突变、k290a突变、r292p突变、s298a突变、y300l突变、v305l突变、k326a突变、a330k突变、i332e突变、e333a突变、k334a突变、a339t突变、p396l突变、s267e突变、h268f突变、s324t突变、k326a突变、k326w突变、e333a突变、e430s突变、e430f突变和e430t突变。在一些实施方案中，本发明的抗tnfr超家族成员抗体包含增强抗体的adcc、adcp和/或cdc的第二突变，所述第二突变选自s239d/i332e突变、s298a/e333a/k334a突变、f243l/r292p/y300l突变、f243l/r292p/y300l/p396l突变、f243l/r292p/y300l/v305i/p396l突变、g236a/s239d/i332e突变、k326a/e333a突变、k326w/e333a突变、h268f/s324t突变、s267e/h268f突变、s267e/s324t突变和s267e/h268f/s324t突变。本发明抗体诱导adcc的能力可通过工程化其低聚糖组分来增强。人igg1或igg3在asn297处被熟知的双分枝g0、g0f、g1、g1f、g2或g2f形式的大多数聚糖n-糖基化。未工程化的cho细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的fcγriiia结合来增强抗体的adcc，而不会改变抗原结合或cdc活性。在一些实施方案中，本发明的抗tnfr超家族成员抗体具有岩藻糖含量为约0％至约15％，例如15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的双分枝聚糖结构。在一些实施方案中，本发明的抗tnfr超家族成员抗体具有岩藻糖含量为约50％、40％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的双分枝聚糖结构。“岩藻糖含量”意指asn297处糖链内的岩藻糖单糖的量。岩藻糖的相对量为含岩藻糖的结构相对于所有糖结构的百分比。这些可通过多种方法进行表征和定量，例如：1)使用经n-糖苷酶f处理的样本(例如，复合结构、混合结构及低聚甘露糖结构和高甘露糖结构)的maldi-tof，如国际专利公布wo2008/077546中所述；2)通过酶促释放asn297聚糖，随后衍生化并通过具有荧光检测的hplc(uplc)和/或hplc-ms(uplc-ms)进行检测/定量；3)在用或不用endos或其它酶处理asn297聚糖的情况下，对天然或还原后的mab进行完整蛋白分析，所述其它酶在第一glcnac单糖和第二glcnac单糖之间进行裂解，留下连接至第一glcnac的岩藻糖；4)通过酶消化(例如，胰蛋白酶或肽链内切酶lys-c)将mab消化为成分肽，随后通过hplc-ms(uplc-ms)进行分离、检测和定量；或5)用pngasef在asn297处进行特异性酶促去糖基化，从而将mab低聚糖与mab蛋白分离。可通过各种互补技术对释放的低聚糖进行荧光团标记、分离并鉴定，这些技术允许：采用基质辅助激光解吸电离(maldi)质谱法，通过比较实验质量与理论质量来对聚糖结构进行精细表征；通过离子交换hplc(glycosepc)确定唾液酸化程度；通过正相hplc(glycosepn)，根据亲水性标准分离和定量低聚糖形式；以及通过高效毛细管电泳激光诱导荧光(hpce-lif)分离和定量低聚糖。“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量为约0％至15％。“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量大约高于50％，通常大约高于60％、70％、80％或高于85％。在不需要效应子功能的情况下，本发明的抗体可以进一步工程化以在抗体fc中引入至少一个突变，其降低抗体与活化fcγ受体(fcγr)的结合和/或降低fc效应子功能，诸如c1q结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或吞噬作用(adcp)。可突变以降低抗体与活化fcγr结合并随后降低效应子功能的fc位置是描述于例如shields等人(2001)jbiolchem276:6591-604，国际专利公布wo2011/066501、美国专利6,737,056和5,624,821，xu等人(2000)cellimmunol200:16-26，alegre等人(1994)transplantation57:1537-43，bolt等人(1993)eurjimmunol23:403-11，cole等人(1999)transplantation68:563-71，rother等人(2007)natbiotechnol25:1256-64，ghevaert等人(2008)jclininvest118:2929-38，an等人(2009)mabs1:572-9并包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合进行的示例性突变为igg1、igg2、igg3或igg4中的k214t、e233p、l234v、l234a、g236缺失、v234a、f234a、l235a、g237a、p238a、p238s、d265a、s267e、h268a、h268q、q268a、n297a、a327q、p329a、d270a、q295a、v309l、a327s、l328f、a330s和p331s突变。可以降低adcc的示例性组合突变是igg1上的l234a/l235a、igg2上的v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s、igg4上的f234a/l235a、igg4上的s228p/f234a/l235a、(igg1、igg2、igg3或igg4)上的n297a、igg2上的v234a/g237a、igg1上的k214t/e233p/l234v/l235a/g236缺失/a327g/p331a/d365e/l358m、igg2上的h268q/v309l/a330s/p331s、igg1上的s267e/l328f、igg1上的l234f/l235e/d265a、igg1上的l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s、igg4上的s228p/f234a/l235a/g237a/p238s、以及igg4上的s228p/f234a/l235a/g236缺失/g237a/p238s。还可使用杂合igg2/4fc域，例如具有来自igg2的残基117-260和来自igg4的残基261-447的fc。可以将s228p突变制成igg4抗体以增强igg4稳定性。在一些实施方案中，本发明的抗体包含第二突变，所述第二突变选自k214t突变、e233p突变、l234v突变、l234a突变、g236缺失、v234a突变、f234a突变、l235a突变、g237a突变、p238a突变、p238s突变、d265a突变、s267e突变、h268a突变、h268q突变、q268a突变、n297a突变、a327q突变、p329a突变、d270a突变、q295a突变、v309l突变、a327s突变、l328f突变、a330s突变和p331s突变，其中残基根据eu索引进行编号。本发明的抗体可以进一步工程化以通过引入额外的fc突变来调节抗体半衰期，诸如在dall'acqua等人(2006)jbiolchem281:23514-24，zalevsky等人(2010)natbiotechnol28:157-9，hinton等人(2004)jbiolchem279:6213-6，hinton等人(2006)jimmunol176:346-56，shields等人(2001)jbiolchem276:6591-604，petkova等人(2006)intimmunol18:1759-69，datta-mannan等人(2007)drugmetabdispos35:86-94，vaccaro等人(2005)natbiotechnol23:1283-8，yeung等人(2010)cancerres70:3269-77和kim等人(1999)eurjimmunol29:2819-25中所述的那些并且包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可以单独或组合进行的示例性突变是t250q、m252y、i253a、s254t、t256e、p257i、t307a、d376v、e380a、m428l、h433k、n434s、n434a、n434h、n434f、h435a和h435r突变。可用于增长抗体半衰期的示例性单突变或组合突变是m428l/n434s、m252y/s254t/t256e、t250q/m428l、n434a和t307a/e380a/n434a突变。可用于减小抗体半衰期的示例性单突变或组合突变是h435a、p257i/n434h、d376v/n434h、m252y/s254t/t256e/h433k/n434f、t308p/n434a和h435r突变。还包含保守修饰的本发明的抗体在本发明的范围内。“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守取代是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来取代，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(maclennan等人(1998)actaphysiolscandsuppl643:55-67；sasaki等人(1998)advbiophys35:1-24)。对本发明的抗体的氨基酸取代可通过已知的方法进行，例如通过pcr诱变(美国专利4,683,195)进行。另选地，可例如使用随机(nnk)或非随机密码子(例如dvk密码子，其编码11个氨基酸(ala、cys、asp、glu、gly、lys、asn、arg、ser、tyr、trp))来产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可以与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学性质。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来实施。已经证实治疗性抗体与peg的共轭增强药效学而不干扰功能(leong等人(2001)cytokine16:106-19；yang等人(2003)proteineng16:761-70；knight等人(2004)platelets15:409-18)。可经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其它所需生物学或生物物理学特性的本发明的抗体在本发明的范围之内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，(2)对hc和lc配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的h键网络；以及(5)其他分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(worn等人(2001)jmolbiol305:989-1010)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(dsc)测量的热转变中间点(tm)。一般而言，蛋白质tm与其稳定性相关，与其对在溶液中的解折叠和变性以及对取决于蛋白质解折叠趋向的降解过程的敏感性负相关(remmele等人(2000)biopharm.13:36-46)。有许多研究发现了配方的通过dsc按热稳定性测量的物理稳定性排序与通过其他方法测量的物理稳定性之间的相关性(maa等人(1996)int.j.pharm.140:155-68；remmele等人(1997)pharm.res.15:200-8；gupta等人(2003)aapspharmsci.5e8:2003；bedu-addo等人(2004)pharm.res.21:1353-61；zhang等人(2004)j.pharm.sci.93:3076-89)。制剂研究提示，fabtm对相应mab的长期物理稳定性有影响。可通过在血流中内源性循环羧肽酶从注射的抗体中移除c-末端赖氨酸(ctl)(cai等人(2011)biotechnolbioeng108:404-12)。在制备期间，可通过控制细胞外zn2+、edta或edta–fe3+的浓度，将ctl移除控制到小于最大水平，如美国专利公开us20140273092中有所描述。抗体中的ctl含量可使用已知方法测定。在一些实施方案中，本发明的抗体具有约10％至约90％、约20％至约80％、约40％至约70％、约55％至约70％、或约60％的c-末端赖氨酸含量。在一些实施方案中，本发明的抗体具有约0％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的c-末端赖氨酸含量。产生本发明抗体的方法可以使用标准克隆和表达技术，使用野生型igg1、igg2、igg3或igg4序列作为模板，产生具有工程化fc域的本发明抗体。例如，可以进行定点诱变或pcr介导的诱变以在抗体fc中引入突变，并且可以使用本文所述方法评估抗体与fcγr的结合、激动活性或其他感兴趣的性质的影响。可以从头产生抗tnfr超家族成员抗体的vh和vl域。例如，可使用kohler和milstein,nature256:495,1975所述的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用人tnfr或tnfr的细胞外域免疫小鼠或其他宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice，第59-103页(academicpress,1986))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。各种宿主动物可用于产生本发明的抗tnfr超家族成员抗体。例如，可使用balb/c小鼠来产生小鼠抗人tnfr超家族成员抗体。可使用各种技术来人源化由balb/c小鼠和其它非人动物制备的抗体，从而产生更类似人的序列。包括选择人受体框架的示例性人源化技术是已知的，并且包括cdr接枝(美国专利5,225,539)、sdr接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(padlan(1991)molimmunol28:489-98)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布2010/0261620)、人框架改型(美国专利8,748,356)或超人源化(美国专利7,709,226)。在这些方法中，亲本抗体的cdr被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于cdr长度的相似性、或规范结构同一性、或它们的组合进行选择。可通过如下过程进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公开wo1090/007861和wo1992/22653中所述的技术，引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过在任何cdr处引入变体例如来改善抗体的亲和力。基因组中携带人免疫球蛋白(ig)基因座的转基因动物(诸如小鼠或大鼠)可用于生成抗目标蛋白质的人抗体，这在例如美国专利6,150,584、国际专利公布wo99/45962、国际专利公开wo2002/066630、wo2002/43478、wo2002/043478和wo1990/04036，lonberg等人(1994)nature368:856-9；green等人(1994)natgenet7:13-21；green等人(1998)jexpmed188:483-95；lonberg等人(1995)intrevimmunol13:65-93；bruggemann等人(1991)eurjimmunol21:1323-6；fishwild等人(1996)natbiotechnol14:845-51；mendez等人(1997)natgenet15:146-56；green(1999)jimmunolmethods231:11-23；yang等人(1999)cancerres59:1236-43；bruggemann等人(1997)curropinbiotechnol8:455-8中有所描述。可破坏此类动物中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入动物的基因组中。可邀请诸如regeneron(http://_www_regeneron_com)、harbourantibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、openmonoclonaltechnology,inc.(omt)(http://_www_omtinc_net)、kymab(http://_www_kymab_com)、trianni(http://_www.trianni_com)和ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司使用上述技术以提供抗所选抗原的人抗体。人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如fab、单链抗体(scfv)或者未配对或配对抗体可变区(knappik等人(2000)jmolbiol296:57-86；krebs等人(2001)jimmunolmethods254:67-84；vaughan等人(1996)natbiotechnol14:309-14；sheets等人(1998)procnatlacadsciusa95:6157-62；clackson等人(1991)nature352:624-8；marks等人(1991)jmolbiol222:581-97)。本发明的抗体可以例如从表达抗体重链和轻链可变区的噬菌体展示文库中分离，作为与噬菌体pix外壳蛋白的融合蛋白，如(shi等人(2010)jmolbiol397:385-96和国际专利公布wo09/085462)中所述。可从文库中筛选结合到人和/或cynotnfr的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆裂解物中分离fab，并将其表达为全长igg。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法描述于例如：美国专利5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,427,908、5,580,717、5,969,108、6,172,197、5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。本发明的抗tnfr超家族成员抗体的vh/vl区也可以从现有的抗tnfr超家族受体抗体中获得。抗ox40抗体的vh和vl区描述于美国专利us8133983、美国专利us7960515、美国专利公布us2013/0280275、国际专利公布wo2013/028231和美国专利公布us2014/0377284，可用于工程化本发明的抗体。此外，可以使用抗ox40抗体medi-6469、bms-986178、moxr-0916、medi-6383、medi-0562、pf-04518600或gsk-3174998的vh/vl区。可用于产生本发明的工程化抗ox40抗体的另外的示例性vh和vl区是：seqidno:51(在us2014/0377284中描述的抗体sf2的vh)qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfkdytmhwvrqapgqglewiggiypnnggstynqnfkdrvtltadkststaymelsslrsedtavyycarmgyhgphldfdvwgqgttvtvssseqidno:52(在us2014/0377284中描述的抗体sf2的vl)diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqdvgaavawyqqkpgkapklliywastrhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyinypltfgggtkveikseqidno:53(在us2014/0377284中描述的12h3vh1vl1的vh)qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfkdytmhwvrqapgqglewmggiypnnggstynqnfkdrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarmgyhgphldfdvwgqgttvtvssseqidno:54(在us2014/0377284中描述的12h3vh1vl1的vl)diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqdvgaavawyqqkpgkapklliywastrhtgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyinypltfgggtkveikseqidno:55(在us2014/0377284中描述的20e5vh3vl2的vh)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsyvmhwvrqapgqrlewigyinpyndgtkynekfkgratltsdksastaymelsslrsedtavyycanyygsslsmdywgqgtlvtvssseqidno:56(在us2014/0377284中描述的20e5vh3vl2的vl)diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwyqqkpgkavklliyytsrlhsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyfcqqgntlpwtfgqgtkveik可用于工程化本发明抗体的抗cd40抗体的vh和vl区是美国专利7,288,251(抗体21.4.1)和美国专利8,303,955中分别描述的cp-870,893和人源化s2c6的vh和vl区以及国际专利公布wo2001/056603、wo2001/083755、wo2013/034904和wo2014/070934中所述的抗-cd40抗体。可用于产生本发明的工程化抗cd40抗体的另外的示例性vh和vl区是：seqidno:57(m9抗体的vh)qlqlqesgpglvkpseilsltctvsggsissssyywgwirqppgkglewigniyyrgdtyyspslksrvtisvdtsknqfslklnsvtaadtavyycakgfrfdywgqgtlvtvssseqidno:58(m9抗体的vl)qsaltqppsasgspgqsvtisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmiyevskrpsgvpdrfsgsksgntasltvsglqaedeadyycssyagsnnlvfgggtkltvl可用于工程化本发明抗体的抗gitr抗体的vh和vl区是美国专利7,812,135、8,591,886和7,618,632或国际专利公布wo2011/028683、wo2013/039954、wo2005/007190和wo2007/133822中描述的那些。可用于工程化本发明抗体的抗cd27抗体的vh和vl区是美国专利us9169325和美国专利公布us20130183316中描述的那些。可用于工程化本发明抗体的抗cd137抗体的vh和vl区是美国专利7288638、8716452和8821867中描述的那些。工程化为全长双特异性抗体的本发明抗体在本发明的范围内。“全长抗体”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(hc)由众所周知的重链可变区和恒定区vh、ch1、铰链、ch2和ch3组成。全长抗体轻链(lc)由众所周知的轻链可变区和恒定区vl和cl组成。全长抗体可能缺少一条或两条重链中的c-末端赖氨酸(k)。全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链ch3交界处引入取代以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。“fab臂”或“半分子”是指特异性地结合抗原的一个重链-轻链对。fab臂交换反应是二硫键异构化反应和ch3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的ch3域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以将fab臂的ch3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个fab臂或半分子各自结合不同的表位，即tnfr上的表位和第二抗原上的表位。“同源二聚化”是指具有相同ch3氨基酸序列的两条重链的相互作用。“同源二聚体”是指具有含有相同ch3氨基酸序列的两条重链的抗体。“异源二聚化”是指具有不同ch3氨基酸序列的两条重链的相互作用。“异源二聚体”是指具有含有不同ch3氨基酸序列的两条重链的抗体。本发明的抗tnfr超家族成员抗体也可使用诸如钮扣(knob-in-hole)(genentech)、crossmabs(roche)和静电匹配(chugai,amgen,novonordisk,oncomed)、luz-y(genentech)、链交换工程域体(seedbody)(emdserono)、以及biclonic(merus)工程化成双特异性形式。在“钮扣”策略(参见，例如国际公布wo2006/028936)中，在人igg中形成ch3域的交界的选定氨基酸可在影响ch3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性ch3取代对(表示为第一重链的第一ch3域中的修饰位置/第二重链的第二ch3域中的修饰位置)是：t366y/f405a、t366w/f405w、f405w/y407a、t394w/y407t、t394s/y407a、t366w/t394s、f405w/t394s和t366w/t366s_l368a_y407v。在crossmab技术中，除利用“钮扣”策略促进fab壁交换之外，在半臂之一中具有交换的ch1和cl域，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。可使用其他交换策略如下产生全长双特异性抗体：在双特异性抗体的一个或两个臂中，在重链与轻链之间或重链之内交换可变域或恒定域、或这两种域。这些交换包括例如vh-ch1与vl-cl、vh与vl、ch3与cl以及ch3与ch1，如在国际专利公布wo2009/080254、wo2009/080251、wo2009/018386和wo2009/080252中有所描述。还可使用其他策略，诸如通过在一个ch3表面取代带正电荷的残基并在另一ch3表面取代带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化来产生双特异性抗体，如美国专利公布us2010/0015133；美国专利公布us2009/0182127；美国专利公布us2010/028637或美国专利公布us2011/0123532中所描述。在其他策略中，可通过下面的取代(表示为第一重链的第一ch3域中的修饰位置/第二重链的第二ch3域中的修饰位置)促进异源二聚化：l351y_f405a_y407v/t394w、t366i_k392m_t394w/f405a_y407v、t366l_k392m_t394w/f405a_y407v、l351y_y407a/t366a_k409f、l351y_y407a/t366v_k409f、y407a/t366a_k409f、或t350v_l351y_f405a_y407v/t350v_t366l_k392l_t394w，如美国专利公布us2012/0149876或美国专利公布us2013/0195849中所描述。luz-y技术可用于产生双特异性抗体。在该技术中，将亮氨酸拉链加入ch3域的c末端，以驱动由亲本单克隆抗体装配异源二聚体，该亲本单克隆抗体经后纯化移除，如wranik等人(2012)jbiolchem287:43331-9)中有所描述。seedbody技术可用于产生双特异性抗体。seedbodies在其恒定域中具有所选择的经iga残基取代的igg残基，以促进异源二聚化，如在美国专利us20070287170中有所描述。双特异性抗体可在体外无细胞环境中通过下列方式产生：在两种单特异性同源二聚抗体的ch3区中引入不对称突变，并在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而允许二硫键异构化，这是根据国际专利wo2011/131746(duobodytechnology)中所述的方法。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在ch3域处具有促进异源二聚体稳定性的某些取代；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-mea)、二硫苏糖醇(dtt)、二硫赤藓糖醇(dte)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(tcep)、l-半胱氨酸和β-巯基乙醇。例如，可使用如下条件：在至少25mm2-mea的存在下或至少0.5mm二硫苏糖醇的存在下，在5-8的ph例如ph7.0或ph7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。抗体域和编号是众所周知的。“不对称”是指抗体中两个分开的重链中的两个ch3域中的不同取代。igg1ch3区通常由igg1上的残基341-446组成(残基根据eu索引进行编号)。本发明的抗体可被工程化为各种众所周知的抗体形式。药物组合物/施用本发明提供包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的药物组合物。就治疗性用途而言，可将本发明的抗体制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗体作为药学可接受的载体中的活性成分。“载体”是指本发明抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体的浓度可从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15或20％改变，且可根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，troy,d.b.编辑，lipincottwilliamsandwilkins,philadelphia,pa2006，第5部分，pharmaceuticalmanufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。用于本发明的抗体的治疗性用途的施用模式可以是将抗体递送至宿主的任何合适途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部，经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)，使用片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒形式的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或技术人员所理解的本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：瘤内、胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。本发明的抗体可通过任何合适的途径施用给受试者，例如通过静脉内(i.v.)输注或弹丸式注射以非肠道方式、以肌肉内方式或皮下方式或腹膜内方式。可在例如15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟或240分钟内，或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时内给予静脉内输注。向受试者给予的剂量足以缓解或至少部分地遏止正在治疗的疾病(“治疗有效量”)，并且有时可为0.005mg/kg至约100mg/kg，例如约0.05mg/kg至约30mg/kg，或约5mg/kg至约25mg/kg，或约4mg/kg，约8mg/kg，约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg，但可甚至更高，例如约15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。也可以给予固定的单位剂量，例如50mg、100mg、200mg、500mg或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500mg/m2、400mg/m2、300mg/m2、250mg/m2、200mg/m2或100mg/m2。通常可施用介于1和8次之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8次)的剂量来治疗患者，但可给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次的剂量。可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用本发明抗体。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。例如，本文所述的本发明抗体可通过静脉内输注以8mg/kg或以16mg/kg按一周的时间间隔施用8周，接着以8mg/kg或以16mg/kg按每两周一次的方式再施用16周，然后以8mg/kg或以16mg/kg按每四周一次的方式施用。例如，本发明的方法中的抗体可在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一者，或者另选地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一者，或它们的任何组合，使用单次剂量或者每24、12、8、6、4或2小时一次的分次剂量或它们的任何组合，以约0.1-100mg/kg的量作为日剂量提供，诸如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天。本发明的方法中的抗体也可预防性地施用，以降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发生开始和/或在癌症缓解后降低复发的风险。可将本发明的抗体低压冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。方法和用途本发明的抗体具有在体外和体内进行诊断，以及治疗和预防的用途。例如，本发明的抗体可被施用于体外或离体培养的细胞，或者待治疗的受试者，预防和/或诊断各种疾病，诸如癌症和感染性疾病。本发明还提供增强受试者中抗tnfr超家族成员的激动活性的方法，包括将e345r突变、e430g突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y突变引入所述抗体中以产生特异性结合tnfr家族受体的工程化抗体，并将所述工程化抗体施用给所述受试者持续足以增强激动活性的时间。本发明还提供增强受试者中抗tnfr超家族成员抗体的激动活性的方法，包括将e345r突变、e430g突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y突变引入所述抗体中以产生特异性结合tnfr家族受体的工程化抗体，并将所述工程化抗体施用给所述受试者。本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用特异性结合tnfr家族受体的抗体持续足以治疗所述癌症的时间，所述抗体包含e345r突变、e430g突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y。本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用包含e345r突变、e345r/e430g突变或e345r/e430g/s440y的抗tnfr超家族抗体持续足以治疗所述癌症的时间。在本发明的方法中，抗体介导adcc。在本发明的方法中，抗体介导adcp。在本发明的方法中，抗体增强抗tnfr超家族成员的激动活性，而与抗体交联无关。在本发明的方法中，抗体任选地还包含减少adcc的第二突变。在本发明的方法中，受试者具有病毒感染。在本发明的方法中，受试者具有癌症。在本发明的方法中，癌症为实体瘤。在本发明的方法中，所述实体瘤是黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌(nsclc)、非鳞状nsclc、结直肠癌、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、胃部癌症、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌、或癌症的转移性病变。在本发明的方法中，tnfr为肿瘤坏死因子受体1(seqidno:1)、肿瘤坏死因子受体2(seqidno:2)、淋巴毒素β受体(seqidno:3)、ox40(seqidno:4)、cd40(seqidno:5)、fas受体(seqidno:6)、诱饵受体3(seqidno:7)、cd27(seqidno:8)、cd30(seqidno:9)、cd137(seqidno:10)、死亡受体4(seqidno:11)、死亡受体5(seqidno:12)、诱饵受体1(seqidno:13)、诱饵受体2(seqidno:14)、rank(seqidno:15)、骨保护素(seqidno:16)、tweak受体(seqidno:17)、taci(seqidno:18)、baff受体(seqidno:19)、疱疹病毒进入介质(seqidno:20)、神经生长因子受体(seqidno:21)、b细胞成熟抗原(seqidno:22)、gitr(seqidno)：23)、troy(seqidno:24)、死亡受体6(seqidno:25)，死亡受体3(seqidno:26)或外异蛋白a2受体(seqidno:27)。在本发明的方法中，tnfr为ox40(seqidno:4)、cd27(seqidno:8)、cd40(seqidno:5)、cd137(seqidno:10)或gitr(seqidno:23)。在本发明的方法中，tnfr为ox40(seqidno:4)。在本发明的方法中，tnfr为cd27(seqidno:8)。在本发明的方法中，tnfr为cd40(seqidno:5)。在本发明的方法中，tnfr为cd137(seqidno:10)。在本发明的方法中，tnfr为gitr(seqidno:23)。许多tnfr超家族成员及其配体已被作为癌症治疗的靶，包括tnfr1/2/tnf-α、cd70/cd27/cd27、cd137/4-1bb、ox40/ox40l、cd40/cd40l、gitr/gitrl(bremer,hindawipublishincorporationisrnoncologyvolume2013,articleid371854，第25页；sanmamed等人)和几种靶向tnfr超家族成员的激动性抗体，如抗cd40、抗ox-40、抗gitr、抗cd27、抗cd137抗体正在临床开发用于各种实体瘤、以及血红素恶性肿瘤，如非霍奇氏淋巴瘤和b细胞恶性肿瘤。可以预期本发明的抗-cd40、抗-ox40、抗-gitr、抗-cd27、抗-cd137和其他抗tnfr超家族成员抗体在其增强的激动活性方面具有改善的性质，任选地与效应子功能性结合，在治疗各种癌症(包括实体瘤)中将具有治疗效果。虽然已经概括地描述了本发明，但是本发明的实施方案还将在以下实施例中进一步公开，以下实施例不应理解为限制权利要求的范围。实施例1：改善抗tnfr超家族成员抗体的激动活性的fc工程化方法针对属于肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的免疫刺激受体的激动性抗体正在成为癌症免疫疗法的有希望的候选药物。最近发现了几种通过增强其激动活性和/或效应功能来增强抗tnfr抗体的抗肿瘤活性的fc工程化方法。刺激抗肿瘤免疫的单克隆抗体正在成为一类重要的癌症治疗剂(mellman等人(2011)nature480:480-9；chen等人(2013)natrevimmunol13:227-42)。靶向免疫检查点受体ctla-4和pd-1的抗体已被批准作为晚期黑色素瘤、肺癌的单药疗法并针对其他类型的人类癌症的治疗进行评估。除了靶向抑制途径外，针对t细胞和抗原呈递细胞上的免疫刺激受体的激动剂抗体也可以刺激抗肿瘤免疫，并且正在成为癌症免疫疗法临床开发的有希望的领域(schaer等人(2014)jimmunothercancer2:7)。许多免疫刺激受体属于肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族。其中，ox40、cd27、4-1bb和gitr在效应t细胞上表达，并且它们的配体和激动剂抗体可以激活这些受体以刺激t细胞的增殖和活化(kanamaru等人(2004)jimmunol172:7306-14；gramaglia等人(1998)jimmunol161:6510-7；pollok等人(1993)jimmunol150:771-81；ramakrishna等人(2015)jimmunothercancer3:37)。cd40在抗原呈递细胞上表达，并且该受体的活化促进肿瘤抗原更有效地呈递给活化的t细胞(mangsbo等人(2015)clincancerres21:1115-26)。许多证据表明治疗性抗体对这些tnf受体的激动活性对于它们的抗肿瘤活性是重要的(mangsbo等人(2015)clincancerres21:1115-26；he等人(2013)jimmunol191:4174-83；wilson等人(2011)cancercell19:101-13)。另一方面，几种tnfr超家族成员，诸如ox40和gitr，在调节性t细胞(treg)上具有升高的表达，其负调节肿瘤免疫。若干研究表明，抗ox40和抗gitr抗体可以通过抗体的效应子功能促进肿瘤微环境中调节性t细胞的选择性消除(bulliard等人(2013)jexpmed210:1685-93；bulliard等人(2014)immunolcellbiol92:475-80)。对于治疗性抗ox40和抗gitr抗体的抗肿瘤活性，此类抗体介导的调节性t细胞的杀伤可能比抗体介导的效应t细胞活化更重要。越来越多的证据表明免疫调节抗体因其激动活性和效应功能与其不同类型的fc受体接合。为了激活下游信号传导路径，需要tnfr三聚化。然而，一种抗体分子通常不足以聚集足够的tnf受体；相反，抗体交联对于体外测定中的受体激活是必需的(morris等人(2007)molimmunol44:3112-21。最近在小鼠中的研究表明，与抑制性fcγriib受体的接合对于抗体与许多tnfr靶的激动活性是关键的，所述tnfr靶包括cd40(li等人(2011)science333:1030-4；white等人(2013)cancerimmunolimmunother62:941-8)、死亡受体5(dr5)(wilson等人(2011)cancercell19:101-13；li等人(2012)procnatlacadsciusa109:10966-71)和cd95(xu等人(2003)jimmunol171:562-8)。iggfc与fcγriib受体的交联可以使一个以上的抗体分子多聚，这反过来可以促进足够的tnfr聚集用于信号传导路径激活。另一方面，抗体效应功能，如adcc和adcp，取决于与各种激活fcγ受体的相互作用。小鼠研究表明激活fcγ受体通过选择性消除肿瘤内调节性t细胞有助于免疫调节性抗ox40和抗gitr抗体的抗肿瘤活性(bulliard等人(2013)jexpmed210:1685-93；(bulliard等人(2014)immunolcellbiol92:475-80)。除了fcγri之外，人igg抗体对大多数人fc受体具有差的结合亲和力(guilliams等人(2014)natrevimmunol14:94-108)。为了优化激动剂抗体对免疫刺激性tnf受体的抗肿瘤活性，一种方法是工程化igg抗体的fc区以改善其fcγ受体接合，特别是与fcγriib受体的接合，该受体介导tnf受体抗体的激动作用。在这方面，chu等人描述了具有增强的fcγriib结合亲和力的igg1fc中的s267e/l328f突变(chu等人(2008)molimmunol45:3926-33。用此类突变工程化的抗cd19抗体显示出对b细胞受体介导的原代人活化的抑制的改善。然而，进一步的研究表明，此类fc变体还具有增强的与活化fcγriia受体的r131同种异型的结合(mimoto等人(2013)proteinengdessel26:589-98。最近，mimoto等人报道了igg1fc中的六个突变的集合，统称为v12突变，具有选择性增强的fcγriib结合而不伴随与fcγriia受体的h131或r131同种异型的结合增加(mimoto等人(2013)proteinengdessel26:589-98。具有工程化v12突变的抗cd137激动性抗体显示出依赖于fcγriib接合的大大增强的激动活性。虽然优化fcγriib接合是可行的方法，但是此类工程化抗体的激动活性在很大程度上取决于局部微环境中的fcγ受体表达，并且此类抗体的功效可能限于解剖学作用位点。为了增强免疫刺激性抗体的激动作用而不依赖于fcγ受体接合，white等人最近报道了人igg2可以赋予针对cd40、4-1bb和cd28受体的免疫刺激性抗体超强激动活性(white等人(2015)cancercell27:138-48)。该活性由igg2亚型铰链区中二硫键的独特构型赋予，并且不依赖于fcγriib接合。另一方面，如果与fcγriib交联的目的仅仅是为了增加激动性抗体的聚集用于受体激活，那么我们假设那些可以促进抗体多聚化的fc突变可以增强抗体对tnf受体的激动作用而不需要fcγriib交联。diebolder等人报道了选择性fc突变可以在结合细胞表面上的靶标时促进igg抗体形成六聚体(diebolder等人(2014)science343:1260-3)。虽然据报道，此类igg六聚体可以极大地激活补体依赖性细胞毒性(cdc)，但我们提出了另一种应用的主张，即识别tnf受体的寡聚化抗体可以通过促进受体聚集来激活此类受体。该工作描述了不同fc工程化方法对增强抗ox40抗体的激动作用的评估。此外，还评估了fc突变对工程化抗体的adcc和adcp效应子功能的影响。此类研究可能有助于指导具有改善的抗肿瘤活性的针对ox40和其他tnf受体的工程化抗体设计。实施例2：材料和方法抗ox40抗体的fc工程化将抗ox40抗体sf2的vh和vl区(vh：seqidno:51、vl：seqidno:52)克隆到人野生型igg1或igg2上，并且将选择的取代工程化到fc上，以评估取代对抗体的激动活性和效应子功能的影响。所产生的抗体的名称及其fc取代示于表3中。表3.seqidno:63具有e345r突变的igg1astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprrpqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseqidno:64具有e430g突变的igg1astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhgalhnhytqkslslspgkseqidno:65具有e345r/e430g突变的igg1astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprrpqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhgalhnhytqkslslspgkseqidno:66具有e345r/e430g/s440y突变的igg1astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprrpqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhgalhnhytqkylslspgkseqidno:67具有e345r突变的igg2σastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappaaassvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsaedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprrpqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk抗体的表达和纯化按照转染试剂盒说明书(lifetechnologies)，将编码抗体重链(hc)和轻链(lc)的质粒以1:3(hc:lc)摩尔比共转染到expi293f细胞中。转染后5天将细胞离心，并将上清液通过0.2μm过滤器。使用octet(fortebio)定量抗体表达的滴度。按照试剂盒说明书(gehealthcarelifesciences)，使用预装蛋白a旋转柱进行抗体纯化。通过透析将纯化的抗体缓冲液交换到ph7.2的dpbs中，并通过280nm处的uv吸光度测定蛋白质浓度。通过还原和非还原样品的高效大小排阻色谱(hp-sec)和sds-page评估分子的质量和完整性。nanobret蛋白质-蛋白质相互作用测定将抗ox40sf2抗体轻链的编码序列分别与c-末端nanoluc和halotag序列一起框内克隆到pnlf-c和phtchalotag载体(promega，madison，wi)中。这些轻链与ox40sf2igg1、ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg1e345r/e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y抗体的重链配对，以表达具有附接在轻链的c-末端的nanoluc或halotag的fc工程化的sf2抗体。使用标准蛋白a旋转柱纯化这些修饰的抗体。为了通过nanobret蛋白质-蛋白质相互作用测定(promega，madison，wi)研究细胞表面上的抗体多聚化，将0.25×105个hek-blue：ox40细胞接种在96孔测定板的每个孔中并在37℃下培养过夜。第二天，将50μl测定培养基(opti-memi还原的血清培养基，无酚红加4％fbs)中等浓度的nanoluc标记的抗体(供体)和halotag标记的抗体(受体)应用于细胞。在实验孔中加入在50μl测定培养基中1:1000稀释的halotag618配体，并通过在测定培养基中稀释dmso1:1000来建立无配体对照孔。在37℃温育30分钟后，用测定培养基洗涤细胞两次，并重悬于100μl测定培养基中。在每个孔中加入25μl在不含fbs的测定培养基中以1:200稀释的nano-glo底物。摇动30秒后，通过envision测量供体发射(460nm)和受体发射(618nm)。将具有millibret单位(mbu)的原始nanobret比值计算为rawbret＝618nmem/460nmem*1000。为了考虑供体贡献的背景或渗透，校正的具有millibret单位的nanobret比值计算为correctedbret＝rawbret实验样品–rawbret无配体对照样品，其反映了由于蛋白质-蛋白质相互作用从生物发光蛋白供体到荧光蛋白受体的能量转移。流式细胞术染色将表达编码人fcγri(nm_000566)(seqidno:59)、fcγriia(nm_021642)(seqidno:60)、fcγriib(nm_004001)(seqidno:61)、和fcγriiia(nm_000569)(seqidno:62)的cdna的质粒(origene)通过expifectmine293转染试剂盒(lifetechnologies)瞬时转染到expi293f细胞中。转染后48小时进行流式细胞术测定。为了证实转染的fc受体的表达，使用它们的特异性抗体、针对fcγri的10.1(bdpharmingen)、针对fcγriia的iv.3(stemcelltechnologies)、针对fcγriib的2b6(内部制备)(veri等人(2007)immunology121:392-404)和针对fcγriiia的3g8(bdpharmingen)于流式细胞术染色中作为阳性对照。raji细胞(atcc：ccl-86)也用于测试抗ox40抗体与fcγriib受体的结合。将每孔2×105个细胞接种在96孔板中，并在4℃下在bsa染色缓冲液(bdbiosciences，sanjose，usa)中阻断30分钟。将细胞与测试抗体在冰上在4℃下温育1.5小时。用bsa染色缓冲液洗涤两次后，将细胞与r-pe标记的抗人或抗小鼠igg二抗(jacksonimmunoresearchlaboratories)在4℃下温育45分钟。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于150μl含有1:200稀释的draq7活/死染色剂的染色缓冲液(cellsignalingtechnology，danvers，usa)。通过miltenyimacsquant流式细胞仪(miltenyibiotec，auburn，usa)分别使用b2和b4通道检测染色细胞的pe和draq7信号。在draq7排除上对活细胞进行门控，并确定收集的至少10,000个活体事件的几何平均荧光信号。使用flowjo软件(treestar)进行分析。将数据绘制为抗体浓度的对数对平均荧光信号。通过graphpadprism6(graphpadsoftware,inc.)进行非线性回归分析，并计算ec50值。seqidno:59mwflttlllwvpvdgqvdttkavitlqppwvsvfqeetvtlhcevlhlpgssstqwflngtatqtstpsyritsasvndsgeyrcqrglsgrsdpiqleihrgwlllqvssrvftegeplalrchawkdklvynvlyyrngkafkffhwnsnltilktnishngtyhcsgmgkhrytsagisvtvkelfpapvlnasvtspllegnlvtlscetklllqrpglqlyfsfymgsktlrgrntsseyqiltarredsglywceaatedgnvlkrspelelqvlglqlptpvwfhvlfylavgimflvntvlwvtirkelkrkkkwdleisldsghekkvisslqedrhleeelkcqeqkeeqlqegvhrkepqgatseqidno:60mtmetqmsqnvcprnlwllqpltvllllasadsqaappkavlkleppwinvlqedsvtltcqgarspesdsiqwfhngnlipthtqpsyrfkannndsgeytcqtgqtslsdpvhltvlsewlvlqtphlefqegetimlrchswkdkplvkvtffqngksqkfshldptfsipqanhshsgdyhctgnigytlfsskpvtitvqvpsmgssspmgiivavviatavaaivaavvaliycrkkrisanstdpvkaaqfeppgrqmiairkrqleetnndyetadggymtlnpraptdddkniyltlppndhvnsnnseqidno:61mgilsflpvlatesdwadckspqpwghmllwtavlflapvagtpaappkavlklepqwinvlqedsvtltcrgthspesdsiqwfhngnlipthtqpsyrfkannndsgeytcqtgqtslsdpvhltvlsewlvlqtphlefqegetivlrchswkdkplvkvtffqngkskkfsrsdpnfsipqanhshsgdyhctgnigytlysskpvtitvqapssspmgiivavvtgiavaaivaavvaliycrkkrisalpgypecremgetlpekpanptnpdeadkvgaentitysllmhpdaleepddqnriseqidno:62maegtlwqilcvssdaqpqtfegvkgadpptlppgsflpgpvlwwgslarlqteksdevsrkgnwwvtemgggagerlftssclvglvplglrislvtcplqcgimwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqwfhneslissqassyfidaatvddsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfkeedpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsgsyfcrglfgsknvssetvnititqglavstissffppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktnirsstrdwkdhkfkwrkdpqdkhek-bluenfkb报告基因测定通过将ox40表达质粒(puno1-hox40)转染到hek-bluetmnull1细胞中来建立表达人ox40的稳定hek-blue报告基因细胞系(hek-blue：ox40)，所述hek-bluetmnull1细胞经工程化以在nf-κb诱导型启动子(ifn-β最小启动子)的控制下表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)报告基因。对于报告基因测定，将重悬于200μl培养基中的1×105个hek-blue：ox40细胞等分到96孔测定板的每个孔中，并加入ox40配体或抗ox40抗体。为了测试交联效果，在相同的测定孔中加入1μl蛋白g磁珠(pierce)或1x105个raji细胞。在37℃温育过夜后，通过使用quanti-blue检测试剂盒(invivogen)定量诱导的分泌碱性磷酸酶(seap)报告基因表达来评估抗体的激动活性。简而言之，将40μl细胞培养上清液与160μlquanti-blue试剂混合，并在37℃温育直至显出适当的蓝色。使用spectramax酶标仪(moleculardevices，sunnyvale，ca)测量650nm处的od。将抗ox40抗体的激动活性标准化为相对于1μg/mlox40配体诱导的活性的活性百分比。adcc测定按照制造商(promega)的指示，通过adcc报告基因生物测定评估抗ox40抗体的adcc活性。简言之，将接种在96孔板中过夜的25,000个hek-blue：ox40细胞/孔与工程化效应细胞混合，其中fcγriiia受体的活化导致荧光素酶报告基因的表达。将抗ox40抗体加入细胞中并在37℃下温育6小时。然后加入bio-glo荧光素酶试剂并通过envision定量荧光素酶信号。抗ox40抗体的adcc活性表示为相对于没有添加测试抗体的荧光素酶信号激活的倍数。adcp测定通过用turbogfp转导粒子(sigmaaldrich)感染hek-blue：ox40细胞建立表达gfp的ox40靶细胞系。用嘌呤霉素选择稳定的表达gfp的细胞。使用无需cd16耗尽的阴性人单核细胞富集试剂盒(stemcelltechnologies)从pbmc(biologicsspecialty)分离人cd14+cd16+单核细胞。将分离的单核细胞接种在含有10％fbs的x-vivo-10培养基(lonza)中，并通过加入25ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(r&dsystems)将巨噬细胞从单核细胞分化7天。加入ifnγ(50ng/ml；r&dsystems)进行最后24小时的分化。对于adcp测定，将1×105个细胞/孔的分化的巨噬细胞与0.25×105个细胞/孔的表达gfp的hek-blue：ox40细胞(4:1比例)在96孔u型底板中的200μl培养基(dmem+10％fbs)中混合。加入测试抗体，并将板在37℃培养箱中温育24小时。然后使用accutase(sigma)分离细胞并重悬于bsa染色缓冲液中。巨噬细胞用偶联于alexafluor647(invitrogen)的抗cd11b和抗cd14抗体(bdbiosciences)染色。使用miltenyimacsquant流式细胞仪(miltenyibiotec，auburn，usa)通过流式细胞术鉴定gfp阳性hek-blue：ox40靶细胞和alexa647阳性巨噬细胞。使用flowjo软件(treestar)分析数据，并通过使用以下等式测量gfp荧光的减少来确定adcp介导的细胞杀伤:杀死的靶细胞的百分比＝((利用最低浓度抗体的gfp+、cd11b-、cd14-细胞的百分比)-(利用测试浓度抗体的gfp+、cd11b-、cd14-细胞的百分比))/(利用最低浓度抗体的gfp+、cd11b-、cd14-细胞的百分比)×100。cdc测定通过补体介导的细胞杀伤测定评估抗ox40抗体的cdc活性。简而言之，将1×105个hek-blue：ox40细胞与6.7％(v/v)兔补体(cedarlanelabs，burlington，canada)和测试抗体一起温育1小时。根据制造商的说明书(rochediagnostics，indianapolis，in)，通过细胞毒性检测试剂盒测量从裂解的hek-blue：ox40细胞的胞质溶胶释放到上清液中的乳酸脱氢酶活性。补体介导的细胞毒性表示为相对于0.67％(v/v)tritonx-100裂解的细胞毒性的细胞毒性百分比。实施例3：用于评估抗ox40抗体的激动作用的nfκb报告基因测定的建立ox40是tnf受体超家族的成员，通过与tnf受体相关因子(traf)结合而激活核因子κb(nfkb)信号传导路径。为了研究fc工程化对ox40抗体的激动活性的贡献，建立了在nfκb诱导型启动子下稳定表达人ox40和seap的hek-bluetm报告基因细胞系。ox40配体剂量依赖性地激活转染的ox40受体，其导致seap报告基因表达(图1a)。然后通过该报告基因测定评估ox40sf2igg1抗体的激动活性。虽然单独的抗体显示出很少的激动活性，但固定在蛋白g珠上的ox40sf2igg1抗体可以剂量依赖性方式刺激报告基因表达，并且在1000ng/ml时比ox40配体更好地表达到某一水平(图1a)，表明抗体交联是激动活动所需要的。最近的研究表明fcγriib可以提供交联活性并促进tnf受体抗体的激动活性(li等人(2012)cellcycle11:3343-4)。在报告基因测定中通过共培养hek-blue：ox40细胞与人b淋巴母细胞样raji细胞评估fcγriib交联作用，在raji细胞上主要表达fcγriib(rankin等人(2006)blood108:2384-91)。然而，与raji细胞的共培养未能显著增强sf2抗体与天然igg1的激动活性(图1b)。实施例4：具有s267e/l328f和v12突变的抗ox40抗体的表征已经鉴定抗体fc中的s267e/l328f突变和e233d/g237d/p238d/h268d/p271g/a330r突变(本文中称为v12突变)增强抗体与fcγriib受体的结合。为了评估此类突变对抗ox40抗体的影响，将抗ox-40抗体sf2克隆为具有s267e/l328f双突变(ox40sf2igg1s267e/l328f)和v12突变(ox40sf2igg1v12)的igg1。与fcγr结合通过流式细胞术评估工程化抗体与瞬时转染的expi293f细胞上表达的各种fcγr的结合。对于fcγriib，虽然具有天然igg1的ox40sf2抗体具有差的结合时，但是工程化的fc突变有效地促进抗ox40抗体，其具有以与2b6(431ng/ml)相当并且比ox40sf2igg1的抗体好得多的ec50(对于ox40sf2igg1s267e/l328f为459ng/ml，和对于ox40sf2igg1v12为502ng/ml)与fcγriib的增加的结合亲和力，所述2b6为优先识别fcγriib的抗体(图2a)。进行类似的流式细胞术测定以评估工程化抗ox40抗体与瞬时转染的expi293f细胞上表达的fcγriia的r131同种异型的结合。虽然ox40sf2igg1v12与ox40sf2igg1类似地显示与fcγriia的结合不良，但s267e/l328f突变促进更有效的结合fcγriiar131(ec50：216ng/ml)，效力提高20倍(图2b)。该数据与先前的发现结果一致，即s267e/l328f和v12突变促进增强的fcγriib结合，而v12突变的作用更具特异性。对于fcγri，ox40sf2igg1显示出以326ng/ml的ec50的高亲和力(图2c)。ox40sf2igg1s267e/l328f抗体显示出与ox40sf2igg1相似的结合特性，然而，v12突变显著消除了ox40sf2igg1v12抗体与fcγri的结合。还通过流式细胞术测定评估了工程化抗ox40抗体与fcγriiia受体的结合。虽然ox40sf2igg1抗体显示出以744ng/ml的ec50与fcγriiia结合，但ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12未显示对fcγriiia的结合活性(图2d)。激动作用由于s267e/l328f和v12突变促进ox40sf2igg1抗体对fcγriib的结合亲和力增加，因此通过hek-bluenfκb报告基因测定评估这些增强的结合是否可以导致抗ox40抗体的激动作用增加。首先，通过流式细胞术测定评估工程化抗ox40抗体与raji细胞的结合。ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12，但不是ox40sf2igg1，显示出与raji细胞的剂量依赖性结合(图3a)，尽管与用fcγriib受体转染的expi293f细胞(图2a)相比具有较低的效力。为了证实与raji细胞的结合是由fcγriib介导的，在评估工程化抗ox40抗体与raji细胞的结合之前，用5μg/ml的2b6抗体预处理raji细胞。观察到2b6抗体对raji细胞上fcγriib的预阻断显著消除了ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12与raji细胞的结合(图3b)。在hek-bluetmnfκb报告基因测定中，在不存在raji细胞的情况下，ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12均未显示出显著的激动活性。然而，利用共培养的raji细胞和hek-blue：ox40细胞，这些工程化的抗ox40抗体显示出显著增加的激动作用，与相同浓度的ox40配体相比，在1000ng/ml时效力超过两倍(图3c和图3d)。此外，当加入2b6抗体以预阻断raji细胞上的fcγriib时，显著消除了对ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12抗体的激动作用的raji细胞依赖性增强(图3c和图3d)，这意味着工程化抗体的激动活性由fcγriib交联介导。fc效应子功能通过报告基因生物测定研究了具有s267e/l328f和v12突变的抗ox40抗体的adcc活性，其中效应细胞中的生物发光报告基因表达反映了fcγriiia介导的adcc活化。当hek-blue：ox40靶细胞与表达fcγriiia的效应细胞共培养时，ox40sf2igg1剂量依赖性地激活报告基因表达。然而，ox40sf2igg1s267e/l328f和ox40sf2igg1v12均未诱导报告基因表达(图4a)，表明s267e/l328f和v12突变消除了ox40sf2igg1抗体的adcc活性。该结果与工程化抗体对fcγriiia的结合活性的丧失(图2d)一致。还在评估由分离的单核细胞分化的巨噬细胞对表达gfp的hek-blue：ox40细胞的吞噬作用的测定中研究了具有s267e/l328f和v12突变的抗ox40抗体的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)活性。ox40sf2igg1抗体剂量依赖性地介导巨噬细胞对hek-blue：ox40靶细胞的杀伤。s267e/l328f和v12突变均未显著改变ox40sf2igg1抗体的adcp活性(图4b)。通过流式细胞术测定评估工程化抗ox40抗体与分化的巨噬细胞的结合。尽管ox40sf2igg1s267e/l328f抗体与ox40sf2igg1抗体具有相似的与巨噬细胞的结合亲和力，但ox40sf2igg1v12抗体虽然在adcp测定中具有活性，但具有显著降低的与巨噬细胞的结合(图4c)。在兔补体存在下评估裂解hek-blue：ox40细胞的测定中研究抗体介导的cdc。高达10,000ng/ml下ox40sf2igg1抗体不会导致对hek-blue：ox40靶细胞的显著cdc活性。同样地，相对于具有天然人igg1fc域的抗体，v12和s267e/l328f突变都不促进更高的cdc活性(图4d)。实施例5：具有单一或组合e345r、e430g和s440y突变的抗ox40抗体的表征diebolder等人鉴定了一组fc突变(e345r、e430g和s440y)，其在与细胞表面抗原结合时诱导igg1抗体的六聚化，并且增强抗体效应子功能adcc和cdc(diebolder等人(2014)science343:1260-3)。假设此类多聚化抗体可以通过促进tnfr超家族成员的聚集来增强抗tnfr超家族抗体的激动作用，这是受体激活的先决条件。为了验证该假设，单个e345r、e430g和s440y突变或组合突变在抗ox40抗体sf2上对igg1进行工程化，并且得到的抗体ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg1e430g、ox40sf2igg1e345r/e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y如表3所示进行了表征。抗体多聚化sec分析显示ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg1e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g抗体作为单体存在于溶液中，就像ox40sf2igg1一样。然而，sec分析显示三重突变抗体ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y的～900kda峰，表明存在该抗体的六聚体。该观察结果与报道的发现e345r/e430g/s440y突变在溶液相中容易促进六聚体形成(diebolder等人(2014)science343:1260-3)一致。为了评估工程化抗体是否在细胞表面结合抗原时多聚化，进行了nanobrettm蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)测定。该测定是基于邻近的测定，其通过测量从生物发光蛋白供体到荧光蛋白受体的能量转移来检测蛋白质-蛋白质相互作用。产生的抗体ox40sf2igg1e345r、ox40sf2igg1e430g、ox40sf2igg1e345r/e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y进一步被工程化以分别具有作为供体和受体的抗体轻链的c-末端附接的荧光素酶或荧光标记的标记的抗体在hek-bluenfκb报告基因测定中显示出与相应的未标记抗体相当的功能活性(数据未显示)。通过将供体和受体抗体应用于hek-blue：ox40细胞进行nanobretppi测定并且计算的校正的nanobret比率反映多聚化抗体的结合。虽然ox40sf2igg1抗体显示出背景校正的nanobret比率，但具有促进igg六聚化的突变的sf2抗体在跨10至1000ng/ml的浓度下显示出更高许多的校正的nanobret比率(图5)。通过校正的nanobret比值反映的细胞表面的抗体缔合程度按以下顺序：ox40sf2igg1e345r/e430g>ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y>ox40sf2igg1e345r>ox40sf2igg1e430g>ox40sf2igg1。结果表明除了野生型igg1外，所有抗体都在细胞表面多聚化，尽管其缔合程度不同。工程化的抗ox40抗体的改善的激动作用与fcγriib交联无关在hek-bluetmnfκb报告基因测定中表征工程化抗体以评估e345r、e430g和s440y取代对抗体激动活性的影响。所有生成的抗体都表现出激动活性。与ox40配体的活性(图6a)相比，ox40sf2igg1e345r表现出最多改善的激动活性，尽管该抗体不具有最高程度的多聚化(图5)。ox40sf2igg1e430g表现出最低改善的激动活性，而ox40sf2igg1e345r/e430g和ox40sf2igg1e345r/e430g/s440y表现出ox40sf2igg1e345r和ox40sf2igg1e430g之间的激动作用程度(图6a)。e345是igg亚型之间的保守残基。e345r突变也在具有沉默igg2σfc的抗ox40抗体上工程化，产生抗体ox40sf2igg2σe345r。hek-bluetmnfκb报告基因测定显示，虽然ox40sf2igg2σ具有很少的激动活性(图6c)，但ox40sf2igg2σe345r显示出以剂量依赖性方式的激动作用(图6d)。这表明e345r突变可以促进跨多种igg亚型的激动作用增强。fcγriib交联进一步增强具有e345r突变的抗ox40抗体的激动作用，该突变取决于igg亚型尽管e345r突变可以促进具有igg1或igg2σfc的抗ox40抗体的激动作用而与fcγriib交联无关，但是仍然通过hek-bluetmnfκb报告基因测定来研究fcγriib交联的影响，其中将工程化抗体应用于与raji细胞共培养的hek-blue：ox40细胞。观察到raji细胞的存在可以进一步增强ox40sf2igg1e345r抗体的激动作用，与没有raji细胞共培养的情况相比，跨测试浓度下的活性增加超过两倍(图6b)。当加入2b6抗体以预阻断raji细胞上的fcγriib受体时，ox40sf2igg1e345r的raji细胞介导的对激动作用被完全消除，其激动活性降低至与没有raji细胞共培养的情况类似的水平，这意味着激动作用的增强由fcγriib交联驱动。设置类似的测定以评估fcγriib交联对具有或不具有e345r突变的ox40sf2igg2σ抗体的激动作用。发现raji细胞的存在未能增强ox40sf2igg2σ或ox40sf2igg2σe345r抗体的激动活性(图6c和图6d)。该数据表明具有e345r突变的抗ox40抗体的raji细胞介导的激动作用的增强取决于igg亚型，对igg1fc具有作用，但对沉默igg2σfc没有影响。具有e345r突变的工程化抗ox40抗体的效应子功能通过fcγriiia介导的adcc报告基因生物测定研究具有e345r突变的抗ox40抗体的adcc活性。e345r突变改善了抗ox40抗体的adcc。与ox40sf2igg1相比，ox40sf2igg1e345r具有改善的adcc(图7a)。相反，ox40sf2igg2σ没有表现出adcc活性，并且在ox40sf2igg2σ上引入e345r突变对adcc没有影响。还通过分化的巨噬细胞对表达gfp的hek-blue：ox40细胞的吞噬作用研究了具有e345r突变的抗ox40抗体的adcp活性。ox40sf2igg1抗体剂量依赖性地介导巨噬细胞对hek-blue：ox40靶细胞的杀伤，而e345r突变的引入仅略微增强ox40sf2igg1抗体的adcp活性(图7b)。相反，虽然ox40sf2igg2σ没有adcp活性，但是将e345r突变引入ox40sf2igg2σ改善了adcp(图7b)。在兔补体存在下评估裂解hek-blue：ox40细胞的测定中研究抗体介导的cdc。尽管ox40sf2igg1抗体不介导对hek-blue：ox40靶细胞的显著cdc活性，但e345r突变剂量依赖性地促进具有更高cdc活性的ox40sf2igg1抗体。相反，ox40sf2igg2σ抗体在该测定中不具有cdc活性，并且ox40sf2igg2σ抗体上的e345r突变不改变其在cdc活性中的沉默(图7c)。讨论针对免疫刺激性tnfr超家族成员的激动性抗体正在成为用于癌症治疗的有希望的药物。最近的fc工程化努力已经针对通过增强它们的激动活性来优化抗tnfr超家族抗体的抗肿瘤免疫力，这通过将取代s267e/l328f和v12引入fc中来优化它们与fcγriib的接合来实现(chu等人(2008)molimmunol45:3926-33；mimoto等人(2013)proteinengdessel26:589-98)。当在本文中应用于抗ox40抗体时，报道的s267e/l328f和v12突变增强了工程化抗ox40抗体与转染的expi293f细胞或raji细胞中表达的fcγriib的结合，并以交联依赖性方式增强了它们的激动活性。s267e/l328f和v12突变的激动作用程度相当。ox40抗体中的s267e/l328f和v12突变破坏抗体与fcγriiia的结合，同时增强与fcγriib的结合，这与mimoto报道的一致(mimoto等人(2013)proteinengdessel26:589-98。因此，s267e/l328f和v12突变完全消除了工程化抗ox40抗体的adcc，其主要由nk细胞上表达的fcγriiia介导。本文还发现，诱导抗肿瘤相关抗原如cd20的抗体六聚化的突变(diebolder等人(2014)science343:1260-3)(e345r、e430g、s440y)诱导抗ox40抗体的激动活性。然而，与针对s267e/l328f和v12突变的报道的相反，改善的激动活性与fcγriib交联无关。虽然具有e345r、e430g和e345r/e430g双突变的抗ox40抗体在溶液中作为单体存在，但它们在结合细胞表面上的ox40时变得多聚化。在不存在表达fcγriib的细胞下，多聚化抗体显示出增强的激动活性，可能是由于ox40在细胞上聚集增加的促进作用。尽管双重e345r/e430g和三重e345r/e430g/s440y突变与单独的单一突变相比，产生了在更高的抗体多聚化，但是单个e345r突变导致具有最高激动活性的抗体。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但认为具有e345r突变的寡聚化抗体在促进ox40受体聚集方面比具有e430g突变的抗体具有更有利的构型。尽管e345r突变与fcγriib交联无关地增强激动作用，但发现表达fcγriib的细胞的存在进一步增强了具有e345r突变的抗体的激动作用。这种激动作用的进一步增强取决于工程化抗体与raji细胞上表达的fcγriib的相互作用，因为在结合fcγr时沉默的iggσ抗体未观察到激动作用的增强，并且通过预阻断在raji细胞上表达的fcγriib消除了激动作用。据报道，与单体中的抗体相比，多聚化抗体对fcγ受体具有更高的亲和力(luo等人(2009)mabs1:491-504)。实际上，本文提供的结果表明，与ox40sf2igg1和ox40sf2igg1e345r抗体(在溶液中作为单体存在)相比，溶液中部分为六聚体形式的ox40sf2e345r/e430g/s440y具有很强与转染的expi293f细胞上表达的fcγriib的结合(数据没有显示)。假设与细胞表面上的ox40结合的寡聚化ox40sf2igg1e345r可以增加与raji细胞上的fcγriib的结合，这继而进一步稳定抗体多聚化并促进受体聚集，其导致激动作用的增强。引入抗ox40抗体的e345r突变增强了抗体的adcc活性的效能。该效果是特异性针对igg1上的工程化抗体，其能够结合fcγriiia，但对于igg2σ上的抗体无特异性，该抗体不结合fcγriiia。这些观察结果表明，igg1抗体的e345r介导的adcc活性增强可能是通过在识别细胞表面上的ox40后fcγriiia与寡聚化抗体的结合增加。相对于具有天然igg1fc的抗ox40抗体，s267e/l328f和v12突变均未显著影响adcp。对于s267e/l328f突变，这可能是出乎意料的，据报道其具有增强的与fcγriia的结合(mimoto等人(2013)proteinengdessel26:589-98)，fcγriia是在介导吞噬作用的巨噬细胞上表达的主要fc受体。然而，除了fcγriia之外，包括fcγri和fcγriiia在内的几种fc受体有助于igg抗体介导的靶细胞的吞噬作用(indik等人(1995)blood86:4389-99)。ox40sf2igg1s267e/l328f抗体证明与fcγri的结合效能与ox40sf2igg1相似，但是消除了与fcγriiia的结合。此外，增强的fcγriia结合程度刚刚达到与其与高亲和力fcγri受体结合相当的水平。结果，ox40sf2igg1s267e/l328f抗体显示出与ox40sf2igg1相似的对巨噬细胞的结合效能，并且相对于ox40sf2igg1它没有显示出增强的adcp活性。相反，ox40sf2igg1v12抗体与fcγri和fcγriiia的结合降低，并且对fcγriia的结合效能未改变，这可能解释其与巨噬细胞的结合显著降低。尽管如此，ox40sf2igg1v12抗体显示出与ox40sf2igg1相似的adcp活性。造成这种差异的原因尚不清楚。类似地，对于具有e345r突变的ox40sf2igg1抗体，未观察到adcp活性的显著增加，尽管此类突变显著增强了工程化抗体的adcc活性。有趣的是，尽管ox40sf2igg2σ不具有adcp活性，但e345r突变赋予该具有沉默fc的抗体显著的adcp活性。在该研究中评估的几种fc工程化方法中的每一种提供了同时增强工程化抗体的激动活性和调节其效应功能的独特性质。根据对adcc的要求，可以设想各种工程化方法用于结合tnfr超家族成员的治疗性抗体。例如，结合cd40和cd27的抗体可受益于改善的激动活性，但最小化adcc以使细胞耗尽的风险最小化。因此，igg1上的s267e/l328f或v12或igg2σ上的e345r可用于产生改善的cd40和cd27抗体。相反，当需要adcc活性以例如消除调节性t细胞时，可以使用igg1上的e345r突变。例如，结合ox40或gitr的抗体可受益于改善的激动活性和增强的adcc。另一个考虑因素是，是否需要依赖于fcγriib交联来增强激动作用。e345r突变可以促进更高的激动作用而与fcγriib交联无关，其可以使抗体具有确定的治疗活性而不管局部微环境中的fcγr表达水平，特别是对于具有低fcγr表达细胞浸润的那些癌症类型有优势。然而，与fcγriib交联无关可以非特异性地刺激激动作用，这可能导致不希望的脱靶效应。在此类情况下，可以使用s267e/l328f或v12突变。在选择最佳工程化方法时，还应考虑其他因素，包括工程化抗体的改变的对不同fc受体的结合活性、免疫原性、pk谱和可开发性。当前第1页12