伤口愈合肽的制作方法

本发明涉及伤口愈合肽。更具体地，本发明涉及衍生自颗粒体蛋白的n末端区域的肽，该肽促进细胞增殖、迁移和/或伤口愈合。

背景技术：

颗粒体蛋白是蛋白质生长因子家族，涉及广泛的生理功能和疾病过程，包括胚胎发生，伤口修复，炎症和肿瘤生长¹。人寄生肝吸虫麝猫后睾吸虫(opisthorchisviverrini)分泌一种称为ov-grn-1的颗粒体蛋白家族成员，其最初从致癌吸虫的排泄/分泌(es)产物中分离出来^2,3。ov-grn-1是描述的第一种来自病原体的用于引起宿主细胞增殖的生长因子^4,5。我们已经表明皮摩尔浓度的重组ov-grn-1在局部给药时在小鼠中诱导血管生成并加速伤口修复，这些结果表明肝吸虫颗粒体蛋白可能被开发用于治疗伤口⁶。

理解ov-grn-1的结构-活性关系将能够设计用于愈合伤口的最有效形式的该颗粒体蛋白。ov-grn-1的三维结构尚未通过实验确定，但已报道了几种物种的颗粒体蛋白的结构。确定的初始颗粒体蛋白结构是鲤鱼颗粒体蛋白-1；其包括通过六个二硫键在二硫键的梯形排列中交联在一起的四个β-发夹⁷。尽管观察到鲤鱼颗粒体蛋白-1的明确结构，但颗粒体蛋白的结构功能关系是复杂的，并且似乎高度依赖于一级序列。这对于人颗粒体蛋白尤其明显。哺乳动物颗粒体蛋白的前体蛋白(颗粒体蛋白前体(progranulin)，pgrn)含有七个半颗粒体蛋白结构域，其具有约6kda的分子量并在细胞分泌pgrn后通过蛋白水解加工成单独的颗粒体蛋白模块¹。“半颗粒体蛋白(half-granulin)”单元称为paragranulin，其仅含有六个半胱氨酸残基⁸。

已经单独表达了七种人颗粒体蛋白模块，并且通过nmr光谱法分析了结构⁹。三种在溶液(a、c和f)中含有相对明确的三维结构，而其他的主要是结构不佳的二硫化物异构体的混合物⁹。人颗粒体蛋白a的结构包括类似于鲤鱼颗粒体蛋白-1的β-发夹结构，但在c末端区域存在显著的结构紊乱。在折叠良好的人颗粒体蛋白模块中，颗粒体蛋白a显示出对乳腺癌细胞系增殖的有效抑制，而相反，人颗粒体蛋白f刺激细胞增殖⁹。折叠不良的肽表现出弱的抑制或活性或没有抑制或活性。然而，应该注意，有限的活性可能是由于靶细胞中缺乏关键信号传导途径，和/或细菌中重组肽的产生诱导不完全/不正确的折叠。迄今为止，颗粒体蛋白活性和结合配偶体的范围很广，并且似乎依赖于器官和辅因子^10-13。

用nmr光谱法进行的结构分析表明，鲤鱼颗粒体蛋白-1和人颗粒体蛋白a的n末端区域可以独立于c末端区域折叠^14,15。仅含有两个二硫键的这两种颗粒体蛋白的截短类似物具有β-发夹结构，如鲤鱼颗粒体蛋白-1的30个残基的n末端结构域所示(图1)。

技术实现要素：

令人惊讶的是，衍生自颗粒体蛋白的n末端区域的肽具有促进细胞增殖、迁移和/或伤口愈合的活性。此外，可以将另外的二硫键工程化到这些肽中以改善或以其他方式改变肽的折叠。

本发明的广义形式提供了一种分离肽，其包含衍生自或基于颗粒体蛋白的n末端区域的氨基酸序列的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种分离肽，其包含、基本上由或由以下氨基酸序列组成：

¹xnc²xd³xvytcr⁴xgqtcc/arglhgygc⁵xm(seqidno:1)或与其至少70％相同的氨基酸序列。

优选地，n为0-10。

当n为1-10时，¹x为任何相同或不同的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，当n为3时，¹x＝sps。

在一个实施方案中，当n为4时，¹x＝rsps。

在一个实施方案中，当n为11时，¹x＝mdtlqpirsps。

优选地，m为0-4。

当m为1-4时，⁵x可以是任何相同或不同的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，当m为1时，⁵x＝c或a。

在一个实施方案中，当m为4时，⁵x＝apmd。

在另一个实施方案中，当m为4时，⁵x＝cpmd。

²x³x⁴x中的每一个可以分别是任何相同或不同的一个或多个氨基酸。

优选地，²x³x⁴x中的每一个独立地为p或a。

在一些优选实施方案中，²x³x⁴x中的至少一个、至少两个或每个＝p。

在一些优选实施方案中，²x³x⁴x之一＝a。

在一个相关方面，本发明提供了一种分离肽，其包含、基本上由或由以下氨基酸序列组成：seqidno:11之外的图1-13或表3中任一个所示的氨基酸序列，或与其至少70％相同的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，分离肽包含seqidno:1-10中任一个所示的氨基酸序列，或与其至少70％相同的氨基酸序列。

在前述方面的一些实施方案中，分离肽包含或能够形成两个或三个链内二硫键。

在前述方面的一些实施方案中，分离肽能够形成脯氨酸顺式/反式异构体。

在第二方面，提供了一种修饰包含seqidno:1-11中任一个所示的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列的肽的方法，其包括将一个或多个氨基酸插入、缺失或取代掺入到所述肽的氨基酸序列中的步骤。

优选地，修饰所述肽导致所述肽的一种或多种增加或增强的生物活性。

本发明的第三方面提供了根据第二方面的方法修饰的分离肽。

还提供了特异性结合第一或第三方面的分离肽的抗体或抗体片段。

另一方面，本发明提供了一种分离核酸，其编码第一或第三方面的分离肽。

在另一方面，本发明提供了一种遗传构建体，其包含上述核酸的分离核酸。

在又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含前述方面的遗传构建体。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含前述方面的分离肽或分离核酸以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一个方面，本发明提供了一种促进细胞增殖和/或迁移的方法，所述方法包括使一种或多种细胞与前述方面的分离肽、分离核酸或药物组合物接触从而引发、刺激或促进一种或多种细胞的增殖和/或迁移的步骤。

在另一个方面，本发明提供了一种愈合伤口的方法，所述方法包括使伤口与前述方面的分离肽、分离核酸或药物组合物接触从而至少部分地愈合伤口的步骤。

在又一个方面，本发明提供了一种产生促进细胞增殖、迁移和/或愈合伤口的药剂的方法，所述方法包括鉴定、工程化、筛选或设计前述方面的分离肽的类似物或激动剂的步骤，所述类似物或激动剂促进细胞增殖和/或迁移和/或愈合伤口。

该方面还提供了一种由该方面的方法产生的促进细胞增殖、迁移和/或愈合伤口的药剂。

适当地，可以根据前述方面的方法使用该药剂。

在整个说明书中，除非另有说明，否则“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”被包含地使用而不是排他地使用，使得所说明的整数或整数组可包括一个或多个其他未说明的整数或整数组。

“基本上由......组成”在本文中是指除了所述氨基酸序列之外，分离的蛋白质或每个免疫原性片段还具有一个、两个或不超过三个氨基酸残基。另外的氨基酸残基可以出现在所述氨基酸序列的n末端和/或c末端，但不限于此。

还应当理解，不定冠词“一(a)”和“一(an)”不应理解为单数不定冠词或以其他方式排除多于一个或多个不定冠词所涉及的单个主题。例如，“一”蛋白质包括一种蛋白质、一种或多种蛋白质或多种蛋白质。

附图说明

图1.鲤鱼颗粒体蛋白-1的30残基的n末端结构域的三维结构。(a)pdb代码1qgm，β-链显示为紫色箭头，并且二硫键显示为黄色球棍形式(yellowballandstickformat)。使用molmol生成图像。(b)全长鲤鱼颗粒体蛋白-1蛋白中的二硫键连接⁷。半胱氨酸用连续的罗马数字i-xii表示。截短的鲤鱼颗粒体蛋白-1中的两个键以黄色突出显示。

图2.ov-grn-1截短类似物的序列和次级位移。(a)序列显示cysiv和cysvi被丙氨酸残基取代；半胱氨酸以红色突出显示，并且取代以蓝色显示。还提供了鲤鱼颗粒体蛋白-1的n末端30个残基，其中cysiv和vi被丙氨酸残基取代。序列标识符如下：ov-grn(1-35)＝seqidno:2；ov-grn(8-38)＝seqidno:3；ov-grn(12-34)＝seqidno:4；和ov-grn(12-35)＝seqidno:5。(b)具有四个半胱氨酸残基的ov-grn-1肽(ov-grn1-35、ov-grn8-38和ov-grn12-34)的次级位移。通过从αh位移中减去无规卷曲位移¹⁶得到次级位移。保守残基的次级位移的相似性表明三种肽中的总体折叠是相同的。配色方案保留在以下图式中。两张图：黑色连接线代表二硫键连接。

图3：ov-grn12-34和ov-grn12-35_3s的结构分析。(a)与鲤鱼颗粒体蛋白1-30相比，ov-grn12-34和ov-grn12-35_3s的次级位移。通过从αh位移中减去无规卷曲位移¹⁶得到次级位移。与ov-grn12-35_3s和鲤鱼1-30相比，ov-grn12-34具有显著不同的次级位移，并且缺乏正位移，表明缺乏β折叠结构。尽管序列不同，但ov-grn12-35_3s和鲤鱼1-30之间的次级位移的趋势是相似的，表明存在于鲤鱼颗粒体蛋白-1中的β折叠也存在于ov-grn12-35_3s中(黑色箭头)。(b)使用nmr光谱法确定ov-grn12-34和ov-grn12-35_3s的结构，并确认ov-grn12-34不含有β折叠结构，但ov-grn12-35_3s含有(蓝色箭头)。二硫键以黄色球棍图解表示，并且显示鲤鱼1-30的结构用于比较。残基ser17和ser27的侧链在鲤鱼1-30结构上突出显示，以指示cysiv和cysvi的cys-ser取代位点。基于这种结构，似乎鲤鱼1-30的cysiv和cysvi可能形成二硫键，这与ov-grn12-35_3s中可能的连接一致。

图4.肝吸虫颗粒体蛋白肽诱导细胞增殖。(a)如使用xcelligence监测的，麝猫后睾吸虫颗粒体蛋白肽而非鲤鱼颗粒体蛋白1-30诱导一系列浓度的h69人胆管上皮细胞在的增殖。仅绘制选定的治疗方法以帮助可视化。最佳拟合的可变斜率剂量反应线在单次施用治疗后4天时显示增殖。ov-grn12-35_3s效力通过在≥15nm的最终浓度下观察到的显著增加的细胞增殖(p<0.05)表征。黑色箭头表示图b中使用的400-483nm浓度。(b)在来自图a的400nm的所有ov-grn-1合成肽和483nmov-grn-1蛋白的平均增殖。ns＝不显著，****p<0.0001。两张图：使用针对多重比较的具有dunnett校正的双向anova检验来比较治疗和相关治疗对照(ov-grn-1蛋白相对于硫氧还蛋白表达匹配重组蛋白对照，和肽相对于肽对照)。从2-4个实验汇集的4-6个重复的平均值，其中为了清楚起见，sem条显示在上方或下方。

图5.ov-grn-1和肽的小鼠伤口愈合活性。(a+b)1.5％甲基纤维素凝胶中的56皮摩尔的重组ov-grn-1、ov-grn-1肽、无关肽、硫氧还蛋白(trx)蛋白对照和71皮摩尔regranex，以50μl体积从第0-4天起每天施用于由对两耳之间的头皮进行活检穿孔所产生的～0.2cm²伤口，得到治疗的伤口愈合结果。为了辅助可视化，将数据分成两个曲线图，这两个图中显示ov-grn-1和肽对照组。在任何时间点都没有记录到无关肽对照、pbs或trx蛋白质对照之间的显著差异。黑色箭头表示在图c中使用的第4天时间点。(c)从第4天起相对于pbs载体对照的伤口愈合。所有图：用sem条绘制的4-5只动物组的2-6个生物重复的平均愈合速率。群组向左或向右略微移动以帮助观看。使用针对多重比较的具有dunnett校正的重复测量双向anova检验将每个组与每个其他组进行比较。针对肽/蛋白质对照的显著性由以下表示：****＝p<0.0001，***＝p<0.001，**＝p<0.01，*＝p<0.05，ns＝不显著。针对regranex的显著治疗由#＝p<0.05表示。星号或井号的颜色代表相关组。颜色和符号在图2-5中保持不变。

图6.化学位移比较。截短形式的鲤鱼颗粒体蛋白¹⁴和具有c17a和c27a突变的突变体的公开位移之间的化学位移比较。

图7.颗粒体蛋白家族中保守的半胱氨酸框架。a)鲤鱼-1颗粒体蛋白中的二硫键连接模式。(b)合成n末端ov-grn-1肽(grn12-35_3s)中的二硫键连接模式。基于cysiv和cysvi之间的预测连接的grn12-35_3s中的非天然二硫键以红色突出显示；“---”可以是任何残基。

图8.工程肽的hplc迹线。所有肽在室温下自由空气氧化24小时后被氧化。对应于具有根据maldi光谱分析的预期分子量的收集的级分用*标记。

图9.与nh区域中的grn3ala相比，grn12-35_3s的tocsy二维nmr光谱。记录0.2mm浓度、290k和80ms的混合时间下的tocsy光谱。指派的残基用其残基名称和编号表示。通过grn12-35_3s采用多次确认产生的额外峰值被加框。

图10.与ov-grn12-35_3s相比，ov-grn12-35_3s工程肽的次级位移。通过从αh位移中减去无规卷曲位移得到次级位移。与ov-grn12-35_3s相比，次级位移的趋势是相似的，表明ov-grn12-35_3s中存在的β折叠保持在脯氨酸突变体类似物中。

图11.ov-grn12-35_3s(左)和grn3ala(右)的三维结构。使用nmr光谱法确定结构。脯氨酸2、脯氨酸4和脯氨酸10残基的侧链在ov-grn12-35_3s上突出显示。在grn3ala中，脯氨酸残基被丙氨酸取代，其中侧链被突出显示。

图12.工程化的ov-grn12-35_3s肽对h69细胞的体外细胞增殖的影响。用200nm肽浓度处理h69细胞48小时。如材料和方法中所述测量肽的增殖率，并且值以百分比给出。通过单向anova分析数据。显著性设定为nsp<0.05，**p<0.001，***p<0.001，****p<0.0001。与对照肽loop6对比，确定p<0.0001(ov-grn12-35_3s、grnp2a、grnp4a和grnp10a)和p＝0.90(grn3ala)的统计学上不同的值。

图13.ov-grn-1和肽的小鼠伤口愈合活性。(a)相对于56皮摩尔肽对照，从用1.5％甲基纤维素凝胶中的56皮摩尔的重组ov-grn-1、ov-grn-1肽、硫氧还蛋白(trx)蛋白对照和71皮摩尔regranex以50μl体积从第0-4天起每天施用于由对两耳之间的头皮进行活检穿孔所产生的～0.2cm²伤口所进行的治疗显示第4天的伤口愈合结果。(b)肽的氨基酸序列。grn27sps＝seqidno:10。

关于序列表的简要说明

seqidno:1截短的ov-grn-1肽的氨基酸序列。

seqidno:2ov-grn(1-35)肽的氨基酸序列。

seqidno:3ov-grn(8-38)肽的氨基酸序列。

seqidno:4ov-grn(12-34)肽的氨基酸序列。

seqidno:5ov-grn(12-35)肽的氨基酸序列。

seqidno:6grn(p2a)肽的氨基酸序列。

seqidno:7grn(p4a)肽的氨基酸序列。

seqidno:8grn(p10a)肽的氨基酸序列。

seqidno:9grn(3ala)肽的氨基酸序列。

seqidno:10grn27sps的氨基酸序列。

seqidno:11鲤鱼(1-30)肽的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明至少部分地基于截短形式的ov-grn-1和/或其变体的合成，从而确定它们的折叠性质及其在细胞增殖和伤口愈合中的活性。ov-grn-1的n末端区域显示出新颖的折叠性质和强的细胞增殖活性。一些这样的截短肽和变体已经在伤口愈合的小鼠模型中进行了测试，并且与全长蛋白质一样有效，并且与临床使用的伤口愈合剂regranex一样有效，甚至优于regranex。

因此，本发明的一个方面涉及一种分离肽，其包含、基本上由或由seqidno:1的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列组成。

出于本发明的目的，“分离的”是指已从其天然状态移除或以其他方式经受人为操作的材料。分离的材料可以大体上或基本上不含在其天然状态下通常伴随它的组分，或者可以被操作以便与在其天然状态下通常伴随它的组分一起处于人工状态。分离的材料可以是天然的、化学合成的或重组的形式。

“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是本领域所熟知的天然或非天然氨基酸、d-或l-氨基酸。

术语“蛋白质”包括并涵盖“肽”和“多肽”，“肽”典型地用于描述具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质，“多肽”典型地用于描述具有超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。本发明的一个实施方案提供了一种分离多肽，其包含seqidno:1的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列。

分离肽可包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

¹xnc²xd³xvytcr⁴xgqtcc/arglhgygc⁵xm(seqidno:1)，其中n为0-11且m为0-4；或与其至少70％相同的氨基酸序列。

应理解，当n为零时，不存在氨基酸。当n为1-10时，¹x为任何相同或不同的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，当n为4时，¹x＝rsps。

在一个实施方案中，当n为3时，¹x＝sps。

在一个实施方案中，当n为11时，¹x＝mdtlqpirsps。

应理解，当m为零时，不存在氨基酸。当m为1-4时，⁵x可以为任何相同或不同的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，当m为1时，⁵x＝c或a。

在一个实施方案中，当m为4时，⁵x＝apmd。

在另一个实施方案中，当m为4时，⁵x＝cpmd。

²x³x⁴x中的每一个可以分别为任何相同或不同的一个或多个氨基酸。

优选地，²x³x⁴x中的每一个独立地为p或a。

在一些优选实施方案中，²x³x⁴x中的至少一个、至少两个或每一个＝p。

在一些优选实施方案中，²x³x⁴x之一＝a。

在具体的实施方案中，分离肽包含、基本上由或由seqidno:1-10中任一个所示的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列组成。

由seqidno:2-5的各氨基酸序列组成的分离肽在本文中可称为：

seqidno:2ov-grn1-35，ov-grn(1-35)或grn1-35；

seqidno:3ov-grn8-38，ov-grn(8-38)或grn8-38；

seqidno:4ov-grn12-34，ov-grn(2-24)或grn2-24；

seqidno:5ov-grn12-35_3s，ov-grn(12-35)或grn12-35_3s。

参考实施例和图4和5，证明由seqidno:2-5组成的分离肽能够促进细胞增殖和/或伤口愈合的程度或水平与regranex一样高或更高。

在一些实施方案中，分离肽包含两个或三个链内二硫键。从图2中所示的氨基酸序列可以理解，seqidno:2-4包含形成两(2)个二硫键的四(4)个半胱氨酸残基，而seqidno:5包含形成三(3)个二硫键的六(6)个半胱氨酸残基。虽然不希望受限于任何特定理论，但提出seqidno:5的分离肽可以以与全长颗粒体蛋白相似的方式折叠。

由seqidno:6-8的各氨基酸序列组成的分离肽在本文中可称为：

seqidno:6ov-grnp2a，ov-grn(p2a)，grnp2a，grn24(p2a)；

seqidno:7ov-grnp4a，ov-grn(p4a)，grnp4a，grn24(p4a)；

seqidno:8ov-grnp10a，ov-grn(p10a)，grnp10a，grn(p10a)；

seqidno:6-8的每个氨基酸序列是seqidno:1的形式，其中²x³x⁴x之一是丙氨酸，而²x³x⁴x的其余部分是脯氨酸。参考实施例和表3，seqidno:6-8的每个氨基酸序列也是seqidno:5的氨基酸序列的变体，其中seqidno:5的相应单个脯氨酸残基已被丙氨酸残基取代。

在另一个实施方案中，分离肽包含、基本上由或由seqidno:9所示的氨基酸序列或其片段或变体组成。由seqidno:9的氨基酸序列组成的分离肽在本文中可称为ov-grn3ala、ov-grn(3ala)或grn3ala。seqidno:9的氨基酸序列是seqidno:1的形式，其中²x³x⁴x中的每一个是丙氨酸。参考实施例和表3，seqidno:9也是seqidno:5的氨基酸序列的变体，其中seqidno:5的三个脯氨酸残基中的每一个都被丙氨酸残基取代。

如实施例和图12所示，具有seqidno:6-8的氨基酸序列的分离肽以与具有seqidno:5的氨基酸序列的肽相同或更高的速率增强细胞增殖。然而，具有seqidno:9的氨基酸序列的分离肽不增强细胞增殖。

因此，在一些优选的实施方案中，分离肽包含seqidno:1所示的氨基酸序列，其中²x³x⁴x中的至少一个但优选少于三个是丙氨酸。优选地，²x³x⁴x之一是丙氨酸。优选地，²x³x⁴x中的至少一个是脯氨酸。

参考实施例和图9-10将进一步理解，具有seqidno:5-8的氨基酸序列的肽展示了具有氨基序列seqidno:9的肽中不存在的多重构象。不受理论束缚，据信这些多重构象是在seqidno:5-8中形成脯氨酸顺式/反式异构体的结果，但在seqidno:9中不是。这些多重构象可能有助于观察到的在具有seqidno:5-8的氨基酸序列的肽中存在的生物活性，但在具有seqidno:9的氨基酸序列的肽中不存在。

因此，在一些优选的实施方案中，分离肽能够形成脯氨酸顺式/反式异构体。

seqidno:10包含n末端氨基酸序列sps。seqidno:10在本文中可称为ov-grnsps、ov-grn(sps)、grnsps或grn27sps。

本发明还提供了分离肽，其包含与seqidno:1-10中的任一个至少70％相同的氨基酸序列，在本文中称为肽“变体”。

如本文所用，肽“变体”与seqidno:1-10中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。本文公开的肽“变体”可具有缺失或被不同氨基酸取代的一个或多个氨基酸。本领域熟知的是，可以取代或缺失一些氨基酸而不改变肽的生物活性(保守取代)。适当地，变体具有seqidno:1-10中任一个的分离肽的生物活性的至少50％,55％,60％,65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在特定的实施方案中，变体包含或能够形成两个或三个链内二硫键。

本文中一般用于描述各蛋白质和核酸之间的序列关系的术语包括“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。因为各核酸/蛋白质可以各自包含(1)核酸/蛋白质共有的完整核酸/蛋白质序列的仅一个或多个部分，和(2)核酸/蛋白质之间不同的一个或多个部分，所以序列比较典型地通过比较“比较窗口”上的序列来进行，以鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指典型地6、9或12个连续残基的概念性片段，其与参考序列进行比较。与用于各序列的最佳比对的参考序列相比，比较窗口可包括约20％或更少的添加或缺失(即空位)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实现(intelligenetics的geneworks程序；wisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0中的gap、bestfit、fasta和tfasta，geneticscomputergroup，575sciencedrivemadison，wi，usa，其通过引用并入本文)或通过所选择的各种方法中的任一种产生的检查和最佳比对(即导致比较窗口上的最高百分比同源性)来进行。还可以参考blast程序家族，例如altschul等人,1997,nucl.acidsres.253389所公开的，其通过引用并入本文。序列分析的详细讨论可以在currentprotocolsinmolecularbiologyausubel等人编(johnwiley&sonsincny,1995-2015)的单元19.3中找到。

术语“序列同一性”在本文中以其最广泛的含义使用，以包括考虑了使用标准算法的合适比对的精确核苷酸或氨基酸匹配的数目，考虑了序列在比较窗口上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”是如下计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在这两个序列中存在相同核酸碱基(例如a、t、c、g、i)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目(即窗口大小)，和将结果乘以100以得到序列同一性百分比。例如，“序列同一性”可以理解为意指由dnasis计算机程序(用于windows的2.5版；可从hitachisoftwareengineeringco.,ltd.,southsanfrancisco,california,usa获得)计算的“匹配百分比”。

本发明还提供了本文公开的分离肽的片段。在一些实施方案中，片段可包含、基本上由或由seqidno:1-10中任一个的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸组成。在特定的实施方案中，片段包含或能够形成两个或三个链内二硫键。

适当地，片段具有生物活性。优选地，片段具有seqidno:1-10中任一个的分离肽的生物活性的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

还提供了本文公开的分离肽的衍生物。如本文所用，“衍生物”蛋白质或肽已被改变，例如通过与其他化学部分缀合或复合、通过翻译后修饰(例如磷酸化、泛素化、糖基化)、化学修饰(例如交联、乙酰化、生物素化、氧化或还原等)、与标记(例如荧光团、酶、放射性同位素)缀合和/或包括其他氨基酸序列，如本领域所理解的。

在这方面，对于和蛋白质化学修饰有关的更广泛的方法，本领域技术人员参考currentprotocolsinproteinscience,coligan等人编(johnwiley&sonsny1995-2015)的第15章。

另外的氨基酸序列可包括产生融合蛋白的融合配偶体氨基酸序列。举例来说，融合配偶体氨基酸序列可以帮助检测和/或纯化分离的融合蛋白。非限制性实例包括金属结合(例如多组氨酸)融合配偶体、麦芽糖结合蛋白(mbp)、蛋白a、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、荧光蛋白序列(例如gfp)、表位标签如myc、flag和血凝素标签。

本发明的分离肽、变体和/或衍生物可以通过本领域已知的任何方法产生，包括但不限于化学合成和重组dna技术。

化学合成包括固相和溶液相合成。这些方法在本领域是众所周知的，尽管参考了syntheticvaccinesnicholson编(blackwellscientificpublications)的第9章和currentprotocolsinproteinsciencecoligan等人编(johnwiley&sons,inc.nyusa1995-2008)的第15章中提供的化学合成技术的实例。在这方面，还参考了国际公开wo99/02550和国际公开wo97/45444。

本领域技术人员可以使用标准方案方便地制备重组蛋白，例如sambrook等人,molecularcloning.alaboratorymanual(coldspringharborpress,1989)，尤其部分16和17；currentprotocolsinmolecularbiologyausubel等人编,(johnwiley&sons,inc.nyusa1995-2008)，尤其第10和16章；和currentprotocolsinproteinsciencecoligan等人编,(johnwiley&sons,inc.nyusa1995-2008)，尤其章节1、5和6中所述。

本发明的一个相关方面提供了一种增加修饰、变化或改变具有seqidno:1、seqidno:5或seqidno:10所示的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列的肽的方法，其包括将一个或多个氨基酸插入、缺失或取代掺入肽的氨基酸序列的步骤。

优选地，修饰、变化或改变肽增加或增强肽的一种或多种生物活性。在优选的实施方案中，生物活性选自对细胞增殖的活性和对伤口愈合的活性。

在其中根据此方面修饰的肽是具有seqidno:11所示的氨基酸序列的肽或其变体的某些优选实施方案中，该方法包括将缬氨酸残基插入肽的氨基酸序列和/或缺失缬氨酸残基的步骤。参考图2(a)，seqidno:2-5中所示的氨基酸序列的特征在于相对于seqidno:11所示的氨基酸序列的缬氨酸插入，其介于seqidno:11的cysi残基和cysii残基之间。另外，seqidno:2-5中所示的氨基酸序列的特征在于相对于seqidno:11所示的氨基酸序列的缬氨酸缺失，其介于seqidno:11的cysiii残基和cysiv残基之间。如图4-5中所示，相对于具有seqidno:11所示的氨基酸序列的肽，具有seqidno:2-5所示的氨基酸序列的肽表现出增加或增强的对于细胞增殖和/或伤口愈合的活性。

在其中根据此方面修饰的肽是具有seqidno:11所示的氨基酸序列的肽或其变体的某些优选实施方案中，该方法包括用半胱氨酸残基取代丙氨酸残基的步骤。优选地，丙氨酸/半胱氨酸取代在肽的氨基酸序列中产生半胱氨酸半胱氨酸基序。参考图2(a)，seqidno:5所示的氨基酸序列的特征在于相对于seqidno:11的丙氨酸的半胱氨酸取代。半胱氨酸取代位于seqidno:11的cysiii残基和cysiv残基之间，并在seqidno:5中形成半胱氨酸半胱氨酸基序。

在其中被修饰的肽是具有seqidno:5所示的氨基酸序列的肽或其变体的某些优选实施方案中，该方法包括用丙氨酸残基取代脯氨酸残基的步骤。参考表3，seqidno:6-8的特征在于相对于seqidno:5的脯氨酸的丙氨酸取代。如图12中所示，相对于具有seqidno:5所示的氨基酸序列的肽，具有seqidno:6-8中的每一个所示的氨基酸序列的肽显示细胞增殖率的更高的百分比增加。

本发明的另一方面提供了一种根据前述方面的方法产生的分离肽。优选地，所述分离肽具有增加或增强的生物活性。

本发明还提供了编码seqidno:1-10中任一个的分离肽的分离核酸，或包含所述分离肽或多个所述肽的分离多肽。

如本文所用的术语“核酸”表示单链或双链dna和rna。dna包括基因组dna和cdna。rna包括mrna、rna、rnai、sirna、crna和自催化rna。核酸也可以是dna-rna杂合体。核酸包含核苷酸序列，其典型地包括包含a、g、c、t或u碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可包括其他碱基，例如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿苷，但不限于此。

在一个方面，分离核酸处于遗传构建体中，所述遗传构建体包含与一种或多种其他遗传组分可操作地连接或相连的分离核酸。遗传构建体可适用于分离核酸的治疗性递送或适用于宿主细胞中的重组蛋白质产生。

概括地说，遗传构建体是质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的形式或包含质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的遗传组分，如本领域所熟知的。遗传构建体可适用于在细菌或其他宿主细胞中维持和繁殖分离核酸，适用于通过重组dna技术操作和/或表达本发明的核酸或编码的蛋白质。

出于宿主细胞表达的目的，遗传构建体是表达构建体。适当地，表达构建体包含与表达载体中的一个或多个另外的序列可操作地连接的本发明的核酸。“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体，例如质粒，或整合到宿主基因组中的载体。

“可操作地连接”是指所述一个或多个另外的核苷酸序列相对于本发明的核酸进行定位，优选地用于起始、调节或以其他方式控制转录。

调节核苷酸序列通常适用于用于表达的宿主细胞。本领域已知多种类型的适当表达载体和合适的调节序列用于多种宿主细胞。

典型地，所述一种或多种调节核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，以及增强子或激活子序列。

本发明考虑了本领域已知的组成型、可抑制型或诱导型启动子。

表达构建体还可以包括编码融合配偶体的另外的核苷酸序列(典型地由表达载体提供)，使得重组蛋白如上所述被表达为融合蛋白。

表达构建体还可以包括编码选择标志物的另外的核苷酸序列，所述选择标志物例如是amp^r、neo^r或kan^r，但不限于此。

在涉及将分离核酸递送至伤口或受试者的特定实施方案中，表达构建体可以是质粒dna的形式，其适当地包含可在动物细胞中操作的启动子(例如cmv、αa-晶体蛋白或sv40启动子)。在其他实施方案中，核酸可以是病毒构建体的形式，例如腺病毒载体、牛痘载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。

在另一方面，本发明提供了一种用本文所述的核酸分子或遗传构建体转化的宿主细胞。

用于表达的合适宿主细胞可以是原核的或真核的。例如，合适的宿主细胞可包括但不限于哺乳动物细胞(例如hela、cos、nih-3t3、hek293t、jurkat细胞)、酵母细胞(例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae))、有或没有杆状病毒表达系统的昆虫细胞(例如sf9、粉纹夜蛾(trichoplusiani))、植物细胞(例如莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)、三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum))或细菌细胞，例如大肠杆菌。将遗传构建体引入宿主细胞(无论是原核的还是真核的)是本领域熟知的，例如在currentprotocolsinmolecularbiologyausubel等人编,(johnwiley&sons,inc.1995-2015)，尤其是章节9和16中所述。

在特定方面，本发明提供了本文公开的分离肽用于促进细胞增殖、迁移和/或伤口愈合的用途，所述分离肽例如包含seqidno:1-10中任一个的氨基酸序列或与其至少70％相同的氨基酸序列。还提供了编码本文公开的分离肽的核酸或包含其的遗传构建体或载体用于促进细胞增殖、迁移和/或伤口愈合的用途。

本发明的一个方面提供了一种促进细胞增殖和/或迁移的方法，所述方法包括使一种或多种细胞与分离肽或编码核酸接触从而引发、刺激或促进一种或多种细胞的细胞增殖和/或迁移的步骤。

本发明的另一方面提供了一种愈合伤口的方法，所述方法包括使伤口与分离肽或编码核酸接触从而至少部分地愈合伤口的步骤。

因此，本文公开的分离肽可以促进有助于受试者的伤口愈合的细胞的增殖和/或迁移。这可以替代地或另外地包括促进细胞向伤口迁移，从而有助于伤口愈合。这些细胞可包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、表皮细胞、角质形成细胞、树突细胞(例如朗格汉斯细胞)、血管细胞、成纤维细胞、血小板、淋巴细胞和/或任何这些细胞的祖细胞，但不限于此。

如本文通常所使用的，“伤口”可以是对外皮系统如皮肤的任何破坏性磨损或物理裂口，并且包括切口、损伤、溃疡和烧伤。

在某些实施方案中，本发明提供了伤口的治疗，所述伤口包括擦伤、切口、损伤、溃疡和烧伤。“治疗”是指至少部分地改善、减少、去除或抑制疾病、病症或病状的一种或多种症状或结果的治疗性作用过程。在一些实施方案中，治疗可以替代地或另外地包括预防，通过该预防至少部分地预防疾病、病症或病状的一种或多种症状或结果的复发或再现。

在一些实施方案中，使伤口与分离肽或编码核酸接触的步骤可包括将分离肽或编码核酸全身施用于受试者或将分离肽或编码核酸局部施用于伤口。

在一些实施方案中，为了向受试者施用，分离肽或编码核酸可以是药物组合物的形式，其包含分离肽或编码核酸以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

“载体、稀释剂或赋形剂”通常是指可以安全地用于全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂、溶剂、载体或包封物质。根据具体的施用途径，可以使用本领域熟知的各种载体。这些载体可选自包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、助流剂、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐(例如无机酸盐，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐，有机酸，例如乙酸、丙酸和丙二酸)以及无热原水的组。

描述载体、稀释剂和赋形剂的有用的一般参考文献是remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingco.n.j.usa,1991)，其通过引用并入本文。

预期任何合适的程序用于制备组合物，例如疫苗组合物。示例性程序包括例如newgenerationvaccines(1997,levine等人,marceldekker,inc.newyork,basel,hongkong)中描述的那些，该文献通过引用并入本文。

可以采用任何安全的给药途径为动物提供本发明的组合物。例如，可以使用局部、口服、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、鼻内、关节内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内和透皮给药。

剂型包括片剂、分散剂、悬浮剂、油膏、软膏、乳膏、糊剂、分散剂、注射剂、溶液剂、糖浆剂、锭剂、胶囊剂、鼻喷雾剂、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型还可包括注射或植入专门为此目的设计的控制释放装置或经修改以另外以这种方式起作用的其他形式的植入物。治疗剂的控制释放可以通过例如用疏水聚合物包衣治疗剂来实现，所述疏水聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。另外，控制释放可以通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球来实现。

适于给药的组合物可以作为离散单元存在，例如胶囊、囊片、小袋、功能性食品/饲料或片剂，或作为粉末或颗粒或作为溶液或在水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液中的悬浮液。

组合物可以以与剂量制剂相容的方式和以免疫学有效的量施用。施用于受试者的剂量应足以在适当的时间段内在受试者中实现有益的应答。待施用的药剂的数量可取决于待治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况，这些因素将取决于从业者的判断。

如本文通常使用的，“受试者”可以是包括哺乳动物，优选人的任何动物。兽医应用可适用于动物如鱼、家禽、家养宠物、赛马、牲畜和其他非人受试者的伤口愈合，但不限于此。

在又一个方面，本发明提供了一种产生促进细胞增殖、迁移和/或伤口愈合的药剂的方法，所述方法包括鉴定、工程化、筛选或设计本文公开的分离肽的类似物、模拟物或激动剂的步骤，所述类似物、模拟物或激动剂促进细胞增殖、迁移和/或伤口愈合。

应理解，本发明提供了对ov-grn-1折叠的了解，并且n末端区域有助于生物活性。鉴于难以大量生产ov-grn-1，维持或增加生物活性的衍生自蛋白质的肽(例如seqidno:1-10)的开发可以促进鉴定、工程化、筛选或设计分离肽的类似物、模拟物或激动剂，其可以是用于开发新颖伤口愈合剂的先导分子。

所述药剂可以是具有细胞增殖、迁移和/或伤口愈合活性的肽或其他蛋白质、小有机分子、单糖、寡糖或多糖、脂质、核酸或这些的组合，其至少部分地模拟本文公开的分离肽。在一些有利的实施方案中，当将分子与分子比较时，药剂的生物活性可以大于分离肽的生物活性。

在一些实施方案中，可以基于期望的或预测的结构特性或特征从头合理地设计或工程化所述药剂，所述期望的或预测的结构特性或特征指示所述药剂具有至少部分模拟本文公开的分离肽的细胞增殖、迁移和/或伤口愈合活性。在其他实施方案中，可以通过在不基于期望的或预测的结构特性或特征进行初始筛选的情况下筛选分子文库来鉴定药剂，所述期望的或预测的结构特性或特征指示所述药剂具有至少部分模拟本文公开的分离肽的细胞增殖、迁移和/或伤口愈合活性。此类文库可包含随机产生或定向的蛋白质文库、肽文库、核酸文库、噬菌体展示文库、天然存在的分子文库和/或合成有机分子的组合文库。

适用于候选调节剂的设计和/或筛选的技术的非限制性实例可以采用x射线晶体学、nmr光谱法、结构数据库的计算机辅助筛选、计算机辅助建模，或检测、建模或预测分子折叠和/或结合相互作用的生物化学或生物物理技术，如本领域所熟知的。

鉴定分子相互作用的生物物理和生物化学技术包括竞争性放射性配体结合测定、共免疫沉淀、基于荧光的测定(包括荧光共振能量转移(fret)结合测定)、电生理学、分析超速离心、标记转移、化学交联、质谱法、微量量热法、表面等离子体共振和基于光学生物传感器的方法，例如在currentprotocolsinproteinsciencecoligan等人编(johnwiley&sons,1997-2015)的第20章中提供的。例如双杂交和噬菌体展示筛选方法的生物化学技术在currentprotocolsinproteinsciencecoligan等人编(johnwiley&sons,1997-2015)的第19章中提供。

应当理解，如本文所公开的鉴定、工程化、筛选或设计的药剂可适用于如前所述的促进细胞增殖、迁移和/或伤口愈合的方法中。

还提供了特异性结合本文公开的分离肽的抗体或抗体片段。“特异性结合”是指抗体或抗体片段以比另一种蛋白质(例如野生型颗粒体蛋白)显著更高的亲和力结合分离肽。

如本领域所熟知的，抗体可以是多克隆的或单克隆的。抗体片段包括单链片段，例如scfv片段、fab和fab'2片段、双功能抗体和三功能抗体，但不限于此。可以通过用分离肽免疫接种接着纯化血清抗体来产生多克隆抗体。单克隆抗体可以通过用分离肽免疫接种，然后进行脾细胞融合和抗体纯化来产生，或者可以通过重组dna技术产生。重组抗体或抗体片段可以被工程化以包含期望的抗原结合氨基酸序列(例如cdr序列)和/或被修饰以促进对特定受试者的给药，从而降低对抗体的异种部分(例如人源化的)引起不需要的免疫应答的可能性。

因此，可以充分理解本发明并将其付诸实践，参考以下非限制性实施例。

实施例

实施例1.开发基于颗粒体蛋白支架的有效伤口愈合剂

材料和方法

肽合成和纯化

使用芴基甲氧基羰基(fmoc)化学法，使用手动固相肽合成法合成截短的颗粒体蛋白肽。将肽组装在2-氯三苯甲基氯树脂(auspep，australia)上。使用2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu-irisgermany)在肽级二甲基甲酰胺(dmf-auspep，australia)中活化氨基酸。使用95％tfa/2.5％tips/2.5％h2o的混合物裂解肽。通过用氮气蒸发除去tfa，并将冰冷的乙醚加入到残余物中。过滤除去乙醚，并将肽溶于含有0.1％三氟乙酸(tfa)的40％乙腈/水混合物中，然后冷冻干燥。在c-18制备柱(phenomenexjupiter10μmc18250×21.2mm)上用反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化得到的粗肽。使用1％/分钟的0％-80％溶剂b(h2o中0.045％tfa中的90％乙腈)和溶剂a(h2o中的0.045％tfa水溶液)的梯度，并在215和280nm下监测洗脱液。通过搅拌肽在含有5mm还原型谷胱甘肽的100mm碳酸氢铵(ph8.2)中的溶液使肽氧化，并在室温下放置过夜，并使用rp-hplc在c-18制备柱(phenomenexjupiter10μmc18250×21.2mm)上纯化。

为了证实截短肽的二硫键连接，合成了具有对半胱氨酸残基的选择性保护的ov-grn12-34。cys1和cys14用acm基团进行侧链保护，并且cys8和cys23用(trt)保护基团进行侧链保护。在裂解和纯化粗肽后，在100mm碳酸氢铵中形成cys8和cys23之间的二硫键，并使用上述程序纯化肽。随后通过在4℃下在0.5mltfa、10μl苯甲醚和25mg三氟甲磺酸银中搅拌2mg肽1.5小时来除去s-acm基团。向混合物中加入冷乙醚(10ml)，并离心收集沉淀物。将沉淀物用乙醚洗涤两次，并使用50％dmso的0.5mhcl溶液在不经进一步纯化的情况下氧化过夜。将溶液用水稀释15倍，并在c-18制备柱(phenomenexjupiter10μmc18250×21.2mm)上通过使用1％acn梯度的hplc纯化完全折叠的肽。

在大肠杆菌中自动诱导重组蛋白表达

将pet32a(novagen)质粒中含有的ov-grn-1pet41a或大肠杆菌硫氧还蛋白(trx)cdna转染到bl21大肠杆菌细胞(lifetechnologies)中并用于产生具有所述的自动诱导的重组蛋白^4,22。简而言之，zym-5052培养基补充有100μmfe(iii)cl3和100μg/l卡那霉素以产生重组蛋白(rov-grn-1)或50μg/l氨苄青霉素以产生trx。将一升带挡板的erlenmeyer烧瓶中的两百(200ml)接种后培养基在37℃在300rpm旋转下孵育过夜，以通过自动诱导来诱导表达。

重组蛋白纯化

使用akta10纯化系统在4℃(gehealthcare)实现rov-grn-1的纯化²³。bl21大肠杆菌沉淀用3次冷冻/解冻循环溶解，然后在冰上用q4000单元(qsonix)超声处理。在4℃下在缓慢搅动下将二十(20)克得到的不溶性沉淀在400ml含有尿素的镍结合缓冲液(8m尿素/300mmnacl/50mm咪唑/50mm磷酸钠ph8[sigma])中溶解24小时。将0.22μm过滤的上清液通过2×5mlhistrapimac镍柱(gehealthcare)并用增加的咪唑浓度(两倍柱体积[cv]，50mm/5cv，100mm)洗涤，并用结合缓冲液中的500mm咪唑洗脱。以相同的方式但在天然条件(不含离液剂)下表达对照trx蛋白，并用histrapimac镍柱纯化²³。

蛋白质重折叠和纯化

如上所述，在xk16/20柱(ge)上用28mlg10sephadex(ge)树脂进行尿素变性的rov-grn-1的重折叠²³。使用120mlsuperdex30xk16/60柱(ge)在1ml/min的流速下将3ml重折叠的rov-grn-1分级分离到150mmnacl、50mm磷酸钠ph6中。汇集在～1kda(基于颗粒体蛋白的折叠，尽管变性分子大小为10.4kda)的尺寸当量(sizeequivalent)下洗脱的含有rov-grn-1单体的级分。通过微孔板bradford测定(biorad)和280nm下的吸光度的组合测定蛋白质浓度。

nmr光谱法和结构测定

将纯化的肽溶于90％h2o/10％d2o中，以得到～0.2mm原液。使用配备有低温冷却探头的600mhzavanceiiinmr光谱仪(bruker,karlsruhe,germany)在290k下获得2d¹h-¹htocsy、¹h-¹hnoesy、¹h-¹hdqf-cosy、¹h-¹⁵nhsqc和¹h-¹³chsqc光谱。以1秒的扫描间延迟记录光谱。以200ms的混合时间获得noesy光谱，并且以80ms的各向同性混合期获得tocsy光谱。基于wuthrich等人²⁵描述的方法，使用ccpnmr²⁴指派所有光谱。通过从实验αh化学位移减去wishart等人²⁶的无规卷曲¹hnmr化学位移来确定αh次级位移。

确定了ov-grn12-34和ov-grn12-35_3s的三维结构。自动指派2dnoesy光谱，并使用程序cyana²⁷计算结构集合。使用talos+预测的扭转角约束用于结构计算中。二硫键连接(cys1-cys14、cys8-cys23)被包括在ov-grn12-34的计算中，因为这些键通过半胱氨酸残基的选择性保护被证实。半胱氨酸残基的选择性保护不用于ov-grn12-35_3s，试图分离最有能量的有利形式。因此，用15种可能的二硫键连接计算结构。对cyana目标函数进行了分析，以确定最可能的连接。使用molmol²⁸使结构可视化。

哺乳动物细胞培养

非恶性胆管上皮细胞系h69是源自人肝脏的sv40转化的人胆管上皮细胞系，由明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所的gregoryj.gores博士友情提供。如所描述的³¹但稍作修改，将h69细胞^23,29,30以单层形式维持在t75cm²通气烧瓶(corning)中。使用0.25％胰蛋白酶(lifetechnologies)每隔2-5天在完全培养基[rpmi(sigma)，含有补充有生长因子的专业完全培养基³⁰[dmem/f12，含有高葡萄糖、10％fcs、1×抗生素/抗真菌剂、25μg/ml腺嘌呤、5μg/ml胰岛素、1μg/ml肾上腺素、8.3μg/ml全转铁蛋白(holo-transferrin)、0.62μg/ml氢化可的松、13.6ng/mlt3和10ng/mlegf-lifetechnologies]中维持细胞定期分裂。用于细胞增殖测定的低营养培养基是5％完全培养基，即0.5％fcs和上文对于完全培养基列出的1/20^th生长因子浓度。通过2015年1月的单串联重复(str)分析(2个等位基因的15/15个阳性位点)和在dna诊断中心(ddc)-医学(美国)可自由获取的支原体(由cap授权/认证，通过aclass的iso/iec17025:2005)证实了细胞系的身份(人源的)。

使用xcelligence实时监测细胞增殖

将细胞以1,500个细胞/孔接种于e-平板(aceabiosciences)中的180μl完全培养基(上文)中并生长过夜，同时用xcelligencesp系统(aceabiosciences)监测，其通过测量整合到组织培养板基部的整个指型金微电极上的电阻抗来实时监测细胞事件³²。用pbs洗涤细胞三次，然后加入180μl低营养培养基(上文)，并在进一步处理前孵育最少6小时。以10×浓度制备处理，并以20μl的总体积加入每个孔中。xcelligence系统在处理后以1小时的间隔记录细胞指数持续5-6天。在处理之前将细胞指数的读数标准化，并从生物四重复确定细胞增殖比率，其表示在第4天与对照细胞相比的细胞的相对数量。使用graphpadprism6.02，使用双向anova测试和dunnett多重比较校正完成响应于处理的细胞增殖诱导的比较。

小鼠伤口测定

如所描述的⁶，这些研究是在詹姆斯库克大学小动物伦理委员会的批准下(申请a1806和a2204)进行的。简而言之，每组4-5只雌性balb/c小鼠被麻醉(腹膜内甲苯噻嗪16mg/kg；氯胺酮80mg/kg)，之后使用5mm活检穿孔器在头顶上造成皮肤深层伤口(zivicinstruments)。施用必达净(betadine)液体消毒剂(赛诺菲(sanofi))，然后施用50μl，其含有71皮摩尔regranex(71皮摩尔治疗等于1μg/0.25cm²伤口，如制造商施乐辉(smithandnephew)所推荐)、56皮摩尔rov-grn-1、ov-grn-1肽、对照肽(eadrkydevarklamveadl)、悬浮于1.5％甲基纤维素(西格玛)中的trx或pbs。每天拍摄伤口，并且在对治疗组施行盲法后，用imagej软件测量病变区域，并绘制为来自原始伤口图像的伤口闭合百分比。使用graphpadprism6.02，用dunnett校正的双向anova检验比较伤口率的速率以用于多重比较。每个小鼠伤口研究至少进行两次以提供再现性。

结果

设计和合成截短的ov-grn-1肽

为了确定ov-grn-1的n末端区域是否可以独立折叠，使用fmoc化学设计和合成了几种截短的肽。合成肽的序列如图2a所示。

ov-grn1-35、ov-grn8-38和ov-grn12-34都含有四个半胱氨酸残基，相当于全长蛋白质中的cysi、cysii、cysiii和cysv(对于报告的其余部分，罗马数字是指全长蛋白质中存在的编号)。基于鲤鱼颗粒体蛋白-1⁷的三维结构，预测cysiv和cysvi分别与cysvii和cysix形成二硫键。在截短的类似物中，cysiv和cysvi被丙氨酸残基取代，以防止这些残基之间形成二硫键。使用半胱氨酸残基的选择性保护来指导折叠以形成预测的二硫键连接(即cysi-cysiii和cysii-cysv)。

ov-grn-1含有在大多数颗粒体蛋白中不存在的延伸的n末端尾巴(第一个半胱氨酸残基之前的11个残基)，并且这些残基被包括在ov-grn1-35中以确定它们是否在生物活性中起作用。n末端被截短并且c末端在ov-grn8-38中延伸，以提供与鲤鱼颗粒体蛋白-1截短肽具有相似数目残基的类似物。ov-grn12-34是含有四个半胱氨酸残基(cysi，cysii，cysiii和cysv)的最小序列，并且被设计用于确定n末端区域和c末端区域是否是折叠和活性所必需的。

合成另外的肽(ov-grn12-35_3s)，其具有截短的n末端，但含有ov-grn-1的前六个半胱氨酸(“3s”是指肽中存在三个二硫键)。就半胱氨酸残基而言，该肽类似于哺乳动物的paragranulin(上文)。它是在没有选择性保护半胱氨酸残基的情况下合成的，并且纯化了主要构象以分析其结构和活性。

用nmr光谱法进行结构分析

nmr光谱法用于分析肽的结构。尽管形成了两个天然二硫键，但ov-grn1-35、ov-grn8-38和ov-grn12-34的一维光谱在酰胺区域中的分散有限，与缺乏β折叠结构一致。使用二维光谱(tocsy和noesy)来指派共振，并且通过从αh位移中减去无规卷曲位移¹⁶来确定次级位移。如图2b所示，次级位移在这三种肽的等效残基间相似，表明结构相似，并且因此这些肽的n末端和c末端的差异不影响整体折叠。此外，次级位移与缺乏β折叠结构一致，因为它们主要是负值，而β折叠结构的特征在于正次级位移。使用nmr光谱法确定ov-grn12-34的三维结构，如图3a所示。与特征性颗粒体蛋白折叠相反，该结构包括转角和310螺旋区域。结构统计数据提供于补充表2。

与含有两个二硫键的ov-grn-1肽相比，具有三个二硫键的ov-grn12-35_3s在一维nmr光谱中在酰胺区域中具有更多的分散。此外，光谱中存在另外的峰，可能是由于脯氨酸残基的异构化。尽管存在这些另外的峰，但主要构象被完全指派，并且次级位移类似于截短的鲤鱼颗粒体蛋白-1¹⁴(图3b)，这表明总体结构的相似性。先前已合成了cysiv和cysvi被丝氨酸残基取代的包含残基1-30的截短的鲤鱼颗粒体蛋白-1，并且其显示形成β折叠结构¹⁴。在这里，我们合成了cysiv和cysvi被丙氨酸残基取代的鲤鱼颗粒体蛋白1-30，以与ov-grn-1的截短肽一致。具有丝氨酸取代的鲤鱼颗粒体蛋白-1的公布的¹⁴化学位移和具有丙氨酸取代的肽之间仅有微小的变化(图6)，表明总体折叠仍然保持。

为了确认ov-grn12-35_3s的结构是否与鲤鱼颗粒体蛋白1-30相似，使用cyana计算三维结构。最初在没有二硫键约束的情况下计算结构。在这些结构中，β-发夹存在于残基14-23中，但残基1-8未定义。缺乏残基1-8的定义阻止了对洞察最可能的连接的硫-硫距离的分析。因此，使用替代方法，其中用15种可能的二硫键连接计算结构。该方法先前已用于富含二硫化物的肽，例如大环寡肽(cyclotide)，以分析二硫键连接^17,18。表1中显示了用于ov-grn12-35_3s的15种连接的cyana目标函数。最低cyana目标函数的连接是cysi-cysiii、cysii-cysv和cysiv-cysvi。具有这种连接的ov-grn12-35_3s的三维结构显示在图3a中，并且结构统计数据提供在补充表s1中。分子中界定最明确的区域是残基14-23之间的β-发夹。包含cysi和cysii的n末端区域显示出显著的结构紊乱。

细胞增殖

使用xcelligence技术评估ov-grn-1肽对h69胆管上皮细胞增殖的实时影响，并确定肽的剂量反应曲线。与对照肽相比，最终浓度为2μm的ov-grn12-35_3s导致细胞生长增加41％(p<0.0001)(图4a)。用ov-grn12-35_3s处理观察到类似于对ov-grn-1获得的剂量反应曲线，其特征在于在≥15nm的最终浓度下显著增加的细胞增殖(p<0.05)。两个二硫键键合的ov-grn-1肽在纳摩尔浓度下的效力较低，但在2μm时促进显著的细胞增殖(比肽对照高14-25％；p<0.01)，剂量反应曲线由ov-grn12-34代表(图4a)。

这与在所有测试浓度下诱导最小细胞增殖(非显著)并且在32nm下诱导比肽对照高9％的最大增殖的鲤鱼颗粒体蛋白1-30形成对比。所有ov-grn肽(图4b)在400nm时的反应突出了三个二硫键结合肽(ov-grn12-35_3s)比两个二硫键结合肽具有增强的效力。与诱导最小增殖的其余肽相比，ov-grn12-35_3s促进细胞增殖的高度显著(p<0.0001)增加(比肽对照增加26％)，其余肽中最有效的是ov-grn1-35(比肽对照高9％的非显著增加)。

小鼠伤口愈合模型

在伤口愈合的小鼠模型中测试用甲基纤维素配制的截短的ov-grn-1肽。与甲基纤维素中的对照肽相比，当局部施用时，所有ov-grn-1肽都显示出有效的活性(图5a，b)。与第2-4天的肽对照相比，ov-grn-1肽、ov-grn-1蛋白和regranex显著改善愈合(p<0.05)。随着伤口闭合，治疗之间的差异减弱，并且在第4天之后显著差异不明显。regranex和各种颗粒体蛋白肽显示出几乎相同的最佳拟合曲线，并且完整的ov-grn-1是此处测试的唯一化合物，其在第3天和第4天提供了相对于regranex的显著改善(p<0.05；图5b)。在用甲基纤维素配制的各种阴性对照组之间未观察到显著差异，所述阴性对照组包括pbs载体对照、肽对照和硫氧还蛋白(trx)重组蛋白质对照。

当关于来自每个生物重复的pbs载体评估第4天的愈合时，与对照相比，用ov-grn-1蛋白和肽处理伤口显著加速伤口愈合(在第4天p<0.01：比pbs高26-41％)。尽管ov-grn-1蛋白、ov-grn1-35和ov-grn12-34(比pbs高37-41％)与regranex(比pbs高29％)相比提供了改善的愈合，但这些比较在第4天的时间点时均未达到显著性。

讨论

鉴于该蛋白质家族的序列和结构变异，阐明颗粒体蛋白的结构/活性关系一直是具有挑战性的。具有生物活性的区域知之甚少，并且关于该生长因子的潜在受体仍存在不确定性^19,20。

与其他颗粒体蛋白相比，ov-grn-1似乎具有不同的折叠途径。与鲤鱼颗粒体蛋白-1和人颗粒体蛋白a相反，包含两个天然二硫键(cysi-cysiii和cysii-v)的ov-grn-1的n末端区域不会独立地折叠成天然样β-发夹结构。值得注意的是，在ov-grn12-35_3s中引入第三个非天然二硫键导致类似于鲤鱼颗粒体蛋白-1和人颗粒体蛋白a肽中存在的β-发夹结构^14,15。除了cysiv-cysvi二硫键之外，ov-grn12-35_3s的二硫键连接似乎包含两个天然二硫键(cysi-cysiii和cysii-v)。如果键对在物种^7,9之间是保守的，则预测后一个键不存在于全长ov-grn-1中，因为预测cysiv与cysvii结合和cysvi与cysix结合。

哺乳动物颗粒体蛋白前体的paragranulin(半颗粒体蛋白)结构域含有ov-grn12-35_3s中存在的等同的六个半胱氨酸残基，并且是生物活性的²¹，这表明ov-grn12-35_3s可能含有相同的二硫键连接。鲤鱼颗粒体蛋白1-30肽可能含有这种cysi-cysiii、cysii-cysv、cysiv-cysvi连接¹⁴。尽管鲤鱼颗粒体蛋白1-30肽仅含有两个天然二硫键(cysi-cysiii和cysii-cysv)，但结构分析表明，取代cysiv和cysvi的丝氨酸残基的侧链非常接近，并暗示这些半胱氨酸残基形成二硫键是可行的。

ov-grn12-35_3s中的二硫键连接对全长ov-grn-1的结构具有影响，其尚未通过实验确定，因为没有足够量的正确折叠的重组材料。因此，尚未显示天然蛋白质的二硫键连接符合针对鲤鱼颗粒体蛋白-1最初显示的连接⁷。可以想象该蛋白质含有包含前六个半胱氨酸残基(相当于ov-grn12-35_3s中所见的)的二硫键结构域，以及含有最后六个半胱氨酸残基的第二结构域。没有全长蛋白质的结构和与寄生虫分泌的天然蛋白质的比较，这仍然是推测。然而，之前的报告揭示了颗粒体蛋白的二硫键连接的模糊性^9,15。人颗粒体蛋白a和f的结构具有明确界定的n末端区域，但无序的c末端区域阻止了所有二硫键的表征。此外，人颗粒体蛋白a的二硫键连接的化学分析是不确定的⁹。

除了提供对ov-grn-1折叠的深入了解之外，目前的研究还揭示了n末端区域有助于生物活性，并且ov-grn12-35_3s的β-发夹进一步增强了细胞增殖活性。然而，因为鲤鱼颗粒体蛋白1-30肽含有双β-发夹并且与ov-grn-1肽相反，在测试的8种浓度(10nm-2μm)下不显示显著的增殖，所以β-发夹结构与增殖活性完全无关。鲤鱼颗粒体蛋白-1与ov-grn-1的序列比较揭示了在cysi和cysvi之间仅存在两个保守的非半胱氨酸残基。环序列中缺乏保守性可能解释了折叠和生物活性上的差异。

尽管缺乏天然结构，但含有两个二硫键的ov-grn-1肽在高浓度(>800nm)下促进细胞增殖，并刺激小鼠皮肤伤口的显著愈合。ov-grn12-35_3s是细胞增殖测定中最有效的肽，但在体内不比其他ov-grn-1肽更具活性。如果ov-grn12-35_3s的β-发夹参与体内伤口愈合，我们没有观察到小鼠中的差异。细胞增殖活性可能是细胞系特异性的，或者小鼠伤口修复中测试的浓度不是最佳的。在任一种情况下，在小鼠中观察到的活性可能比体外分析的结果具有更大的生物学和治疗重要性。在未来，我们设想探索来自不同器官和组织的一系列细胞，并研究表现出伤口愈合缺陷的小鼠，以增加我们对ov-grn-1结构-活性关系的作用的理解。

总之，用nmr光谱法进行的结构分析表明，与其他颗粒体蛋白相比，ov-grn-1表现出独特的折叠性质，可能是由一级序列引起的。我们已经鉴定出ov-grn-1的生物活性区域，其可能比全长重组蛋白质具有更低的免疫原性并且更容易生产。维持生物活性的肝吸虫颗粒体蛋白的肽和衍生物代表了鉴定治疗伤口的新颖疗法的关键进展。

总结

在分析ov-grn-1的生物活性区域期间，合成了一组四个截短的类似物，并使用nmr光谱法在结构上进行表征。包含两个或三个二硫键的衍生自ov-grn-1的n末端区域的肽促进人胆管上皮细胞细胞系的增殖并在小鼠中显示出有效的伤口愈合。来自ov-grn-1的仅含有两个天然二硫键的肽缺乏颗粒体蛋白的β-发夹结构特征。值得注意的是，引入非天然二硫键对于形成β-发夹结构至关重要。衍生自ov-grn-1的肽是新颖伤口愈合药物的极佳先导物，因为它们可能比全长蛋白质具有更低的免疫原性并且更便于生产。

实施例2.对肝脏吸虫来源的颗粒体蛋白的折叠的深入了解

介绍

颗粒体蛋白是富含二硫键的蛋白质大家族，其具有多种生物学功能，包括影响细胞生长³³。在颗粒体蛋白结构域中存在有限的序列保守性，但都含有12个半胱氨酸残基，具有保守的框架³⁴。就结构而言，研究得最好的颗粒体蛋白是鲤鱼颗粒体蛋白-1，其显示用六个二硫键钉在一起的β-发夹堆叠(图7-a)³⁵。尽管存在保守的半胱氨酸框架，但是结构/功能关系是复杂的，一些颗粒体蛋白结构域显示细胞增殖活性，一些对细胞生长具有抑制作用^36,37。

从麝猫后睾吸虫中分离的肝吸虫颗粒体蛋白ov-grn-1显示出体内的有效伤口愈合活性³⁴，但重组表达中的低产率限制了其作为治疗剂的发展。阐明结构/功能关系也受到了难以产生用于研究的大量数量的影响。然而，我们已经显示ov-grn-1的截短类似物代表功能性模拟物³⁴，其具有治疗其中正常组织修复机制不堪重负的慢性伤口例如糖尿病溃疡^38-41的潜力。

虽然我们的截断ov-grn-1类似物已经开始提供对折叠和生物活性区域的深入了解，但是关于二级结构形成和结构稳定性的重要特征仍然存在问题。例如，对应于ov-grn-1中残基12-35的肽(ov-grn12-35_3s)与截短形式的鲤鱼颗粒体蛋白-1³⁴相比仅包含一个β-发夹。有趣的是，该肽含有基于预测的连接的非天然二硫键，并且该键在二级结构稳定中的作用尚不完全清楚(图7-b)。ov-grn12-35_3s还显示nmr光谱中另外构象的证据。这些另外的构象可能是脯氨酸顺式/反式异构化的结果，但需要进一步研究以确定涉及哪些脯氨酸残基。在目前的研究中，我们使用突变研究来确定脯氨酸残基在结构、折叠和活性中的作用。确定结构最稳定和最有效的类似物可能有助于开发作为新颖伤口愈合剂的衍生自ov-grn-1的肽。

材料和方法

肽合成、纯化和表征

通过proteintechnologiesps3合成仪上的逐步固相肽合成程序合成颗粒体蛋白类似物。使用hctu(iris，germany)活化fmoc氨基酸衍生物(auspep，australia)，并将其在2-氯三苯甲基氯树脂上与dipea/dmf偶联。使用以下裂解混合物将肽从树脂上裂解：95％tfa:2.5％tips:2.5％dh2o。在下一步中，用冰冷的乙醚沉淀肽并溶解在50％乙腈:50％dh2o(0.1％tfav/v)中，随后冻干。使用c-18制备柱(phenomenexjupiter250×21.2mm)和含有0.05％tfa(v/v)的乙腈-水混合物的1％梯度，通过反相hplc纯化得到的白色粉末。在214和280nm处监测洗脱液，并使用malditof/tof光谱仪测定质量。

二硫化物形成

通过在室温下在含有5mm还原型谷胱甘肽的0.1m碳酸氢铵(ph8-8.2)中将0.1mg/ml肽过夜空气氧化24小时形成二硫键。将溶液酸化，过滤并在c-18制备柱上使用rp-hplc纯化，并使用5800malditof/tof光谱仪分析肽质量。

nmr光谱法和结构分析

在90％h2o:10％d2o中以约0.2mm的浓度从冻干肽制备样品。在600mhzavanceiiinmr光谱仪(bruker，karlsruhe，germany)上记录所有nmr光谱。在290k下的2d¹h-¹htocsy、¹h-¹hnoesy、¹h-¹hdqf-cosy、¹h-¹⁵nhsqc和¹h-¹³chsqc用于指派。以1秒的扫描间延迟记录所有光谱。以200ms的混合时间获得noesy光谱，并以80ms的各向同性混合期获得tocsy光谱。基于wuthrich等人⁴³描述的方法，使用ccpnmr⁴²指派所有光谱。通过从实验αh化学位移减去wishart等人⁴⁴的无规卷曲¹hnmr化学位移来确定αh次级位移。指派2dnoesy光谱，并使用程序cyana⁴⁵计算结构集合。使用cyana程序总共计算了100个初始结构。使用talosn预测的扭转角约束用于结构计算中。使用molmol⁴⁶使结构可视化。

哺乳动物细胞培养

h69细胞系(非恶性胆管上皮细胞细胞系)获自明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所的gregoryj.gores博士³⁴。在37℃和5％培养箱中，将h69细胞如前所述³⁴在含有1×抗生素/抗真菌剂和15mmhepes并补充有10％胎牛血清(fbs)(gibco,scotland)的dmem/f12(lifetechnologies)中生长和维持。用改良的dmem/f12培养基进行细胞增殖测定，所述改良的dmem/f12培养基补充有0.5％fbs和如先前研究³⁴中所列的特定浓度范围内的特定激素和生长因子。

使用xcelligence实时监测细胞增殖

如先前所述³⁴，使用xcelligencesp系统(aceabiosciences)进行实时增殖研究。将h69细胞以2000个细胞/孔的密度接种到96孔xcelligencee-平板(aceabiosciences)中；然后放置于位于37℃的5％co2培养箱中的xcelligence系统中，并监测过夜⁴⁷。然后，用180μl饥饿培养基(补充有5％fbs的改良dmem/f12培养基，如先前描述的³⁴)替换完全培养基并孵育至少6小时。将处理物以20μl的总体积添加到每个孔中以提供200nm的最终浓度。经过48小时的测量，细胞达到汇合，并且系统记录细胞指数(ci)。细胞增殖率被计算为与对照细胞相比随时间(培养48小时)的处理细胞的相对数量。使用graphpadprism6.02进行单向anova，然后进行dunnett多重比较检验。每种处理一式四份进行测量。

结果

grn12-35_3s突变体的设计和合成

为了确定在采用多重构象时涉及哪些脯氨酸残基，化学合成了grn12-35_3s的三个单突变体(p2a，p4a，p10a)，其中每个突变体的三个脯氨酸中的一个变为丙氨酸。在称为grn3ala的另外的类似物中用丙氨酸取代所有三个脯氨酸残基。合成ov-grn-1截短肽的序列在表1中给出。

使用fmoc固相肽合成化学合成所有肽。使用rp-hplc纯化粗肽，并使用maldi质谱法进行质量分析。在0.1m碳酸氢铵和5mm谷胱甘肽中在室温下24小时形成二硫键。氧化折叠反应的hplc迹线在图8中给出。对于大多数肽，存在相对尖锐的早期洗脱峰。与其他肽相比，grn3ala突变体中该早期洗脱峰的产率显著更高。在当前研究中使用的条件下，grn12-35_3s并不有效地折叠成单一异构体。对于所有肽，除grnp10a外，从每个反应中分离出主峰(图8中用星号突出显示)以进一步表征。即使在48小时的氧化期之后，grnp10a的折叠反应中存在的大量峰也阻止了单一主要二硫化物异构体的纯化。

用nmr光谱法进行结构分析

使用nmr光谱法分析grn12-35_3s类似物的纯化或部分纯化的级分的结构。所有肽的一维光谱在酰胺区域具有显著的分散，与β折叠结构的存在一致。对单独脯氨酸突变体的tocsy和noesy光谱的分析表明存在多重构象，最可能是由于脯氨酸残基的异构化。相比之下，grn3ala肽似乎没有多重构象(图9)。

二维光谱(tocsy和noesy)用于指派主要构象，并且通过从αh位移中减去无规卷曲位移⁴⁸来确定次级位移。如图10所示，与n末端ov-grn-1肽grn12-35_3s相比，所有脯氨酸突变体的等同残基的次级位移通常类似，表明总体结构相似。正次级位移的延伸与β折叠结构的存在一致。

为了确认ov-grn-1肽的结构是否保持与grn12-35_3s类似的折叠，使用程序cyana确定所选类似物的三维结构。选择grn3ala用于完整结构分析，因为有效折叠，缺乏构象异质性并确定脯氨酸残基对整体折叠的影响。先前预测grn12-35_3s的二硫键模式为cysi-cysiii、cysii-cysv和cysiv-cysvi⁴⁹。grn3ala的三维结构与grn12-35_3s在肽的c末端区域共享β-发夹，但是n末端区域包含从残基4至11的α-螺旋，如图11所示。

使用xcelligence实时监测细胞增殖

除了结构研究之外，为了深入了解ov-grn12-35_3s的结构-功能关系，在体外细胞增殖测定中测试了所有工程化肽。图12显示了48小时内来自xcelligence板读数的每种肽的细胞增殖率。与阴性对照肽(来自原肌球蛋白的20个残基的肽)相比，各脯氨酸突变体显示出显著的细胞增殖。相对于对照肽，grn24p2a、grn24p4a和grn24p10a的增殖率分别为131.7％(p<0.0001)、141.6％(p<0.0001)和131.4％(p<0.0001)。相比之下，与对照肽相比，grn3ala对细胞增殖没有统计学显著影响(p＝0.90)。

讨论

ov-grn-1在新颖伤口愈合剂的开发上具有潜力，但关于结构/功能关系的信息有限。在这里，我们显示ov-grn12-35_3s中的所有三个脯氨酸残基在结构和功能中都具有重要作用。

单独脯氨酸残基的突变不会破坏ov-grn12-35_3s的整体折叠，但是在nmr光谱中仍然存在多重构象。相比之下，当所有三个脯氨酸残基突变为丙氨酸残基时，在nmr光谱中观察到对应于单一构象的单组峰。这些结果表明所有三个脯氨酸残基都与顺式/反式异构化有关。

顺式/反式异构化可以是蛋白质折叠中的速率决定步骤⁴⁹，并且似乎影响ov-grn12-35_3s的折叠。尽管脯氨酸10突变为丙氨酸残基相对于ov-grn12-35_3s没有改善折叠，但grnp2a和grnp4a的折叠产率得到改善。通过去除所有三个脯氨酸残基来阻止顺式/反式异构化导致了最高的折叠产率(图8)。这些结果表明脯氨酸残基通常对当前条件下的折叠有害。

脯氨酸残基也对体外细胞增殖有影响。似乎grn3ala缺乏活性可能与n末端区域的结构扰动有关。去除脯氨酸残基允许形成螺旋结构，并且这种构象可能不能与结合配偶体相互作用。鉴于用丙氨酸残基取代单独脯氨酸残基仍导致细胞增殖，与脯氨酸残基的直接相互作用似乎不可能参与生物活性。然而，由于所有3个脯氨酸残基都在ov-grn12-35_3s的前10个残基内，因此似乎该区域而不是c末端发夹在生物活性中是重要的。

先前对人颗粒体蛋白模块的研究表明，序列对折叠产率具有显著影响，与我们目前的研究一致。在哺乳动物中，颗粒体蛋白表达为颗粒体蛋白前体，其含有七个半颗粒体蛋白模块³³。人颗粒体蛋白前体的七个颗粒体蛋白模块在大肠杆菌中表达为硫氧还蛋白融合蛋白⁵⁰。纯化表达的肽并通过重组肠激酶裂解以释放颗粒体蛋白模块。通过hplc分析和nmr分析对折叠的分析表明，颗粒体蛋白a、c和f显示相对良好界定的结构，至少对于肽的区域。相比之下，颗粒体蛋白b和e在nmr光谱中没有显示出明显的分散，并且据报道颗粒体蛋白d和g在nmr光谱中对于独特的质子具有多个信号⁵⁰。颗粒体蛋白b和f在序列中紧接第一个半胱氨酸之后含有脯氨酸残基，与ov-grn12-35_3s中的脯氨酸2一致。颗粒体蛋白b在折叠反应的hplc谱图中不具有主要的尖峰，但是颗粒体蛋白f具有⁵⁰。基于该比较，似乎该脯氨酸残基未对全长人颗粒体蛋白模块的折叠具有显著影响。

总结

总之，我们的结果突出了脯氨酸残基在ov-grn12-35_3s的结构和功能中的重要性。此外，这些数据为设计新一代基于ov-grn-1的强效类似物提供了必要的信息。

实施例3.评估肽的小鼠伤口愈合活性。

使用如本文所述的肽(ov-grn-1、ov-grn1-35、ov-grn8-38、ov-grn12-34、ov-grn12-35_3s、grn24-3ala、grn24-p2a、grn24-p4a和grn27sps)评估第4天的伤口愈合。相对于56皮摩尔肽对照，从用1.5％甲基纤维素凝胶中的56皮摩尔的重组ov-grn-1、ov-grn-1肽、硫氧还蛋白(trx)蛋白对照和71皮摩尔regranex以50μl体积从第0-4天起每天施用于由对两耳之间的头皮进行活检穿孔所产生的～0.2cm²伤口所进行的治疗显示结果(图13(b))。在任何时间点都没有在无关肽对照、pbs或trx蛋白质对照之间都没有注意到显著差异(ns)。肽ov-grn-1、ov-grn1-35、ov-grn8-38、ov-grn12-34、ov-grn12-35_3s、grn24-3ala和grn24-3p4a相对于对照显示出伤口愈合的显著增加。

所有图：用sem条绘制的4-5只动物组的2-6个生物重复的平均愈合速率。群组向左或向右略微移动以帮助观察。使用针对多重比较的具有dunnett校正的重复测量双向anova检验针对肽对照比较每个组。针对肽/蛋白质对照的显著性由以下表示：****＝p<0.0001，***＝p<0.001，**＝p<0.01，*＝p<0.05，ns＝不显著。星号或井号的颜色代表相关组。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，并不将本发明限制于任何一个实施方案或特征的具体集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对所例示的特定实施方案进行各种修改和改变。

本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均通过引用并入本文。

参考文献

1.he,z.,ong,c.h.,halper,j.和bateman,a.(2003).《颗粒体蛋白前体是伤口反应的介质(progranulinisamediatorofthewoundresponse.)》nat.med.9:225-229.

2.mulvenna,j.,sripa,b.,brindley,p.j.,gorman,j.,jones,m.k.,colgrave,m.l.等人(2010).《致癌人肝吸虫麝猫后睾吸虫的成熟阶段的分泌和表面蛋白质组(thesecretedandsurfaceproteomesoftheadultstageofthecarcinogenichumanliverflukeopisthorchisviverrini.)》proteomics.10:1063-1078.

3.laha,t.,pinlaor,p.,mulvenna,j.,sripa,b.,sripa,m.,smout,m.j.等人(2007).《致癌人肝吸虫麝猫后睾吸虫的基因发现(genediscoveryforthecarcinogenichumanliverfluke,opisthorchisviverrini.)》bmcgenomics.8:189.

4.smout,m.j.,laha,t.,mulvenna,j.,sripa,b.,suttiprapa,s.,jones,a.等人(2009).《致癌人肝吸虫麝猫后睾吸虫分泌的颗粒体蛋白样生长因子促进宿主细胞增殖(agranulin-likegrowthfactorsecretedbythecarcinogenicliverfluke,opisthorchisviverrini,promotesproliferationofhostcells.)》plospathog.5:e1000611.

5.smout,m.j.,sripa,b.,laha,t.,mulvenna,j.,gasser,r.b.,young,n.d.等人(2011).《致癌人肝吸虫麝猫后睾吸虫的感染(infectionwiththecarcinogenichumanliverfluke,opisthorchisviverrini.)》mol.biosyst.7:1367-1375.

6.smout,m.j.,sotillo,j.,laha,t.,papatpremsiri,a.,rinaldi,g.,pimenta,r.n.等人(2015).《致癌寄生虫分泌加速伤口愈合并潜在促进瘤形成的生长因子(carcinogenicparasitesecretesgrowthfactorthataccelerateswoundhealingandpotentiallypromotesneoplasia.)》plospathog.11:e1005209.

7.hrabal,r.,chen,z.,james,s.,bennett,h.p.和ni,f.(1996).《发夹堆叠折叠，新颖蛋白质生长因子家族的新颖蛋白质结构(thehairpinstackfold,anovelproteinarchitectureforanewfamilyofproteingrowthfactors.)》nat.struct.biol.3:747-752.

8.ong,c.h.和bateman,a.(2003).《在增殖和肿瘤发生中的颗粒体蛋白前体(颗粒体蛋白-上皮素前体，pc细胞衍生生长因子，acrogranin)(progranulin(granulin-epithelinprecursor,pc-cellderivedgrowthfactor,acrogranin)inproliferationandtumorigenesis.)》histol.histopathol.18:1275-1288.

9.tolkatchev,d.,malik,s.,vinogradova,a.,wang,p.,chen,z.,xu,p.等人(2008).《人颗粒体蛋白前体的结构解剖鉴定了具有独特功能活性的良好折叠的颗粒体蛋白/上皮素模块(structuredissectionofhumanprogranulinidentifieswell-foldedgranulin/epithelinmoduleswithuniquefunctionalactivities.)》proteinsci.17:711-724.

10.alquezar,c.,delaencarnacion,a.,moreno,f.,lopezdemunain,a.和martin-requero,a.(2016).《颗粒体蛋白前体缺乏通过tnf-α/nf-κb路径诱导来自额颞叶痴呆相关颗粒体蛋白突变携带者的外周细胞中wnt5a表达的过度活化(progranulindeficiencyinducesoveractivationofwnt5aexpressionviatnf-alpha/nf-kappabpathwayinperipheralcellsfromfrontotemporaldementia-linkedgranulinmutationcarriers.)》j.psychiatryneurosci.41:225-239.

11.park,b.,buti,l.,lee,s.,matsuwaki,t.,spooner,e.,brinkmann,m.m.等人(2011).《颗粒体蛋白是用于toll样受体9信号传导的可溶性辅因子(granulinisasolublecofactorfortoll-likereceptor9signaling.)》immunity.34:505-513.

12.yeh,j.e.,kreimer,s.,walker,s.r.,emori,m.m.,krystal,h.,richardson,a.等人(2015).《颗粒体蛋白，一种新颖的stat3相互作用蛋白，可增强stat3转录功能并与乳腺癌预后较差相关(granulin,anovelstat3-interactingprotein,enhancesstat3transcriptionalfunctionandcorrelateswithpoorerprognosisinbreastcancer.)》genescancer.6:153-168.

13.yip,c.w.,cheung,p.f.,leung,i.c.,wong,n.c.,cheng,c.k.,fan,s.t.等人(2014).《颗粒体蛋白-上皮素前体与肝癌细胞上的硫酸乙酰肝素相互作用(granulin-epithelinprecursorinteractswithheparansulfateonlivercancercells.)》carcinogenesis.35:2485-2494.

14.vranken,w.f.,chen,z.g.,xu,p.,james,s.,bennett,h.p.和ni,f.(1999).《鲤鱼颗粒体蛋白-1蛋白的30个残基的片段折叠成两个β-发夹的堆叠，类似于天然蛋白质中发现的(a30-residuefragmentofthecarpgranulin-1proteinfoldsintoastackoftwobeta-hairpinssimilartothatfoundinthenativeprotein.)》j.pept.res.53:590-597.

15.tolkatchev,d.,ng,a.,vranken,w.和ni,f.(2000).《基于人颗粒体蛋白a的氨基末端片段的两个β-发夹的良好折叠的堆叠的设计和溶液结构(designandsolutionstructureofawell-foldedstackoftwobeta-hairpinsbasedontheamino-terminalfragmentofhumangranulina.)》biochemistry.39:2878-2886.

16.wishart,d.s.,bigam,c.g.,holm,a.,hodges,r.s.和sykes,b.d.(1995).《常见氨基酸的¹h、¹³c和¹⁵n无规卷曲nmr化学位移。i.对最近邻影响的研究。(¹h,¹³cand¹⁵nrandomcoilnmrchemicalshiftsofthecommonaminoacids.i.investigationsofnearest-neighboreffects.)》j.biomol.nmr.5:67-81.

17.saether,o.,craik,d.j.,campbell,i.d.,sletten,k.,juul,j.和norman,d.g.(1995).《阐明子宫收缩多肽kalatab1的一级和三维结构(elucidationoftheprimaryandthree-dimensionalstructureoftheuterotonicpolypeptidekalatab1.)》biochemistry.34:4147-4158.

18.daly,n.l.,koltay,a.,gustafson,k.,r.,boyd,m.r.,casas-finet,j.r.和craik,d.j.(1999).《通过环杆菌素a的nmr分析的溶液结构：具有抗hiv活性的大环打结肽(solutionstructurebynmrofcirculina:amacrocyclicknottedpeptidehavinganti-hivactivity.)》j.mol.biol.285:333-345.

19.chen,x.,chang,j.,deng,q.,xu,j.,nguyen,t.a.,martens,l.h.等人(2013).《颗粒体蛋白前体不结合肿瘤坏死因子(tnf)受体，并且不是免疫或神经细胞中tnf依赖性信号传导或生物活性的直接调节因子(progranulindoesnotbindtumornecrosisfactor(tnf)receptorsandisnotadirectregulatoroftnf-dependentsignalingorbioactivityinimmuneorneuronalcells.)》j.neurosci.33:9202-9213.

20.etemadi,n.,webb,a.,bankovacki,a.,silke,j.和nachbur,u.(2013).《颗粒体蛋白前体不会通过tnf受体1抑制tnf和淋巴毒素-α信号传导(progranulindoesnotinhibittnfandlymphotoxin-alphasignallingthroughtnfreceptor1.)》immunol.cellbiol.91:661-664.

21.rollinson,s.,young,k.,bennion-callister,j.和pickering-brown,s.m.(2016).《使用转录物组分析鉴定由pgrn和grn肽处理调节的生物路径(identificationofbiologicalpathwaysregulatedbypgrnandgrnpeptidetreatmentsusingtranscriptomeanalysis.)》eur.j.neurosci.

22.studier,f.w.(2005).《在高密度振荡培养中通过自诱导产生蛋白质(proteinproductionbyauto-inductioninhighdensityshakingcultures.)》proteinexpr.purif.41:207-234.

23.smout,m.j.,mulvenna,j.p.,jones,m.k.和loukas,a.(2011).《引起哺乳动物宿主细胞的增殖的ov-grn-1(一种来自致癌肝吸虫的颗粒体蛋白样生长因子)的表达、重折叠和纯化(expression,refoldingandpurificationofov-grn-1,agranulin-likegrowthfactorfromthecarcinogenicliverfluke,thatcausesproliferationofmammalianhostcells.)》proteinexpr.purif.79:263-270.

24.vranken,w.f.,boucher,w.,stevens,t.j.,fogh,r.h.,pajon,a.,llinas,m.等人(2005).《用于nmr光谱法的ccpn数据模型：软件管道的开发(theccpndatamodelfornmrspectroscopy:developmentofasoftwarepipeline.)》proteins.59:687-696.

25.wüthrich,k.(1986).《蛋白质和核酸的nmr(nmrofproteinsandnucleicacids)》,wiley-interscience,newyork.

26.wishart,d.s.,bigam,c.g.,yao,j.,abildgaard,f.,dyson,h.j.,oldfield,e.等人(1995).《生物分子nmr中参考的1h、13c和15n化学位移(1h,13cand15nchemicalshiftreferencinginbiomolecularnmr.)》j.biomol.nmr.6:135-140.

27.guntert,p.(2004).《使用cyana进行自动nmr结构计算(automatednmrstructurecalculationwithcyana.)》methodsmol.biol.278:353-378.

28.koradi,r.,billeter,m.和wüthrich,k.(1996).《molmol：用于显示和分析大分子结构的程序(molmol:aprogramfordisplayandanalysisofmacromolecularstructures.)》j.mol.graph.14:29-32.

29.grubman,s.a.,perrone,r.d.,lee,d.w.,murray,s.l.,rogers,l.c.,wolkoff,l.i.等人(1994).《永生化人肝内胆管上皮细胞系对细胞内ph的调节(regulationofintracellularphbyimmortalizedhumanintrahepaticbiliaryepithelialcelllines.)》am.j.physiol.266:g1060-1070.

30.matsumura,t.,takesue,m.,westerman,k.a.,okitsu,t.,sakaguchi,m.,fukazawa,t.等人(2004).《用sv40t和htert建立永生化人肝内皮细胞系(establishmentofanimmortalizedhuman-liverendothelialcelllinewithsv40tandhtert.)》transplantation.77:1357-1365.

31.papatpremsiri,a.,smout,m.j.,loukas,a.,brindley,p.j.,sripa,b.和laha,t.(2015).《麝猫后睾吸虫的ov-grn-1编码颗粒体蛋白的抑制会抑制胆管上皮细胞的增殖(suppressionofov-grn-1encodinggranulinofopisthorchisviverriniinhibitsproliferationofbiliaryepithelialcells.)》exp.parasitol.148:17-23.

32.xing,j.z.,zhu,l.,jackson,j.a.,gabos,s.,sun,x.j.,wang,x.b.等人(2005).《在微电子传感器上动态监测细胞毒性(dynamicmonitoringofcytotoxicityonmicroelectronicsensors.)》chem.res.toxicol.18:154-161.

33.he,z.等人,《颗粒体蛋白前体是伤口反应的介质(progranulinisamediatorofthewoundresponse.)》naturemedicine,2003.9(2):第225-229页.

34.bansal,p.s.等人,《基于肝吸虫颗粒体蛋白结构折叠开发有效的伤口愈合剂(developmentofapotentwoundhealingagentbasedontheliverflukegranulinstructuralfold.)》journalofmedicinalchemistry,2017.60(10):第4258-4266页.

35.hrabal,r.等人,《发夹堆叠折叠，新颖蛋白质生长因子家族的新颖蛋白质结构(thehairpinstackfold,anovelproteinarchitectureforanewfamilyofproteingrowthfactors.)》naturestructuralbiology,1996.3(9):第747-52页.

36.plowman,g.d.等人,《上皮素前体编码对上皮细胞生长具有相反的活性的两种蛋白质(theepithelinprecursorencodestwoproteinswithopposingactivitiesonepithelialcellgrowth.)》journalofbiologicalchemistry,1992.267(18):第13073-13078页.

37.brown,c.a.和j.halper,《转化生长因子e型对上皮细胞和成纤维细胞的促有丝分裂作用-与其他生长因子的比较(mitogeniceffectsoftransforminggrowthfactortypeeonepithelialandfibroblasticcells—comparisonwithothergrowthfactors.)》experimentalcellresearch,1990.190(2):第233-242页.

38.he,z.等人,《颗粒体蛋白前体是伤口反应的介质(progranulinisamediatorofthewoundresponse.)》natmed,2003.9(2):第225-9页.

39.smout,m.j.等人,《致癌人肝吸虫麝猫后睾吸虫的感染(infectionwiththecarcinogenichumanliverfluke,opisthorchisviverrini.)》molecularbiosystems,2011.7(5):第1367-1375页.

40.laha,t.等人,《对于致癌人肝吸虫麝猫后睾吸虫的基因发现(genediscoveryforthecarcinogenichumanliverfluke,opisthorchisviverrini.)》bmcgenomics,2007.8(1):第1页.

41.smout,m.j.等人,《由致癌肝吸虫麝猫后睾吸虫分泌的颗粒体蛋白样生长因子促进宿主细胞的增殖(agranulin-likegrowthfactorsecretedbythecarcinogenicliverfluke,opisthorchisviverrini,promotesproliferationofhostcells.)》plospathog,2009.5(10):第e1000611页.

42.vranken,w.f.等人,《用于nmr光谱法的ccpn数据模型：软件管道的开发(theccpndatamodelfornmrspectroscopy:developmentofasoftwarepipeline.)》proteins,2005.59(4):第687-96页.

43.wüthrich,k.,《蛋白质和核酸的nmr(nmrofproteinsandnucleicacids.)》1986,newyork:wiley-interscience.292.

44.wishart,d.s.等人,《生物分子nmr中参考的1h、13c和15n化学位移(1h,13cand15nchemicalshiftreferencinginbiomolecularnmr.)》j.biomol.nmr,1995.6(2):第135-40页.

45.güntert,p.,《使用cyana进行自动nmr结构计算(automatednmrstructurecalculationwithcyana)》,proteinnmrtechniques,a.k.downing编.2004,humanapress:totowa,nj.第353–378页.

46.koradi,r.,m.billeter和k.wuthrich,《molmol：用于显示和分析大分子结构的程序(molmol:aprogramfordisplayandanalysisofmacromolecularstructures.)》j.mol.graph.,1996.14(1):第51-5,29-32页.

47.xing,j.z.等人,《在微电子传感器上动态监测细胞毒性(dynamicmonitoringofcytotoxicityonmicroelectronicsensors.)》chemrestoxicol,2005.18(2):第154-61页.

48.wishart,d.s.等人,《常见氨基酸的¹h、¹³c和¹⁵n无规卷曲nmr化学位移。i.对最近邻影响的研究。(¹h,¹³cand¹⁵nrandomcoilnmrchemicalshiftsofthecommonaminoacids.i.investigationsofnearest-neighboreffects.)》j.biomol.nmr,1995.5:第67-81页.

49.reimer,u.等人,《侧链对肽基-脯氨酰顺式/反式异构化的影响(side-chaineffectsonpeptidyl-prolylcis/transisomerisation.)》journalofmolecularbiology,1998.279(2):第449-460页.

50.tolkatchev,d.等人,《人颗粒体蛋白前体的结构解剖鉴定了具有独特功能活性的良好折叠的颗粒体蛋白/上皮素模块(structuredissectionofhumanprogranulinidentifieswell-foldedgranulin/epithelinmoduleswithuniquefunctionalactivities.)》proteinscience,2008.17(4):第711-724页.

表格

表1.对ov-grn12-35_3s中存在的15种可能的二硫键连接的cyana目标函数。

*具有最低目标函数的两个连接用星号突出显示。对应于集合编号1的连接具有最低目标函数，指示距离和角度约束比其他连接更好地满足该连接，因此它是ov-grn12-35_3s中最有可能存在的连接。

表3grn12-35_3s的序列及其设计的类似物。所有ov-grn-1截短肽都含有6个半胱氨酸残基，相当于全长蛋白质中的cysi、cysii、cysiii、cysiv和cysv。grn(12-35_3s)＝seqidno:5；grn(p2a)＝seqidno:6；grn(p4a)＝seqidno:7；grn(p10a)＝seqidno:8；grn(3ala)＝seqidno:9。