本发明涉及具有针对血管内皮生长因子(vegf)和促血管生成素(ang)的活性的双特异性抗体以及这类抗体的用途。
背景技术：
血管生成(由现有的脉管系统形成新的血管)是基本上所有器官的形成和生理功能所需的复杂生物过程。它是胚胎发生、正常生理生长、修复和病理过程如肿瘤扩散的重要元素。通常，血管生成受多步骤过程中的血管生成因子和血管生成抑制性因子的局部平衡严格调控，该多步骤过程涉及通过内皮细胞进行的血管芽生、分枝和微管形成(涉及如内皮细胞(ec)的激活、血管稳定性丧失、降解酶的合成和释放、ec迁移、ec增殖、ec组织和分化以及血管成熟等的过程)。
在成年人中，生理血管生成在很大程度上受限于伤口愈合和女性生殖功能的若干组件以及胚胎发育。在包括任何异常、不希望或病理性血管生成的疾病相关血管生成中，血管生成因子与血管生成抑制性因子之间的局部平衡失调，从而导致不适当和/或结构上异常的血管形成。病理性血管生成已经与疾病状态相关，包括糖尿病性视网膜病、银屑病、癌症、类风湿性关节炎、粥样斑、卡波西氏肉瘤和血管瘤(fan等人,1995,trendspharmacology.science.[药物科学趋势]16:57-66；folkman,1995,naturemedicine[自然医学]1:27-31)。在癌症中，大于1-2mm3的原发性肿瘤和继发性肿瘤的生长需要血管生成(folkman,j.newenglandjournalofmedicine[新英格兰医学期刊]1995；33,1757-1763)。
vegf是有效且普遍存在的血管生长因子。在vegf的作用被鉴定为内皮细胞的分泌型促分裂素之前，它被鉴定为血管渗透性因子，从而突出显示vegf的控制内皮细胞行为的许多不同方面(包括增殖、迁移、特异性化和存活)的能力(ruhrberg,2003bioessays[生物学论文集]25:1052-1060)。vegf家族成员包括vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d、vegf-e、胎盘生长因子(pigf)和内分泌腺衍生的vegf(eg-vegf)。vegf的活性形式与其他vegf家族成员合成为同型二聚体或异型二聚体。vegf-a以通过选择性剪接生成的六种同种型存在：vegf121、vegf145、vegf165、vegf183、vegf189和vegf206。这些同种型主要以其生物可利用性而不同，其中vegf165是主要同种型(podar等人2005blood[血液]105(4):1383-1395)。在胚胎发生过程中调控剪接以产生阶段和组织特异性比例的各种同种型产生了内皮细胞的响应于vegf的不同和环境依赖性行为的极大可能性。
据信，vegf是正常和疾病相关血管生成(jakeman等人1993endocrinology[内分泌学]:133,848-859；kolch等人1995breastcancerresearchandtreatment[乳腺癌研究和]:36,139-155)和血管渗透性(connolly等人1989j.biol.chem[生物化学杂志]:264,20017-20024)两者的重要调节剂。由于vegf与抗体的螯合而拮抗vegf作用可以导致肿瘤生长减少(kim等人1993nature[自然]:362,841-844)。vegf基因的杂合破坏导致血管形成的致命缺陷(carmeliet等人1996nature[自然]380:435-439；ferrara等人1996nature[自然]380:439-442)。
除vegf家族之外，还认为促血管生成素参与了血管发育和出生后的血管生成。促血管生成素包括天然存在的激动剂促血管生成素-1(ang-1)以及天然存在的拮抗剂促血管生成素-2(ang-2)。认为ang-1的作用在成人中是保守的，它在成人中广泛地且组成型地表达(hanahan,science[科学],277:48-50(1997)；zagzag等人,expneurology[实验神经病学],159:391-400(1999))。相比之下，ang-2表达主要限于血管重塑的部位，其中认为它阻断ang-1的组成型稳定化或成熟化功能，从而允许血管恢复到可能对芽生信号更具响应性的塑性状态并保持在该塑性状态下(hanahan,1997；holash等人,oncogene[癌基因]18:5356-62(1999)；maisonpierre,1997)。疾病相关血管生成中ang-2表达的研究已经发现许多显示血管ang-2表达的肿瘤类型(maisonpierre等人,science[科学]277:55-60(1997))。功能性研究表明ang-2参与肿瘤血管生成并且将ang-2过表达与小鼠异种移植物模型中的肿瘤生长增加关联起来(ahmad等人,cancerres.[癌症研究],61:1255-1259(2001))。其他研究已经将ang-2过表达与肿瘤血管过多关联起来(etoh等人,cancerres.[癌症研究]61:2145-53(2001)；tanaka等人,cancerres.[癌症研究]62:7124-29(2002))。
使用基于同源的克隆方法，valenzuela等人(procnatlacadsciusa.[美国国家科学院院报]1999mar2；96(5):1904-9)鉴定到2种新型促血管生成素：小鼠中的促血管生成素-3(ang-3)和人类中的促血管生成素-4(ang-4)。虽然与ang-1和ang-2的小鼠和人类形式相比，ang-3和ang-4在结构上更与彼此背离，但是它们似乎代表同一基因座的小鼠和人类相对物。关于促血管生成素家族的这些成员的生物学，知之甚少。例如，ang-4仅在肺中以高水平表达(tsigkos等人,expertopin.investig.drugs[研究性药物的专家评论]12(6):933-941(2003)；valenzuela等人,proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院报]96:1904-1909(1999))。已知ang-4表达水平响应于低氧而增加，并且内皮细胞生长因子在成胶质细胞瘤细胞系和内皮细胞中导致ang-4表达水平增加。然而，表达调控的机制以及所得的对于生理和疾病相关血管生成的影响是未知的(lee等人,fasebj.[美国实验生物学会联合会会志]18:1200-1208(2004)。
促血管生成素首先被发现为在血管内皮内选择性地表达的tie受体酪氨酸激酶家族的配体(yancopoulos等人,nature[自然]407:242-48(2000)。ang-1、ang-2、ang-3和ang-4主要结合tie-2受体，所以也称为tie-2配体。ang-1与tie-2的结合诱导经由自身磷酸化发生的受体的酪氨酸磷酸化以及随后经由信号转导发生的其信号传导通路的激活(maisonpierre,p.等人1997science[科学]:277,55-60)。ang-2是ang-1的通过tie-2受体的ang-1诱导的激酶激活的竞争性抑制起作用的天然存在的拮抗剂(hanahan,1997；davis等人,cell[细胞]87:1161-69(1996)；maisonpierre等人,science[科学]277:55-60(1997))。
tie-2和ang-1的敲除小鼠研究显示相似的表型，并且表明ang-1刺激的tie-2磷酸化介导发育血管的重塑和稳定化，从而在血管生成过程中促进血管成熟并维持内皮细胞支持的细胞粘着(dumont等人,genes&development[基因与发育],8:1897-1909(1994)；sato,nature[自然],376:70-74(1995)；(thurston,g.等人,2000naturemedicine[自然医学]:6,460-463))。
近年来，ang-1、ang-2和/或tie-2已经被提出为可能的抗癌治疗靶(参见，例如，美国专利号6,166,185、5,650,490和5,814,464，各自披露了抗tie-2配体和受体抗体)。使用可溶性tie-2的研究已经报告降低啮齿类动物中的肿瘤的数量和大小。另外，一些小组已经报告结合ang-2的抗体(参见，例如，美国专利号6,166,185和美国专利申请公布号2003/0124129)以及结合vegf-a的抗体(参见，例如，美国专利号8,216,571)的用途。另外，存在靶向vegf-a和ang-2的实例(参见，例如，wo200197850、wo2007089445、和美国专利号8,268,314)。然而，医学领域中存在对于更可耐受或有效的靶向vegf-a和ang-2的双特异性抗体的尚未满足的需要。更具体地，至少因为它涉及与靶向vegf-a相关的毒性(例如，血栓栓塞事件、肾毒性等)，所以存在与改善安全性相关的尚未满足的需要。为此，在此披露的靶向vegf-a和ang-2的双特异性抗体有效减少血管失调和肿瘤生长，同时降低例如与血栓栓塞事件和/或肾毒性相关的毒性。
技术实现要素：
本发明涉及结合vegf和ang的双特异性抗体。本发明进一步涉及结合vegf和ang并且降低vegf和ang的至少一种生物活性的活性的双特异性抗体。本发明还进一步涉及向对其有需要的受试者提供结合vegf和ang并且减少肿瘤生长和/或降低肿瘤体积的双特异性抗体。
附图说明
图1.描绘了五种不同双特异性抗体(bis)主链(bis1、bis2、bis3、bis4和bis5)的通用结构式的示意图。scfv以深灰色描绘，并且iggfv以浅灰色描绘。
图2.描绘了双特异性抗体bis3ab-vegfh1rk-ang-2的示意图表示。
图3.描绘了双特异性抗体bis3ab-vegfh1rk-ang-2的轻链的dna和蛋白质序列。
图4.描绘了双特异性抗体bis3ab-vegfh1rk-ang-2的重链的dna序列。
图5.描绘了双特异性抗体bis3ab-vegfh1rk-ang-2的重链的蛋白质序列。
图6.双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2的洗脱曲线的代表性数据。
图7.双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2的纯化曲线的代表性数据。
图8.双特异性抗体bis3ab-vegfh1rk-ang-2的代表性sds-page凝胶。bsab-完整bis3ab-vegfh1rk-ang-2；ab-抗vegfmab；h-bsab-bis3ab-vegfh1rk-ang-2的重链；h-ab-抗vegfmab的重链；l-bis3ab-vegfh1rk-ang-2和抗vegf的轻链。
图9.双特异性抗体bis3ab-vegfh1rk-ang-2聚集之后的代表性数据。
图10.双特异性抗体bis3ab-vegfh1rk-ang-2的转变温度的代表性数据。
图11.双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2与vegf-165和ang-2的同时结合的代表性数据。
图12.a.使用基于elisa的测定的双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2与vegf-165和ang-2的同时结合的代表性数据。
图12.b.使用基于elisa的测定的双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2与vegf-165和ang-2的同时结合的代表性数据。
图13.示出缺乏双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2与vegf121结合的代表性数据。
图14.示出缺乏双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2与vegf189结合的代表性数据。
图15.示出在786-0肾细胞癌模型中在双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2存在下肿瘤体积减小的代表性数据。
图16.示出在bxpc3胰腺癌模型中在双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2存在下肿瘤体积减小的代表性数据。
图17.a.示出在双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2不存在下的血管发生的代表性数据。
图17.b.示出在双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2存在下的血管发生的代表性数据。
图18.示出在双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2存在下血管向视网膜周边(虚线)的迁移(箭头)减少的代表性数据。4x放大率。
图19.示出在bisab-vegfh1rk-ang-2存在下血管分枝减少的代表性数据。20x放大率。
图20.a.示出在抗vegf抗体和双特异性抗体bisab-vegfh1rk-ang-2不存在下的肾病变的代表性数据。
图20.b.示出在抗vegf抗体存在下的肾病变数据的代表性数据。
图20.c.示出在存在的双特异性bisab-vegfh1rk-ang-2存在下肾病变减少的代表性数据。
具体实施方式
定义
在详细描述本发明之前，应当理解的是本发明不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以变化。如本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。术语“一个”(或“一种”)、以及术语“一个或多个/一种或多种(oneormore)”和“至少一个/至少一种(atleastone)”可以在本文中互换使用。另外，应当理解，无论在什么情况下在此用语言“包含”描述方面时，也提供了用“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。
互补决定区(cdr)负责抗体与其抗原结合。cdr通过本领域中的多种方法来确定(包括kabat(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[免疫学目的的蛋白质的序列],第5版publichealthservice[公共卫生署]，nationalinstitutesofhealth[国立卫生研究院]，bethesda，md.[马里兰州贝塞斯达](1991))；chothia(chothia和lesk,j.mol.biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))；imgt(免疫遗传学)(lefranc,m.p.等人,dev.comp.immunol.[发育和比较免疫学]27:55-77(2003))；以及其他方法)。虽然在此提及并要求保护特异性cdr序列，但是本发明还涵盖通过本领域中已知的任何方法定义的cdr序列。
如在此使用的，术语“受试者”是指脊索动物亚纲的任何成员，包括但不限于人类和其他灵长类动物，包括非人类灵长类动物(如黑猩猩和其他猿和猴类)；农场动物(如牛、绵羊、猪、山羊和马)；驯养的哺乳动物(如狗和猫)；实验室动物，包括啮齿类动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)；禽，包括驯养的、野生的和狩猎的禽(如鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽、鸭、鹅等)也是非限制性实例。
双特异性抗体
本发明的合适的双特异性抗体可以是或衍生自任何同种型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、亚同种型(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或同种异型(例如，gm，例如g1m(f、z、a或x)、g2m(n)、g3m(g、b、或c)、am、em、和km(1、2或3))。此类抗体可以包含基于轻链恒定区的氨基酸序列被分类为λ链或κ链的轻链。图1示出了五种不同的双特异性主链(bis)的取向的示意图(参见，例如，pct专利申请号pct/us2016/035026和pct/us2015/025232)。描述了scfv内的特异性接头和将scfv连接到本发明的双特异性抗体的指定部分(例如，ggggsggggsggggsggggs)的接头。然而，可以使用scfv内的或将scfv连接到本发明的双特异性抗体的任何指定部分的任何合适的接头(参见，例如，pct专利申请号pct/us2016/035026和pct/us2015/025232)。
结合分子的产生
用于产生和筛选在此描述的双特异性抗体的重组dna方法是本领域已知的(例如，美国专利号4,816,567)。编码双特异性抗体的dna，例如编码vh结构域、vl结构域、单链可变片段(scfv)、或其组合的dna可以插入到合适的表达载体中，然后可以将该表达载体转染到不以其他方式产生抗体的合适的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、或骨髓瘤细胞)中以获得本发明的双特异性抗体。
合适的表达载体是本领域已知的。表达载体可以含有编码双特异性抗体的连接到启动子的多核苷酸。这类载体可以包含编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，美国专利号5,981,216；5,591,639；5,658,759和5,122,464)，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这种载体中用于表达整个重链(包括scfv部分)、整个轻链、或整个重链和轻链两者。可以通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞，并且可以通过常规技术来培养转染的细胞以产生双特异性抗体。
作为用于表达重组抗体的宿主合适的哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心获得的永生化细胞系，包括但不限于cho细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人类肝细胞癌细胞(例如，hepg2)、人类上皮肾293细胞、以及多种其他细胞系。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当细胞系或宿主系统以确保双特异性抗体的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括cho、very、bhk、hela、cos、mdck、293、3t3、w138、bt483、hs578t、htb2、bt2o和t47d、ns0(不内源性地产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、sp20、crl7o3o以及hss78bst细胞。通过使人类淋巴细胞永生化而产生的人类细胞系可以用来重组产生单克隆抗体。人类细胞系
双特异性抗体可以使用本领域已知的方法在细胞系中稳定地表达。稳定表达可以用于重组蛋白的长期、高产量生产。为了稳定表达，可以用包含表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记基因的适当工程化的载体转化宿主细胞。在引入外源dna后，允许细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许已经将质粒稳定整合到其染色体中的细胞生长并且形成病灶，进而可以将其克隆并且扩增成细胞系。用于以高产量产生稳定细胞系的方法在本领域是已知的，并且试剂通常是可商购的。瞬时表达还可以使用本领域已知的方法进行。瞬时转染是引入细胞中的核酸不整合到该细胞的基因组或染色体dna中并且在该细胞中维持为染色体外元件(例如，作为附加体)的一个过程。
稳定或瞬时转染的表达双特异性抗体的细胞系可以被维持在本领域中已知的导致双特异性抗体的表达和产生的细胞培养基和条件中。细胞培养基可以基于可商购的培养基配制品，包括例如dmem或ham'sf12。另外，可以将细胞培养基进行改良以便支持细胞生长和生物蛋白表达两者的增长。如本文所使用术语“细胞培养基”、“培养基”、以及“培养基配制品”是指在一个多细胞有机体或组织以外的一个人工体外环境中用于细胞的维持、生长、繁殖、或扩增的营养液。可以将细胞培养基优化以用于特定的细胞培养用途，包括被配制来促进细胞生长的细胞培养物生长培养基或者被配制来促进重组蛋白产生的细胞培养物生产培养基。术语营养素、成分、以及组分(component)在此可互换使用，是指组成细胞培养基的组分(constituent)。细胞系可以使用补料分批法维持。如本文所使用，“补料分批法”是指在首先用基础培养基孵育之后，用另外的营养素供应给细胞培养物的方法。例如，一种补料分批法可以包括根据一个所确定的补料时间表在一个给定时期内添加补充培养基。因此，“补料分批细胞培养”是指这样一种细胞培养：其中最初将细胞(典型地为哺乳动物细胞)和培养基供应至培养容器，并且在培养期间，连续地或以不连续递增方式将另外的培养营养素馈送至培养物，有或没有在培养终止之前的定期的细胞和/或产物的收获。
细胞培养基以及其中包含的营养素是本领域已知的。细胞培养基可以包含一种基础培养基以及产生改良的基础培养基的至少一种水解产物，例如基于大豆的水解产物、基于酵母的水解产物、或这两种类型的水解产物的组合。另外的营养素可以仅包括基础培养基，如浓缩的基础培养基，或者可以仅包含水解产物、或浓缩的水解产物。合适的基础培养基包括达尔伯克改良的伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium，dmem)、dme/f12、最低必需培养基(mem)、伊格尔基础培养基(bme)、rpmi1640、f-10、f-12、α-最低必需培养基(α-mem)、格拉斯哥最低必需培养基(glasgow'sminimalessentialmedium，g-mem)、pfcho(参见例如，cho无蛋白质培养基(西格玛公司(sigma))或用于无蛋白质的cho细胞的ex-celltm325pfcho无血清培养基(safc生物科学公司(safcbioscience)))、以及伊斯科夫改良的达尔伯克培养基(iscove'smodifieddulbecco'smedium)。可以使用的基础培养基的其他实例包括bme基础培养基(吉布-英杰公司(gibco-invitrogen)；还参见eagle,h(1965)proc.soc.exp.biol.med.[实验生物学与医学学会学报]89,36)；达尔伯克改良的伊格尔培养基(dmem，粉末)(吉布-英杰公司(gibco-invitrogen)(#31600)；还参见dulbecco和freeman(1959)virology.[病毒学]8:396；smith等人(1960)virology.[病毒学]12:185.组织培养标准协会(tissueculturestandardscommittee),体外6:2,93)；cmrl1066培养基(吉布-英杰公司(gibco-invitrogen)(#11530)；还参见parker等人(1957)specialpublications[特种出版物],纽约科学院(n.y.academyofsciences),5:303)。
基础培养基可以是无血清的，意指该培养基不含血清(例如，胎牛血清(fbs)、马血清、山羊血清、或本领域的技术人员已知的任何其他动物源的血清)或没有动物蛋白的培养基或化学上限定的培养基。
可以改良基础培养基以便去除在标准基础培养基中发现的某些非营养组分，如各种无机和有机缓冲剂、一种或多种表面活性剂、以及氯化钠。这类组分从基础细胞培养基的去除允许剩余营养组分的浓度增加，并且可以改善总体的细胞生长和蛋白质表达。另外，可以根据细胞培养条件的要求，将省去的组分添加回至含有改良的基础细胞培养基的细胞培养基中。细胞培养基可以含有改良的挤出细胞培养基、以及以下营养素中的至少一种，铁源、重组生长因子；缓冲液；表面活性剂；等渗浓度调节剂；能量源；以及非动物水解产物。另外，改良的基础细胞培养基可以任选地含有氨基酸、维生素、或氨基酸和维生素两者的组合。改良的基础培养基可以进一步含有谷氨酰胺，例如l-谷氨酰胺和/或氨甲蝶呤。
纯化和分离
一旦已经产生双特异性抗体，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱(特别是通过对于特定抗原蛋白a或蛋白g的亲和力)、以及尺寸柱色谱(sizingcolumnchromatography))、离心、差别溶解度、或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术将其纯化。此外，本发明的双特异性抗体可以融合至异源多肽序列(在此称为“标签”)以促进纯化。
用途
本发明的双特异性抗体可以多种方式使用。例如，本发明的双特异性抗体可以用于结合vegf、ang、或这些蛋白质的任何组合，并且从而降低vegf、ang的至少一种生物活性、或这些活性的任何组合。更具体地，本发明的双特异性抗体可以用于结合vegf-165、ang-2、或这些蛋白质的任何组合，并且从而降低vegf-165、ang-2的至少一种生物活性、或这些活性的任何组合，其可以包括减少它们的对应受体的激活或磷酸化和/或减少与细胞失调相关的血管生成。
示例性实施例
本发明的一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的重链互补决定区1-3(即，hcdr1、hcdr2、和hcdr3)以及轻链互补决定区1-3(即，lcdr1、lcdr2、和lcdr3)；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体结合vegf165。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体以与vegf121相比更大的亲和力结合vegf165。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体以与vegf189相比更大的亲和力结合vegf165。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体以与vegf121和vegf189相比更大的亲和力结合vegf165。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体减少人类vegfr2磷酸化、鼠vegfr2磷酸化、或人类和鼠vegfr2磷酸化两者。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体减少人类tie2受体磷酸化。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体减少血管生成。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或者减少肿瘤生长并减小肿瘤体积。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体以比用于制备第二结合结构域的亲本ang-2抗体更大的亲和力结合ang-2。在一个更具体的实施例中，第二结合结构域与ang-2的结合亲和力增加约1倍至约20倍。在另一个更具体的实施例中，第二结合结构域与ang-2的结合亲和力增加约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍、约15倍、约16倍、约17倍、约18倍、约19倍、或约20倍。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含在此所述的双特异性抗体的hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中该第一结合结构域结合vegf-a并且该第二结合结构域结合ang-2，并且其中该双特异性抗体具有在此所述的特征中的一种或多种或任何组合，包括结合vegf165、以与vegf121相比更大的亲和力结合vegf165、以与vegf189相比更大的亲和力结合vegf165、以与vegf121和vegf189相比更大的亲和力结合vegf165、减少人类vegfr2磷酸化、减少鼠vegfr2磷酸化、减少人类和鼠vegfr2磷酸化、减少人类tie2受体磷酸化、减少血管生成、减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、减少肿瘤生长并减小肿瘤体积、以及与用于制备第二结合结构域的亲本ang-2抗体相比通过第二结合结构域增加与ang-2的亲和力。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其包含具有式vh-ch1-h-ch2-ch3的抗体重链，其中vh是重链可变结构域，ch1是重链恒定区结构域1，h是铰链区，ch2是重链恒定区结构域2，并且ch3是重链恒定区结构域3。在另一个进一步的实施例中，该双特异性抗体包含具有式vl-cl的抗体轻链，其中vl是可变轻链结构域并且cl是轻链恒定结构域。在另一个甚至进一步的实施例中，该双特异性抗体具有式vh-ch1-h-ch2-ch3和vl-cl。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其具有式vh-ch1-h-ch2-ch3和vl-cl，其中一个或多个scfv分子与抗体重链或抗体轻链的一个或多个n末端部分共价附接。在另一个进一步的实施例中，一个或多个scfv分子与双特异性抗体的一个或多个vl的n末端结构域共价附接。在一个更具体的实施例中，该双特异性抗体具有式vh-ch1-h-ch2-ch3和scfv-l1-vl-cl，其中l1是接头并且其他各种部分先前已描述。在另一个更具体的实施例中，该双特异性抗体具有式scfv-l1-vh-ch1-ch2-ch3和vl-cl。
另一个实施例涉及一种双特异性抗体，其具有式vh-ch1-h-ch2-ch3和vl-cl，其中一个或多个scfv分子与抗体重链的一个或多个c末端部分共价附接。在一个更具体的实施例中，该双特异性抗体具有式vh-ch1-ch2-ch3-l1-scfv和vl-cl。在另一个更具体的实施例中，该双特异性抗体具有式vh-ch1-ch2-ch3-l1-scfv-l2和vl-cl，其中l2是接头并且独立于l1，并且其中l1和l2共价结合ch3，其他各种部分先前已描述。在另一个进一步更具体的实施例中，该双特异性抗体具有式vh-ch1-l1-scfv-l2-ch2-ch3和vl-cl，其中l1和l2是独立的接头，并且其中重链可以含有铰链区或者是无铰链的。在另一个实施例中，双特异性抗体是bis3ab-vegfh1rk-ang-2。
在一个特定实施例中，存在一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第一结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:17–22；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第二结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:23–28。
在另一个特定实施例中，存在一种双特异性抗体，其包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含分别包含seqidno:3和seqidno:9的重链和轻链；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含分别包含seqidno:5和seqidno:11的重链和轻链。
在另一个特定实施例中，存在一种双特异性抗体，其包含包括seqidno:1的重链氨基酸序列和包括seqidno:7的轻链氨基酸序列。
在另一个特定实施例中，存在一种双特异性抗体，其具有一个式，该式具有部分vh-ch1-h-ch2-ch3、vl-cl、和一个或多个scfv、l1、或任选地l2，其中该式可以是：
a.vh-ch1-ch2-ch3和scfv-l1-vl-cl；
b.scfv-l1-vh-ch1-ch2-ch3和vl-cl；
c.vh-ch1-ch2-ch3-l1-scfv和vl-cl；
d.vh-ch1-ch2-ch3-l1-scfv-l2和vl-cl，其中l1和l2共价结合ch3；
e.vh-ch1-l1-scfv-l2-ch2-ch3和vl-cl，该重链可以含有铰链区或者是无铰链的。
在另一个特定实施例中，存在一种具有式vh-ch1-ch2-ch3-l1-scfv和vl-cl的双特异性抗体。
在另一个特定实施方案中，存在一种包含scfv的双特异性抗体，该scfv包含seqidno:13的氨基酸序列。
在另一个特定实施例中，存在一种核酸序列，其包含编码双特异性抗体的多核苷酸，该双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第一结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:17–22；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第二结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:23–28。
在另一个特定实施例中，存在一种载体，其包含编码双特异性抗体的多核苷酸，该双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第一结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:17–22；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第二结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:23–28。
在另一个特定实施例中，存在一种包含载体的细胞，该载体包含编码双特异性抗体的多核苷酸，该双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第一结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:17–22；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第二结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:23–28。
在另一个特定实施例中，存在一种制备双特异性抗体的方法，其包括培养包含载体的细胞，该载体包含编码双特异性抗体的多核苷酸，该双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第一结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:17–22；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第二结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:23–28。
在另一个特定实施例中，存在一种减少血管生成的方法，其包括向受试者提供双特异性抗体，其中该双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第一结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:17–22；以及第二结合结构域，该第二结合结构域包含hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3，其中第二结合结构域hcdr1、hcdr2、和hcdr3以及lcdr1、lcdr2、和lcdr3分别包含seqidno:23–28。
序列
实例
对于在此所述的实验，使用各种抗体，包括medi3617(intjoncol.[国际肿瘤学杂志]2012年5月；40(5):1321-30)、
实例1–bs3ab-vegfh1rk-ang2的形式和序列。
设计bis3ab-vegfh1rk-ang-2来通过减少分别与其受体vegfr和tie2的结合同时降低vegf-a和ang-2的一种或多种生物活性。图2是bis3ab-vegfh1rk-ang-2的示意图。该双特异性二价抗体包含具有连接到每个重链的c末端的scfv的全长igg分子，如由dimasi等人(jmolbiol.[分子生物学杂志]2009)先前所述。fab区的结合特异性是抗vegf-a(第一结合结构域)，并且scfv是抗ang-2(第二结合结构域)。编码第一结合结构域的轻链的整个核苷酸序列在图3中示出。翻译的氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列也在图3中示出。抗vegf轻链是通过将苏氨酸突变为赖氨酸在位置107处校正的胚系。胚系校正的抗vegf序列被称为h1rk。重链的完整核苷酸序列在图4中示出，并且相应的氨基酸序列在图5中示出。重链序列的氨基酸序列可以进一步分为第一结合结构域的重链可变区、重链恒定区(包括ch1、ch2和ch3结构域)、连接甘氨酸丝氨酸接头、第二结合结构域的可变轻链、scfv甘氨酸丝氨酸接头以及第二结合结构域的可变重区。
实例2-瞬时转染
bis3ab-vegfh1rk-ang-2和亲本抗体的瞬时转染在freestyletm无血清培养基(英杰公司(invitrogen))中在120rpm、37℃和8％co2下培养的hek293f悬浮细胞中进行。在转染前一天将细胞分为0.7x106个。将300μl的293fectintm转染试剂(英杰公司(invitrogen))和200μg的dna分别稀释到5ml的
使用蛋白质a结合方法监测bisab-vegfh1rk-ang-2和亲本抗体的表达。培养基的等分式样是0.2μm滤液(艾本德公司(eppendorf))，并且使用hplc系统(安捷伦1100毛细管lc)加载到蛋白质a柱(
表1
实例3-蛋白质纯化和浓度确定
通过标准蛋白质a亲和色谱法纯化抗体。将一升条件培养基在1500xg下离心10分钟并且进行0.2μm真空过滤(乐基因公司(nalgene))。使用aktaexplorer(ge公司(ge))将过滤的上清液加载到mabselecttm蛋白质a柱(ge公司(ge))上。将蛋白质a柱用20个柱体积的1xpbs、ph7.2平衡，并且使用5ml/min的流速加载过滤的培养基。通过使用20个主体的1xpbs、ph7.2去除未结合的材料。使用10个柱体积的0.1m甘氨酸、150mm氯化钠ph3.2进行抗体洗脱。使用280nm的吸光度监测洗脱。通过使用1/10的体积/级分的1mtris-hclph7.0立即中和蛋白质a洗脱的抗体。然后使用0.22μm注射器式过滤器(乐基因公司(nalgene))过滤抗体。使用nanodrop(nanodrop公司)和1.4m-1cm-1的消光系数通过读取280nm处的吸光度来确定纯化抗体的浓度。
可以通过陶瓷羟基磷灰石ii型(ge公司(ge))纯化有效去除在bisab-vegfh1rk-ang-2的表达过程中生成的聚集体。将cht柱用五个柱体积的1m氢氧化钠预处理，并且用1xpbsph7.2在5ml/min下中和至ph7.2。在使用之前使用20个柱体积的缓冲液a(20％1xpbs，ph7.2，在无菌水中)来对柱进行平衡。直接将bisab-vegfh1rk-ang-2蛋白质a洗脱液加载在cht柱上并且用20个柱体积的缓冲液a洗涤。将单体级分用15％缓冲液a和85％缓冲液b(5xpbs，ph7.2)针对15个柱体积洗脱。使用100％缓冲液b洗脱聚集体。代表性洗脱曲线在图6中示出。将单体级分在1xpbs、ph7.2中透析过夜。
在蛋白质a纯化之后测量bis3ab-vegfh1rk-ang-2的单体含量以确定聚集体水平以及是否需要精化步骤。用tskgelg3000swxl柱(东曹生物科技公司(tosohbioscience))，使用agilent1100hplc(安捷伦公司(agilent))进行分析尺寸排阻色谱法(sec-hplc)。250μg的双特异性抗体用于分析。所使用的流动相是0.1m硫酸钠，0.1m磷酸钠，ph6.8，并且使用280nm的吸光度监测抗体。使用chemstation软件(安捷伦公司(agilent))用于分析，并且使用prism5软件(graphpad公司)制作图。蛋白质纯化之后和陶瓷羟基磷灰石纯化之后的代表性单体含量在图7中示出。可以通过使用陶瓷羟基磷灰石色谱法有效地去除bis3ab-vegfh1rk-ang-2中的至少12％的聚集体。
实例4–bisab-vegfh1rk-ang-2的分析表征
通过还原和非还原sds-page分析bis3ab-vegfh1rk-ang-2。2μg的蛋白质、抗vegf或bis3ab-vegfh1rk-ang-2，在15μl的1xpbsph7.2中并且与5μl的lds-page加样缓冲液混合，具有和不具有1xnupage还原剂(英杰公司(invitrogen))。使用10μl的novexsharp预染色蛋白质标准(英杰公司(invitrogen))作为蛋白梯。将样品在70℃下加热10分钟，使用小型台式离心机在13,500rpm下旋转沉积并且加载到4％-12％nupage凝胶(英杰公司(invitrogen))上。在200伏下在mops缓冲液中进行电泳一小时。将sds-page凝胶用simplybluetmsafestain(英杰公司(invitrogen))染色并且在水中脱色过夜。代表性sds-page凝胶在图8中示出。
使用ice2分析仪(普诺森公司(proteinsimple))执行bis3ab-vegfh1rk-ang-2的成像毛细管等电聚焦。两性电解质(pharmalyte)ph3–10和8–10.5从西格玛公司(sigma)获得。用于ice3分析仪的性能评估的fc药筒化学测试试剂盒，包括阳极电解液(0.1％甲基纤维素中的80mm磷酸)、阴极电解液(0.1％甲基纤维素中的100mm氢氧化钠)、0.5％甲基纤维素、血红蛋白和两性电解质(ampholyte)以及0.35％甲基纤维素中的pi标记，购自普诺森公司(proteinsimple)。5.85和9.46pi标记从普诺森公司(proteinsimple)获得。所使用的fc药筒分离购自普诺森公司(proteinsimple)，bis3ab-vegfh1rk-ang-2在1mg/ml下在去离子水中制备。将50μl的1mg/mlbs3ab-vegf-ang2溶液、2μl的5.85pi标记、2μl的9.46pi标记、140μl的0.5％甲基纤维素、2μl的两性电解质3-10以及6μl的8-10.5两性电解质合并；涡旋45sec并且在10,000rpm下离心3分钟。使用自动取样机(普诺森公司(proteinsimple))将样品引入毛细管。通过在1000kv下预聚焦1minute/s，接着在3000kv下预聚焦7minute/s来执行样品分离。在280nm处用氘灯检测器进行检测。分析数据，并且使用ice280分析仪软件制作图。bis3ab-vegfh1rk-ang-2的代表性聚焦在图9中示出；指示了蛋白质的pi。
将bis3ab-vegfh1rk-ang-2在25mm组氨酸ph6.0中透析三次过夜，之后使用vp-dsc(microcal公司)进行差示扫描量热法分析。将最终透析缓冲液用于参考扫描以获得稳定基线以用于参考减法。将试剂脱气最少两分钟，并且将蛋白质在参考缓冲液中稀释至1mg/ml并且使用16秒过滤时间段在1℃/min下从20℃扫描至110℃。bis3ab-vegfh1rk-ang-2的代表性转变温度在图10中示出。
实例5-bis3ab-vegfh1rk-ang-2与ang-2的结合亲和力
确定bis3ab-vegfh1rk-ang-2与ang-2的结合亲和力。根据在kinexa3000和3200仪器(萨皮蒂尼仪器公司，博伊西，爱达荷州(sapidyneinstruments,boise,id))上进行的测量获得平衡结合常数(kd)。将人类ang-2(huang2)蛋白以涂覆缓冲液(50mm碳酸钠缓冲液，ph9)在5mg/ml和30mg/ml的浓度下涂覆到
表2
确定bisab-vegfh1rk-ang-2与vegf的结合亲和力。如同抗hu-ang2测量，在kinexa3000和3200仪器(萨皮蒂尼仪器公司，博伊西，爱达荷州(sapidyneinstruments,boise,id))上执行平衡结合常数(kd)测量。将人类vegf(huvegf)蛋白以涂覆缓冲液(50mm碳酸钠缓冲液，ph9)在3mg/ml、30mg/ml和50mg/ml的浓度下涂覆到
实例6–bis3ab-vegfh1rk-ang-2与ang-2和vegf165的同时结合
使用在10mm乙酸盐、ph5中的10nm的vegf165、100nm的ang2和10nm的bs3ab-vegf-ang2在25℃下在biacore3000(ge医疗公司(gehealthcare))上执行同时结合实验，并且使用由制造商(ge医疗公司(gehealthcare))提供的标准胺偶联方案固定到cm5传感器芯片表面上。使用溶液bisab-vegfh1rk-ang-2固定芯片，在hbs缓冲液(ge医疗公司(gehealthcare))中制备100nm的vegf以及100nm的vegf和500nm的ang-2的混合物。在30ml/min的流速下注射vegf溶液，持续500秒。在第一次注射之后，注射vegf或vegf/ang-2混合物的额外一次注射，持续250秒。通过第一次注射500nm的ang-2，接着进行另一次vegf/ang-2混合物的ang-2注射来进行相似的实验。为了进一步确认同时结合，使用vegf和ang-2涂覆的芯片。针对vegf165表面，使50nm的bisab-vegfh1rk-ang-2在30ml/min下流动600秒，接着第二次注射50nmbisab-vegfh1rk-ang-2和500nm的ang-2。将ang-2表面用于相似的实验。将50nm的bisab-vegfh1rk-ang-2在30ml/min下用于初始注射，持续500秒。使用50nm的bisab-vegfh1rk-ang-2或者bisab-vegfh1rk-ang-2和100nm的vegf165的混合物进行第二次注射。使用bia评估(ge医疗公司(gehealthcare))分析数据，并且使用prism5(graphpad公司)制作图，并且代表性结果在图11中示出。
还在双重结合elisa中针对与vegf和ang-2的同时结合筛选bisab-vegfh1rk-ang-2抗体。将maxisorp板(能肯公司(nunc)，目录号439454)用100μl的在没有ca++或mg++的pbs中稀释的1.0μg/ml人类或小鼠vegf(派普泰克公司(peprotech))涂覆并且冷藏过夜。对板进行倾析，然后在板振荡器上用200μl的含有3％bsa(西格玛公司(sigma)，目录号a-3059)和1xpbs中的0.1％tween-20的封闭缓冲液封闭1.5小时。将板用含有0.1％tween-20的1xpbs洗涤3次。一式两份添加50μl的在封闭缓冲液中的60nm和系列稀释度的bisab-vegfh1rk-ang-2双特异性抗体、ang-2抗体、或具有r347同种型对照臂的双特异性抗体(bs3ab-r347-ang2)，并且在板振荡器上孵育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，然后向每个孔添加在封闭缓冲液中的50μl的1μg/ml人类或小鼠ang2-生物素(r&d系统公司(r&dsystems))并且在板振荡器上在室温下孵育1小时。洗涤板，然后在板振荡器上在室温下添加50μl的1:15,000链霉抗生物素蛋白hrp(皮尔斯公司(pierce))。洗涤板，然后通过向每个孔添加50μl的tmb溶液(kpl公司)来显色，然后用50μl的1m磷酸使反应停止。在微板读数器上在450nm处读取板。在graphpadprism5.01版本(圣地亚哥，加利福尼亚州(sandiego,ca))中使用非线性回归分析(log剂量响应，4参数拟合曲线)确定ec50值。代表性结果在图12a(人类)和图12b(小鼠)中示出。与在此测定中显示弱结合的单独ang2抗体(medi3617)和bs3ab-r347-ang2相比，bisab-vegfh1rk-ang-2表现出与人类和小鼠vegf和ang-2的强同时结合(ec50分别为10.8pm和103.8pm)，该弱结合表示未能同时结合vegf和ang-2。
实例7-针对减少的vegf121结合的bisab-vegfh1rk-ang-2的筛选
在elisa形式中针对vegf121结合筛选抗体。将96孔半孔maxisorp板用25μl的在没有ca++或mg++的pbs中稀释的2μg/ml人类vegf(派普泰克公司(peprotech))涂覆并且冷藏过夜。对板进行倾析，然后用180μl的含有3％bsa(西格玛公司(sigma)，目录号a-3059)和1xpbs中的0.1％tween-20的封闭缓冲液在37℃下封闭1.5小时。将板用含有0.1％tween-20的1xpbs洗涤3次。一式两份添加50μl在封闭缓冲液中的系列稀释度的抗vegf抗体、
实例8–针对减少的vegf189结合的bisab-vegfh1rk-ang-2的筛选
在elisa形式中针对与vegf189的结合筛选bisab-vegfh1rk-ang-2。将96孔半孔maxisorp板用25μl的在没有ca++或mg++的pbs中稀释的2μg/ml人类vegf189(r&d系统公司(r&dsystems))涂覆并且冷藏过夜。对板进行倾析，然后用180μl的含有3％bsa(西格玛公司(sigma)，目录号a-3059)和1xpbs中的0.1％tween-20的封闭缓冲液在37℃下封闭1.5小时。将板用含有0.1％tween-20的1xpbs洗涤3次。一式两份添加50μl的在封闭缓冲液中的6.7nm和系列稀释度的bisab-vegfh1rk-ang-2、g6-31(阳性对照)和bs3ab-r347-ang2(阴性对照)，并且在37℃下孵育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，然后向每个孔添加50μl的1:5000山羊抗人类hrpiggh+l(杰克逊免疫研究(jacksonimmunoresearch))并且在室温下孵育1小时。通过向每个孔添加50μl的tmb溶液(kpl公司)来使板显色，然后用50μl的1m磷酸使反应停止。在微板读数器上在450nm处读取板。图14示出了bisab-vegfh1rk-ang-2的代表性结果。与阳性对照g6-31相比，bisab-vegfh1rk-ang-2显示与vegf189的5倍低的结合(ec500.057nm相对于0.0096nm)。
实例9–确定vegf-ang2双特异性抗体的功效的功能性测定
在功能性生物测定中筛选bisab-vegfh1rk-ang-2以确定减少具有人类、小鼠和食蟹猴(cyno)受体的细胞系中的pvegfr2和ptie2的能力。ad293-huvegfr2(cl.e2)、hek293-tie2、ad293-muvegfr2-muang2细胞(cl.d10)、ad293-食蟹猴vegfr2-食蟹猴ang2细胞(cl.sb5)和ad293-食蟹猴tie2细胞(cl.d12)由稳定转染生成。将细胞以亚融合状态接种在具有100μldmem+10％fbs(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(lifetechnologies,carlsbad,ca))的96孔聚-d-赖氨酸组织培养板(柯仕达公司，图克斯伯里，马萨诸塞州(costar,tewksbury,ma))中，并且在37℃和5％co2下孵育过夜。第二天，将培养基抽走并且用50μl饥饿培养基(dmem+0.2％fbs+0.1％bsa)替换，并且将细胞返回到培养箱过夜。在24小时处，将培养基抽走，并且将2660nm(2x浓度)抗体、bisab-vegfh1rk-ang-2和bs3ab-hpv-r347阴性对照在无血清dmem+0.1％bsa中连续稀释，并且在37℃下一式两份添加到板，持续30分钟。然后，将50μl的1:1混合的12μg/ml人类、小鼠(r&d系统公司(r&dsystems))或食蟹猴ang2(室内制备)+20nm的人类、小鼠(派普泰克公司，洛基山，纽约(peprotech,rockyhill,nj))或食蟹猴(室内制备)vegf(4x)然后添加到孔并且在4℃下孵育30分钟。然后将板在37℃下再孵育7分钟。对板进行倾析，并且将孔用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(lifetechnologies,carlsbad,ca))的55μl冰冷ripa裂解缓冲液(波士顿生物产品公司，波士顿，马萨诸塞州(bostonbioproducts,boston,ma))裂解。使用pvegfr2全细胞裂解物试剂盒(中尺度诊断公司，罗克维尔，马里兰州(mesoscalediagnostics,rockville,md))检测人类、食蟹猴和小鼠pvegfr2。
使用通过中尺度诊断(msd)平台发展的方案确定人类和食蟹猴ptie2。将msd高结合板用2μg/ml的tie2抗体克隆16(艾博抗公司，剑桥，马萨诸塞州(abcam,cambridge,ma))涂覆过夜。第二天，将板仅用三乙醇胺缓冲盐水(tbs)洗涤，并且在旋转振荡的情况下在室温下用tbs中的3％msd封闭剂a+0.05％tween20(西格玛公司，圣路易斯，密苏里州(sigma,stlouis,mo))封闭1小时。将板用tbs+0.05％tween20洗涤，并且将裂解物添加到板，并且然后在旋转振荡的情况下在室温下孵育1小时。洗涤板，并且在旋转振荡的情况下在室温下添加1μg/ml的抗人类tie2抗体(af2720，r&d系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州(r&dsystems,minneapolis,mn))1小时。洗涤板，然后在旋转振荡的情况下在室温下将1μg/ml磺基-标签山羊抗兔二级抗体(msd公司，罗克维尔，马里兰州(msd,rockville,md))添加到板1小时。洗涤板，添加红色缓冲液t(msd公司，罗克维尔，马里兰州(msd,rockville,md))，然后立即使用sector成像仪6000(msd公司，罗克维尔，马里兰州(msd,rockville,md))读取板。
使用通过中尺度诊断(msd)平台发展的方案确定鼠ptie2。将msd链霉抗生物素蛋白板在旋转振荡的情况下在室温下用tbs中的3％msd封闭剂a+0.05％tween20(西格玛公司，圣路易斯，密苏里州(sigma,stlouis,mo))封闭1小时。将板用tbs+0.05％tween20洗涤，并且然后将25μl/孔的在封闭缓冲液中的2μg/ml生物素抗小鼠tie2抗体(biolegend公司，#124006)在旋转振荡的情况下在室温下孵育1小时。对板进行倾析并且洗涤3次。然后，一式两份每孔添加25μl/孔的裂解物，并且在板振荡器上在室温下孵育2小时。洗涤板，然后每孔添加25μl的磺基-标签py20(msd公司)，并且在板振荡器上在室温下孵育1小时。洗涤板，然后添加150μl的2xmsd红色缓冲液t，并且立即使用sector成像仪6000(msd公司，罗克维尔，马里兰州(msd,rockville,md))读取板。
通过以下式计算ptie2和pvegfr2的磷酸化百分比：[平均rlu(测试样品)/平均rlu(五抗体)]*100。代表性结果在表3中示出。bisab-vegfh1rk-ang-2有效地减少人类、小鼠和食蟹猴pvegfr2和ptie2，从而显示两个臂在双特异性形式中是功能性的。当与用于制备bisab-vegfh1rk-ang-2的scfv抗ang-2的ang-2抗体(medi3617)相比时，bisab-vegfh1rk-ang-2的抗ang-2活性显示明显更大的活性。
表3
实例10-bisab-vegfh1rk-ang-2的体内活性
在786-0肾细胞癌和bxpc3胰腺癌模型中针对功效体内测试bisab-vegfh1rk-ang-2，该bxpc3胰腺癌模型包括bxpc3肿瘤的浇注生长(casting)，以说明肿瘤腔隙内的抗血管生成。另外，执行视网膜血管发生模型以便进一步展现bisab-vegfh1rk-ang-2的活性。此外，在小鼠中执行血小板减少的模型以便确定与结合所有vegf同种型的抗vegf阳性对照抗体(g6-31)相比，是否在bisab-vegfh1rk-ang-2的情况下发生更少的毒性。最后，评估肾病变。
对于786-0肾细胞癌模型，将来自人类肾癌细胞系786-0的肿瘤片段皮下植入到裸小鼠的右胁腹中。在肿瘤体积达到大约200mm3时，开始给药。每周两次处理小鼠，总计6个剂量(轴上的三角形)。基于分子量对剂量进行归一化。与单独的ang-2抗体(medi3617)或vegf抗体
对于bxpc3胰腺癌模型，将bxpc3肿瘤片段皮下植入到雌性scid小鼠的右胁腹中。在肿瘤体积达到大约200mm3时，开始给药。每周两次对小鼠进行给药，总计6个剂量(轴上的三角形)。基于分子量对剂量进行归一化。与单独的ang-2抗体(medi3617)或vegf抗体
除肿瘤体积之外，使用来自bxpc3胰腺癌模型工作的肿瘤评估肿瘤脉管系统。用肝素对小鼠进行给药以便在安乐死之前15分钟防止凝血。在大约6ml/min的速率下灌注0.1mm硝普钠的溶液。通过混合8ml的乳胶、10ml的稀释剂和900ul的药物来制备microfilmv-122。在混合物稳定之后(大约1分钟)，将其在2ml/min的速率下灌注，直至给予17ml的总体积。在60-90分钟之后，切除肿瘤并且浸入在10％nbf中24小时。然后将样品转移通过乙醇梯度(25％etoh/pbs，50％etoh/pbs，75％etoh/pbs，95％etoh，并且然后100％etoh)，每个梯度水平进行24小时。在最终孵育之后，将样品浸入在水杨酸甲酯中以便使脱水的肿瘤样品澄清，之后通过光学显微镜成像。肿瘤脉管系统在具有bisab-vegfh1rk-ang-2的小鼠中减少。代表性数据在图17中示出。
除以上所述的模型之外，在视网膜血管生成模型中评估bisab-vegfh1rk-ang-2。使用此模型，在出生时、第1天、第3天、和第5天对cd1小鼠进行腹膜内给药。在第8天，对小鼠进行麻醉并且输注荧光素标记的右旋糖酐。取出眼睛并且用10％福尔马林固定，之后制备铺片(flatmount)。通过荧光显微镜检查铺片。
新生视网膜血管生成由两个步骤组成，即血管从视神经(图18点-箭头)迁移到视网膜的边缘以及分枝。与没有bisab-vegfh1rk-ang-2存在的迁移程度相比，bisab-vegfh1rk-ang-2展示减少的血管迁移。代表性结果在图18中示出。与没有bisab-vegfh1rk-ang-2存在的分枝程度相比，bisab-vegfh1rk-ang-2展示减少的血管分枝。代表性数据在图19中示出。
对于血小板减少模型，采用来自meyer等人(jthrombhaemost[血栓和止血杂志]7:171-81,2009)的方法。简而言之，将8-16周大的fcγ受体2a转基因小鼠用预混合的vegf165、0.6个单位肝素、和抗体注射到侧尾静脉中。然后针对患病的行为症状观察小鼠并且如下评分：(-)不停地从一个角落到另一个角落停留和移动，呼吸正常，(+)嗜睡的症状，以更长的持续时间停留和移动，呼吸浅弱，(++)非常嗜睡，停止移动，主要待在箱的一侧，深呼吸，(+++)严重的血栓性事件抽搐和旋转，(++++)死亡。与抗vegf对照(g6-31)相比，bisab-vegfh1rk-ang-2已减少血小板减少。代表性数据在表4中示出。
表4
*抗vegf结合所有vegf同种型
通过经由过碘酸-希夫(pas)进行的染色检查来自四只动物/组的肾。pas染色用于检查14个剂量的处理之后的肾病变。与bisab-vegfh1rk-ang-2相比，抗vegf(g6-31)处理的动物中存在增加的肾小球系膜基质和增厚的毛细管袢(箭头)。代表性在表5和图20a至图20c中示出。
表5
通过引用结合
将在此引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书和类似物，以及其中引用的参考文献，在尚未被结合在此的程度上，出于所有目的以其全部内容特此通过引用结合在此。
等效物
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践这些实施例。然而，将会了解的是无论前述内容可以如何详述出现在本文中，能以许多方式实践这些实施例并且权利要求书包括其任何等效物。