灌注生物反应器袋装配的制作方法
本申请要求保护2016年9月12日提交的美国申请号62/393,583的优先权，其内容通过提述以其整体并入本文。
本公开领域
本公开在一些方面涉及生物反应器袋装配，包括灌注生物反应器袋装配。更具体地，本公开在某些方面涉及即用型生物反应器袋装配，其最大限度的减少操作者在使用前需要进行的连接量以及污染所述生物反应器袋的风险。
背景
针对细胞培养的制造工艺中的传统不锈钢系统和管道系统已经在许多应用中由一次性生物反应器袋取代，在一些情况下，所述生物反应器袋由生物反应器摇杆摇动。然而，存在各种类型的可用的生物反应器摇杆，并且每个生物反应器摇杆系统可任选地包含各种具有多个连接的组件。这些组件可包括，例如，任选地带有盖子的摇动平台，一个或多个包括细胞容器的各种容器，例如细胞袋、输入容器、泵模块、气体模块和废物容器/袋。此外，这些组件可包括多个的流体线，所述流体线将一个或多个这些组件彼此连接和/或连接至流体供应连接以及电源线或数据线。因为各种生物反应器摇杆彼此不同，所以生物反应器摇杆通常利用不同且独特的对每个摇杆系统特异的生物反应器袋。
概述
本公开提供了可用于各种生物反应器装置的生物反应器袋装配，例如灌注生物反应器袋装配。在一些方面，提供了具有预装配的废物袋连接和预装配的管装置的即用型生物反应器袋装配，使得细胞培养基和/或细胞源可以立即被结合至所述的预装配的管装置。在一些实施方案中，所述生物反应器袋装配可在生物反应器袋可用于细胞培养前最大限度地减少对生物反应器袋进行的额外的连接/适配的量。在一些实施方案中，所述生物反应器袋装配可最大限度地减少操作所需的组件的数量，从而最大限度地减少集成生物反应器袋装配的风险。同样地，所述生物反应器袋装配在一些方面可降低污染的风险和/或产品损失。此外，最大限度地减少连接、适配和/或组件可允许生物反应器袋与各种生物反应器摇杆相兼容。
一些实施方案包括包括生物反应器袋和废物袋的生物反应器袋装配。在任何实施方案中，所述生物反应器袋可包括反面和具有多个端口的正面，其中所述多个端口可包括进料口、取样口和灌注口。在任何实施方案中，所述生物反应器袋可包括不定地连接至所述灌注口的灌注过滤器。在任何实施方案中，所述废物袋可不定地连接至所述生物反应器袋的灌注口。在任何实施方案中，所述生物反应器袋的正面具有第一端和与所述第一端相对的第二端，且所述灌注口比所述第一端更靠近所述第二端。在任何实施方案中，所述进料口和所述取样口比所述第二端更靠近所述第一端。在任何实施方案中，所述生物反应器袋的正面具有第一侧和与所述第一侧相对的第二侧，且所述进料口比所述第二侧更靠近所述第一侧。在任何实施方案中，所述取样口比所述第一侧更靠近所述第二侧。在任何实施方案中，所述灌注口比所述第一侧更靠近所述第二侧。在任何实施方案中，所述灌注过滤器在所述生物反应器袋的内部。在任何实施方案中，所述生物反应器袋装配可包括不定地连接至所述进料口的进料管装置。在任何实施方案中，所述进料管装置包括聚氯乙烯(pvc)管。在任何实施方案中，所述进料管装置包括y连接头，使得所述进料管装置具有两个入口。在任何实施方案中，所述生物反应器袋装配可包括不定地连接至所述取样口的取样管装置。在任何实施方案中，所述取样管装置可包括pvc管。在任何实施方案中，所述废物袋可经由废物管装置不定地连接至所述灌注口。在任何实施方案中，所述废物管装置包括pvc管。在任何实施方案中，所述多个端口可包括进气口和出气口。在任何实施方案中，所述生物反应器袋的正面具有位于所述第一端至所述第二端的中间的中部，且所述进气口和所述出气口比所述第一或第二端更靠近所述中部。在任何实施方案中，所述多个端口仅包括所述进料口、所述取样口、所述灌注口、所述进气口和所述出气口。在任何实施方案中，所述生物反应器袋装配可包括包括不定连接至所述进气口的进气过滤器的进气管装置和包括不定地连接至所述出气口的排气过滤器的出气管装置。
一些实施方案包括生物反应器系统，其包括生物反应器摇杆、支撑在所述生物反应器摇杆上的生物反应器袋和不定地连接至所述生物反应器袋的废物袋。在任何实施方案中，所述生物反应器袋包括反面和包括多个端口的正面，其中所述多个端口包括进料口、取样口和灌注口。在任何实施方案中，所述灌注过滤器可不定地连接至所述灌注口。在任何实施方案中，所述废物袋可不定地连接至所述生物反应器袋的灌注口。在任何实施方案中，所述生物反应器系统可包括不定地连接至所述进料口的进料管装置。在任何实施方案中，所述进料管装置可包括y连接头，使得所述进料管装置具有第一和第二入口。在任何实施方案中，细胞培养基源不定地连接至所述进料管装置的各入口。在任何实施方案中，各入口可包括pvc且可将所述细胞培养基源结合至所述入口的pvc。在任何实施方案中，细胞源不定地连接至所述第一入口，且细胞培养基源不定地连接至所述第二入口。在任何实施方案中，各入口可包括pvc，且所述细胞源可结合至所述第一入口的pvc，且所述细胞培养基源可结合至所述第二入口的pvc。在任何实施方案中，所述灌注过滤器可在所述生物反应器袋的内部。在任何实施方案中，所述生物反应器的正面具有第一端和与所述第一端相对的第二端，且所述灌注口比所述第一端更靠近所述第二端。在任何实施方案中，所述进料口和所述取样口可比所述第一端更靠近所述第二端。在任何实施方案中，所述进料口和所述取样口可比所述第二端更靠近所述第一端。在任何实施方案中，所述生物反应器带的正面具有第一侧和与所述第一侧相对的第二侧，且所述进料口比所述第二侧更靠近所述第一侧。在任何实施方案中，所述取样口比所述第一侧更靠近所述第二侧，且所述灌注口比所述第一侧更靠近所述第二侧。在任何实施方案中，所述生物反应器系统可包括不定地连接至所述取样口的取样管装置。在任何实施方案中，所述取样管装置包括pvc管。在任何实施方案中，所述废物袋经由废物管装置不定地连接至所述灌注口。在任何实施方案中，所述废物管装置包括pvc管。在任何实施方案中，所述多个端口可包括进气口和出气口。在任何实施方案中，所述生物反应器袋的正面具有位于所述第一端至所述第二端的中间的中部，且所述进气口和所述出气口比所述第一端或第二端更靠近所述中部。在任何实施方案中，所述多个端口仅包括所述进料口、所述取样口、所述灌注口、所述进气口和所述出气口。在任何实施方案中，所述生物反应器系统可包括包括不定地连接至所述进气口的进气过滤器的进气管装置和包括不定地连接至所述出气口的排气过滤器的出气管装置。
一些实施方案包括使用生物反应器系统的方法，所述方法包括将生物反应器袋装配的生物反应器袋置于生物反应器摇杆上，通过所述生物反应器袋的进料口供给细胞培养基至所述生物反应器袋，通过所述进料口供给细胞至所述生物反应器袋，利用由所述生物反应器摇杆提供的搅拌培养所述生物反应器袋内的细胞，通过所述生物反应器袋的灌注口转移废物滤液至废物袋，且收获经培养的细胞。在任何实施方案中，所述生物反应器袋装配包括具有包括多个端口的正面的生物反应器袋，其中所述多个端口包括进料口、取样口和灌注口。在任何实施方案中，所述生物反应器袋装配包括不定地连接至所述灌注口的灌注过滤器。在任何实施方案中，所述生物反应器袋装配包括不定地连接至所述生物反应器袋的灌注口的废物袋。在任何实施方案中，所述生物反应器袋装配包括不定地连接至所述进料口的进料管装置，其中所述进料管装置包括y连接头，使得所述进料管装置具有第一入口和第二入口。在任何实施方案中，通过将细胞培养基源结合至所述第一入口来添加所述细胞培养基。在任何实施方案中，通过将细胞源结合至所述第一入口来添加所述细胞。在任何实施方案中，通过将细胞培养基源结合至所述第一入口来添加所述细胞培养基，且通过将细胞源结合至所述第二入口来添加所述细胞。在任何实施方案中，所述多个端口包括进气口和出气口。在任何实施方案中，所述方法包括通过所述进气口供给用于细胞培养的气体至所述生物反应器袋。在任何实施方案中，所述方法包括通过所述出气口从所述生物反应器袋去除一部分所述气体作为废气。在任何实施方案中，通过将收获袋结合至所述进料管的第一或第二入口并反转所述进料管装置的流动方向来收获经培养的细胞。在任何实施方案中，所述方法包括通过所述进气口用气体至少部分地对所述生物反应器袋充气。在任何实施方案中，所述方法包括通过所述取样口取回经培养的细胞的样品。
根据以下详细描述，对于本领域技术人员而言，其他优势将会是显而易见的。本文中的实施例和描述本质上被认为是说明性的而非限制性的。
附图简述
参考附图描述示例性实施方案，其中：
图1示出了本文公开的生物反应器袋的俯视图的实例。
图2a示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的进料管装置的第一实例。
图2b示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的进料管装置的第二实例。
图3a示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的取样管装置的第一实例。
图3b示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的取样管装置的第二实例。
图4a示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的废物管装置的第一实例。
图4b示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的废物管装置的第二实例。
图5示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的排气管装置的实例。
图6示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的进气管装置的实例。
图7示出了用于本文公开的生物反应器袋装配的取样装置的实例。
在所述附图中，除非另有说明，否则同样的标记数字对应于同样的组件。
详述
1.生物反应器袋
在一些实施方案中，示例性生物反应器袋包括各种端口、汲取管、阀盖(flap)和泵管以及其他组件。在一些实施方案中，这些组件不是在密封包装中交付的，而是所有必要的组件都预先连接好。例如，在一些实施方案中，废物袋和/或进料管可以不连接至生物反应器袋上交付，且需要由操作者在使用现场连接。在一些实施方案中，在所述生物反应器袋用于细胞培养之前，必须对所述生物反应器袋进行额外的连接和/或适配。例如，所述灌注口可连接至废物袋，且使用者可能需要在进行实验运行之前确定将细胞源和/或培养基源连接至所述生物反应器袋的方式。在一些实施方案中，这些组件、连接和适配中的每一个可以是所述生物反应器袋和相关组件的污染点。因此，为了确保无菌细胞温育环境，使用者可以在实验运行之前或者由于污染导致潜在地产品损失之前对完成的装配进行灭菌。
本文所述的生物反应器袋装配可以，例如，通过提供具有预装配的废物袋连接和预装配的pvc管的即用型灭菌装配减少一个或多个上述风险，使得细胞培养基和/或细胞源可以立即结合至pvc管。如以下详述的，所述生物反应器袋装配可以最大限度地减少操作所需的组件的数量，并因此最大限度地减少所述生物反应器系统中的各种潜在的故障点并且最小化集成生物反应器袋的风险。此外，最大限度地减少连接、适配和/或组件可允许所述生物反应器袋与各种生物反应器摇杆相兼容。
本文所述的生物反应器袋装配可用于培养细胞，例如培养人、动物、昆虫和植物细胞。在一些实施方案中，本文所述的生物反应器袋装配用于生物反应器系统中的灌注操作。在一些实施方案中，本文公开的生物反应器袋装配可用于临床细胞疗法和t细胞应用。图1示出了生物反应器袋100的俯视图的实例。生物反应器袋100可具有正面101。所述正面可包括多个端口。在一些实施方案中，可将所述多个端口中的至少一个放置在与所述正面相对的所述生物反应器袋的反面上。所述多个端口可包括进料口、取样口、灌注口、进气口、do探针口、ph探针口和/或出气口。在一些实施方案中，所述多个端口不包括do探针口和/或ph探针口。在一些实施方案中，所述正面上的端口仅包括进料口、取样口、灌注口、进气口和出气口。生物反应器袋100的正面101包括进料口102。进料口可用于将各种进料组分添加至生物反应器袋。例如，所述进料口可用于将细胞从细胞源添加至所述生物反应器袋和/或将细胞培养基从细胞培养基源添加至所述生物反应器袋。在细胞培养期间所述细胞培养基可含有细胞营养素。在一些实施方案中，细胞培养基可以通过进料口连续添加至所述生物反应器袋。在一些实施方案中，所述生物反应器袋可通过进料口部分地填充有细胞培养基和细胞。在一些实施方案中，所述生物反应器袋可预填充有细胞培养基或预填充细胞。
正面101还包括取样口103。取样口可用于从所述生物反应器袋中移除细胞和/或其他材料的样品。例如，在培养期间，使用者可能想要测试一些细胞的各种特征。因此，使用者可使用所述生物反应器袋的取样口来获得细胞样品。
所述生物反应器袋还可包括第一端和与所述第一端相对的第二端。另外，所述生物反应器袋可包括第一侧和与所述第一侧相对的第二侧。例如，生物反应器袋100的正面101包括第一端107、第二端108、第一侧109和第二侧110。在一些实施方案中，所述侧部可以比所述端部长。例如，在一些实施方案中，所述侧部可以是558mm长，且所述端部可以是275mm长。在一些实施方案中，所述第一端在使用时可以是所述袋的前部，而所述第二端在使用时可以是所述袋的后部。所述袋的正面的中部可以在所述第一端至第二端的中间。所述进料口和/或所述取样口可以比所述第二端更靠近所述第一端。在其他实施方案中，所述进料口和/或所述取样口可以比所述第一端更靠近所述第二端。在一些实施方案中，所述进料口和/或所述取样口可以比所述中部更靠近所述第一端。在一些实施方案中，所述进料口和/或所述取样口可以比所述中部更靠近第二端。在一些实施方案中，所述进料口和/或所述取样口可以比所述第一或第二端更靠近所述中部。在一些实施方案中，所述进料口可以比所述第二侧更靠近所述第一侧。在一些实施方案中，所述进料口可以比所述第一侧更靠近第二侧。另外，所述取样口可以比所述第一侧更靠近所述第二侧。在其他实施方案中，所述取样口可以比所述第二侧更靠近所述第一侧。
所述生物反应器袋可包括灌注口104，如图1所示。灌注口可用于从所述生物反应器袋中移除细胞废物。例如，当细胞在生物反应器中培养时，所述细胞可产生有毒的代谢副产物。因此，这些有毒副产物可以通过所述灌注口移除。所述生物反应器袋还可包括不定地连接至所述灌注口的灌注过滤器。所述灌注过滤器可在细胞损失最小或没有的情况下允许流体从生物反应器袋中移除。因此，所述过滤器可以具有一定孔隙度，使得细胞不能通过它。在一些实施方案中，所述灌注过滤器可以构造成使得其可以在所述生物反应器袋中的流体表面上自由移动。在一些实施方案中，所述灌注过滤器包括1.2微米(孔径)的膜。滤液管可以是灌注口和滤液口之间的连接。因此，废滤液可首先通过所述过滤器离开所述生物反应器袋到达所述滤液管，然后离开所述灌注口。在一些实施方案中，从所述生物反应器袋中连续移除废滤液。图1包括生物反应器袋100内的过滤器111、过滤器11上的过滤口112以及连接过滤口112和灌注口104的过滤管113。过滤器111、过滤口112和过滤管113的虚线表示这些物品不在正面101上而在生物反应器袋100内。所述过滤管可以是允许所述过滤器在生物反应器袋中的流体表面上自由移动的柔性管。在一些实施方案中，所述灌注口比所述生物反应器袋的第一端更靠近第二端，如图1所示。在其他实施方案中，所述灌注口比所述生物反应器袋的第二端更靠近第一端。在一些实施方案中，所述灌注口比所述中部更靠近所述第一端。在一些实施方案中，所述灌注口比所述中部更靠近第二端。在一些实施方案中，所述灌注口比所述第一端或第二端更靠近所述中部。此外，所述灌注口可以比所述第一侧更靠近所述第二侧。在其他实施方案中，所述灌注口可以比所述第二侧更靠近所述第一侧。
所述生物反应器袋的正面还可包括进气口和出气口。例如，图1包括正面111上的出气口105和进气口106。在一些实施方案中，所述生物反应器袋可以通过所述进气口膨胀，在一些实施方案中，其是部分地膨胀。在一些实施方案中，来自气体源的气体(例如，co2、氧气、氮气、空气或其混合物)可通过进气口进入以使所述生物反应器袋膨胀。除了膨胀所述袋子外，所述气体还可用于细胞培养。例如，所述气体可能是细胞代谢所必需的。来自所述生物反应器袋的废气(例如，呼出气体)可以通过所述出气口离开所述生物反应器袋。在一些实施方案中，所述进气口和/或所述出气口比所述第一端或第二端更靠近所述中部。在一些实施方案中，所述进气口和/或所述出气口比所述中部更靠近所述第一端。在一些实施方案中，所述进气口和/或所述出气口比所述中部更靠近所述第二端。在一些实施方案中，所述进气口比所述第二侧更靠近所述第一侧。在一些实施方案中，所述进气口比所述第一侧更靠近所述第二侧。在一些实施方案中，所述出气口比所述第一侧更靠近所述第二侧。在一些实施方案中，所述出气口比所述第二侧更靠近所述第一侧。
所述生物反应器袋的多个端口中的至少一个可具有汲取管。在一些实施方案中，所述端口不包括汲取管。在一些实施方案中，所述生物反应器袋可包括生物反应器袋的至少一个端部和/或侧部上的阀盖(即附加的塑料)。在一些实施方案中，在生物反应器袋和相关组件的制造期间移除这些阀盖中的一个或多个。在其他实施方案中，所述生物反应器袋不包括所述袋的端部和/或侧部上的阀盖。移除一个或多个阀盖，或所述袋上的阀盖的缺少，可允许所述生物反应器袋安装上各种不同的生物反应器摇杆。
所述生物反应器袋的正面还可包括产品标签。例如，图1包括正面101上的产品标签114。所述生物反应器袋还可包括反面(未显示)。在一些实施方案中，所述生物反应器袋的反面可包括上述多个端口中的至少一个。在其他实施方案中，所述反面可以是光滑的。在一些实施方案中，将所述生物反应器袋放置在生物反应器摇杆上。生物反应器摇杆可以摇动或搅动所述生物反应器袋，从而提供所述袋中细胞的运动(例如，通气和混合)以促进细胞培养。生物反应器的摇动或搅动还可提供有效的气液表面的气体交换。具有与本文公开的生物反应器袋装配兼容的摇动平台的生物反应器的实例包括但不限于gexuriw25、gexuriw5、sartoriusbiostatrm20|50、finessesmartrocker生物反应器系统和pallxrs生物反应器系统。
本文公开的生物反应器袋装配可以是一次性单次使用的生物反应器袋装配。所述生物反应器袋可以由柔性材料制成，例如聚合物材料(例如聚乙烯)。所述聚合物材料可以是塑料薄膜或层压材料。此外，所述柔性材料可包括无机氧化物和/或金属。在一些实施方案中，所述生物反应器袋可由s80膜材料制成。在一些实施方案中，所述生物反应器袋具有阻气层。所述阻气层材料可包括evoh。在一些实施方案中，所述生物反应器袋可具有产品接触层。所述产品接触层材料可包括聚乙烯，例如线性低密度聚乙烯(lldpe)。在一些实施方案中，所述生物反应器袋可以由与sartoriusflexsaferm灌注袋相同的材料制成。所述生物反应器袋可具有1-200l(例如1、2、10、20、50、100或200l)的总体积。所述生物反应器袋可具有100ml至100l的培养体积(例如0.1-0.5l、0.2-1l、1-5l、2-10l、5-25l、10-50l或20-10l)。
所述生物反应器袋装配还可包括不定地连接至所述进料口的进料管装置。所述进料管装置可以向所述生物反应器袋的进料口提供各种进料组分(例如细胞和/或培养基)。图2a-b示出了不定地连接至本文公开的生物反应器袋装配的进料口202的进料管装置215的实例。所述进料管装置可包括y连接头216。可使用y连接头，使得所述进料管装置具有两个入口。因此，细胞培养基源可以不定地连接到所述进料管装置的一个或每个入口。在一些实施方案中，细胞源可以不定地连接到所述进料管装置的一个或每个入口。在其他实施方案中，可将细胞源连接至一个入口，且可将培养基源连接至另一个入口。在一些实施方案中，所述y连接头可适用于pvc管。所述进料管装置中的管的长度可使其具有足够的长度以达到进料源(例如，细胞源和/或培养基源)。例如，可将进料源连接至iv极，且应有足够的管长度，使得所述进料管装置可达到所述进料源。
所述进料管装置还可包括进料入口管。例如，图2a-b包括进料入口管217。所述进料入口管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述进料入口管是pvc管。在一些实施方案中，所述进料入口管是0.118x0.164pvc管。在一些实施方案中，所述进料入口管是
所述进料管装置还可包括后y连接头管。图2a-2b包括后y连接头管219。所述后y连接头管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述后y连接头管是pvc管。在一些实施方案中，所述后y连接头管是0.118x0.164pvc管。在一些实施方案中，所述后y连接头管是
所述进料管装置还可包括减径接头，如图2a-2b所示的减径接头221。所述减径接头可以是经典系列倒钩。在一些实施方案中，所述减径接头是1/8x5/32减径接头。在一些实施方案中，所述减径接头是valueplastics#3040-6005。
所述进料管装置可包括后减径接头管，如图2a-2b所示的后减径接头管222。所述后减径接头管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述后减径接头是硅树脂管。在一些实施方案中，所述后减径接头管是1/8x1/4硅树脂管。所述后减径接头管的长度可约为1000-1500mm、1250-1450mm、1350-1400mm或1380mm。所述进料管装置可包括在所述后减径接头管上的夹子。图2a-2b示出了后减径接头夹子223。所述后减径接头夹子可以是弹簧夹子和/或滑动夹子。在一些实施方案中，所述后减径接头适用于硅树脂管。
所述进料管装置的一部分管可以连接至泵或多个泵，使得连接至所述进料口管的流体可通过所述进料口被转移至所述生物反应器袋。在一些实施方案中，将所述进料管装置的硅树脂管连接至所述泵。在一些实施方案中，将所述后减径接头管连接至所述泵。在一些实施方案中，重力可以为连接至所述进料口管的流体提供通过所述进料口被转移至所述生物反应器袋的力。
所述进料管装置中使用的连接头可以是倒钩状的连接头或鲁尔锁(luerlock)连接头。在一些实施方案中，仅使用倒钩状的连接头。在一些实施方案中，所述进料管装置的至少一些连接可具有在其上的扎线带(cabletie)或其他确保所述连接的线结。在其他实施方案中，扎线带可在所述进料管装置的每个连接上，如具有扎线带224的图2b所示的。此外，所述进料管装置的所有连接可以是不定地连接的。
在一些实施方案中，所述进料管装置还可用于收获经培养的细胞。例如，可将收获袋结合至所述进料口管和/或所述后y连接头管。在一些实施方案中，将所述收获袋结合至所述进料口管的pvc管和/或所述后y连接头管的pvc管。为了收获所述细胞，可反转所述进料管装置的流动。重力可提供足够的力来驱动细胞从所述生物反应器袋流到所述收获袋。在其他实施方案中，如上所述，可使用泵来驱使细胞从所述生物反应器袋流到所述收获袋。
所述生物反应器袋装配还包括不定地连接至所述取样口的取样管装置。所述取样管装置可用于从所述生物反应器袋中移除细胞样品和/或其他材料。例如，在培养期间，使用者可能需要测试一些细胞的各种特征。因此，所述使用者可使用不定地连接至所述生物反应器袋的取样口的取样管装置以获得所述细胞样品。
图3a-b示出了不定地连接至用于本文公开的生物反应器袋装配的取样口303的取样管装置325的实例。所述取样管装置可包括取样入口管。例如，图3a-b包括取样入口管326。所述取样入口管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述取样入口管是pvc管。在一些实施方案中，所述取样入口管是0.118x0.164pvc管。在一些实施方案中，所述取样入口管是
在一些实施方案中，所述取样入口管可符合terumotscd-ii接管机规格。在一些实施方案中，所述取样入口管可与标准pvc血液收集型管兼容。在一些实施方案中，所述取样入口管具有id:2.9-3.1mm/od:3.9-4.5mm。在一些实施方案中，所述取样入口管具有id:3mm/od:4.17mm。所述取样入口管的长度约为200-400mm、250-350mm、275-325mm或300mm。所述取样管装置还可包括塞子318。所述塞子是用于pvc管的塞子。在一些实施方案中，所述塞子是按压塞子3/32。
所述取样管装置还可包括减径接头，如图3a-b所示的减径接头321。所述减径接头是经典系列倒钩。在一些实施方案中，所述减径接头是1/8x5/32减径接头。在一些实施方案中，所述减径接头是valueplastics#3040-6005。
所述取样管装置可包括后减径接头取样管，如图3a-b所示的后减径接头取样管327。所述后减径接头取样管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述后减径接头取样管是硅树脂管。在一些实施方案中，所述后减径接头取样管是1/8x1/4硅树脂管。所述后减径接头取样管的长度可约为10-100mm、25-75mm、40-60mm或50mm。所述取样管装置可包括在所述后减径接头取样管上的夹子。图3a-b示出了后减径接头取样夹子323。所述后减径接头取样夹子可是弹簧夹子或滑动夹子。在一些实施方案中，所述后减径接头取样夹子适用于硅树脂管。
可将所述取样管装置的一部分管连接至泵或多个泵，使得样品流体可从所述取样口移除。在一些实施方案中，将所述取样管装置的硅树脂管连接至所述泵。在一些实施方案中，将所述后减径接头取样管连接至泵。在一些实施方案中，重力可提供样品流体从所述取样口被移除的力。
在所述取样管装置中使用的连接头可以是倒钩状的连接头和/或鲁尔锁连接头。在一些实施方案中，仅使用倒钩状的连接头。在一些实施方案中，所述取样管装置的至少一些连接可具有在其上的扎线带或其他确保所述连接的线结。在其他实施方案中，扎线带可在所述取样管装置的每个连接上，如具有扎线带324的图3b所示的。此外，所述进料管装置的所有连接可以是不定地连接的。
所述生物反应器袋装配还可包括不定地连接至所述生物反应器袋的灌注口的废物袋。所述废物袋可储存从所述生物反应器袋中移除的细胞。因此，废滤液可以从生物反应器袋中排出所述灌注口，然后储存在所述废物袋中。
图4a-b示出了不定地连接本文公开的生物反应器袋装配的废物袋429和灌注口404的废物管装置的实例。这样，来自生物反应器袋的废物可以通过过滤器411、流出过滤口412、通过过滤管413、流出灌注口404，然后进入废物袋429。所述废物管装置中的管的长度可使得所述废物袋具有足够的长度以在来自生物反应器袋的生物反应器台或控制台的相同或不同平台上。例如，所述废物袋可位于生物反应器摇杆(具有生物反应器袋)下方的搁板或平台上，并且应该具有足够的管长度，使得所述废物管装置可以到达搁板或平台。所述废物袋可具有1-200l(例如，1、2、10、20、50、100或200l)的总体积。在一些实施方案中，所述废物袋是10l袋。所述废物袋可以有废物口。在一些实施方案中，所述废物口在所述废物袋的正面上，如图4b中所示的废物口430。将废物口置于所述废物袋的正面上可以允许所述废物袋在所述生物反应器袋下方的搁板或平台上，并允许来自废物袋的管和生物反应器袋的管垂直排列而不必弯曲所述管。所述废物袋还可具有第一端和与所述第一端相对的第二端。此外，所述废物袋可具有第一侧和与所述第一侧相对的第二侧。例如，废物袋429可包括第一端431、第二端432、第一侧433和第二侧434，如图4b所示的。在一些实施方案中，所述废物袋的侧部可比所述端部更长。例如，所述侧部为500mm长，且所述端部可为380mm长。在一些实施方案中，所述第一端在使用时可以是所述废物袋的前部，所述第二端在使用时可以是所述废物袋的后部。在一些实施方案中，所述废物口在所述废物袋的第一端上。所述废物袋的正面的中部可以在所述第一端至所述第二端的中间。所述废物口可以比所述第二端更靠近所述第一端。在其他实施方案中，所述废物口比所述第一端更靠近所述第二端。在一些实施方案中，所述废物口比所述中部更靠近所述第一端。在一些实施方案中，所述废物口比所述中部更靠近所述第二端。在一些实施方案中，所述废物口比所述第一或第二端更靠近所述中部。在一些实施方案中，所述废物口比所述第二侧更靠近所述第一侧。在一些实施方案中，所述废物口比所述第一侧更靠近所述第二侧。
所述废物管装置可包括废物袋入口管。例如，图4a-b包括废物袋入口管435。所述废物袋入口管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述废物袋入口管是pvc管。在一些实施方案中，所述废物袋入口管是硅树脂管。在一些实施方案中，所述废物袋入口管是0.118x0.164pvc管。在一些实施方案中，所述废物袋入口管是
所述废物管装置还可包括减径接头，如图4a-4b所示的减径接头421。所述废物管装置还可包括第二减径接头，如图4b所示的减径接头436。所述减径接头可以是经典系列倒钩。在一些实施方案中，所述减径接头是1/8x5/32减径接头。在一些实施方案中，所述减径接头是valueplastics#3040-6005。
所述废管装置还可包括灌注口出口管。例如，图4a-b包括灌注口出口管437。所述灌注口出口管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述灌注口出口管是硅树脂管。在一些实施方案中，所述灌注口出口管是1/8x1/4硅树脂管。所述灌注口出口管的长度可约为1000-2000mm、1250-1750mm、1500-1600mm或1520mm。所述废管装置可包括在灌注口出口管上的夹子。图4a-b示出了灌注口出口管夹子423。灌注口出口管夹子可以是弹簧夹子或滑动夹子。在一些实施方案中，所述后减径接头取样灌注口出口管夹子适用于硅树脂管。
所述废物管装置还可包括中间废物管。例如，图4b包括中间废物管438。中间废物管可以在两个其他管子管之间。在一些实施方案中，中间废物管在两个减径接头之间。所述中间废物管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述中间废物管是pvc管。在一些实施方案中，所述中间废物管是0.118x0.164pvc管。在一些实施方案中，所述中间废物管是
可将所述废物管装置的一部分管连接至泵或多个泵，使得来自生物反应器袋的废物可通过所述灌注口被转移至所述废物袋。在一些实施方案中，将所述废物管的硅树脂管连接至泵。在一些实施方案中，所述灌注口出口管和/或废物袋入口管连接到泵。在一些实施方案中，重力可提供将废物从所述生物反应器袋中移除以被转移至所述废物袋的力。
所述废管装置中使用的连接头可以是倒钩状的连接头和/或鲁尔锁连接头。在一些实施方案中，仅使用倒钩状的连接头。在一些实施方案中，所述废管装置的至少一些连接可具有扎线带或其他确保所述连接的线结。在其他实施方案中，扎线带可以在所述废管装置的每个连接上，如图4b所示的扎线带424。此外，所述废管装置的所有连接可以是不定地连接的。
所述生物反应器袋装配还可包括不定地连接至所述生物反应器袋的出气口的气体出口管装置。所述气体出口管装置可允许来自所述生物反应器袋的废气被排出。图5示出了不定地连接至所述生物反应器袋的出气口505的气体出口管装置539的实例。所述气体出口管装置可包括排气过滤器。所述排气过滤器可确保没有细胞和/或培养基作为气溶胶从生物反应器袋释放。此外，所述排气过滤器还可确保任何通过排气过滤器的回流不会造成所述生物反应器袋中细胞培养基的污染。图5示出了过滤器543。所述气体出口管装置还可包括排气过滤器入口管和排气过滤器出口管。所述排气过滤器可以在排气过滤器入口管和排气过滤器出口管之间。例如，图5示出了在排气过滤器入口管544和排气过滤器出口管542之间的排气过滤器543。
所述排气过滤器入口管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述排气过滤器入口管是硅树脂管。在一些实施方案中，所述排气过滤器入口管是3/16x5/16硅树脂管。所述排气过滤器入口管的长度可约为10-100mm、25-75mm、40-60mm或50mm。所述气体出口管装置可包括所述排气过滤器入口管上的夹子。图5示出了排气过滤器入口管夹子523。所述排气过滤器入口管夹子可以是弹簧夹子或滑动夹子。在一些实施方案中，所述排气过滤器入口管夹子适用于硅树脂管。
所述排气过滤器出口管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述排气过滤器出口管是硅树脂管。在一些实施方案中，所述排气过滤器出口管是3/16x5/16硅树脂管。所述排气过滤器出口管的长度可约为10-100mm、25-75mm、40-60mm或50mm。所述气体出口管装置可包括所述排气过滤器出口管上的夹子。所述排气过滤器出口管夹子可以是弹簧夹子或滑动夹子。在一些实施方案中，所述排气过滤器出口管夹子适用于硅树脂管。
所述气体出口管装置还可包括m-鲁尔接口3/16(541)和止回阀(540)，如图5所示。在所述气体出口管装置中使用的连接头可以是倒钩状的连接头和/或鲁尔锁连接头。在一些实施方案中，仅使用倒钩状的连接头。在一些实施方案中，所述气体出口管装置的至少一些连接可具有在其上的扎线带或其他确保所述连接的线结。在其他实施方案中，扎线带可以在所述气体出口管装置的每个连接上，如具有扎线带524的图5所示的。此外，所述气体出口管装置的所有连接可以是不定地连接的。
所述生物反应器袋装配还可包括不定地连接至所述生物反应器袋的进气口的气体入口管装置。可将所述气体入口管装置连接至所述气体源且允许来自气体源的气体进入所述进气口。图6示出了不定地连接至所述生物反应器袋的进气口606的气体入口管装置645的实例。所述气体入口管装置可包括进气过滤器。所述进气过滤器可以是灭菌的进气过滤器。图6示出了进气过滤器647。所述气体入口管装置还可包括气体入口管。例如，图6示出了气体入口管646。
所述气体入口管可以是硅树脂管和/或聚氯乙烯(pvc)管。在一些实施方案中，所述气体入口管是硅树脂管。在一些实施方案中，所述气体入口管是3/16x5/16硅树脂管。所述气体入口管的长度可约为10-100mm、25-75mm、40-60mm或50mm。所述气体入口管装置可包括所述气体入口管上的夹子。图6示出了气体入口管夹子623。所述气体入口管夹子可以是弹簧夹子或滑动夹子。在一些实施方案中，所述气体入口管夹子适用于硅树脂管。
在所述气体入口管装置中使用的连接头可以倒钩状的连接头和/或鲁尔锁连接头。在一些实施方案中，仅使用倒钩状的连接头。在一些实施方案中，所述气体入口管装置的至少一些连接可以具有在其上的扎线带或其他确保所述连接的线结。在其他实施方案中，扎线带可以在所述气体入口管装置的每个连接上，如图6所示的扎线带624。此外，所述气体入口管装置的所有连接可以是不定地连接的。
本公开的生物反应器袋装配可以是无菌的。例如，所述生物反应器袋装配可用电离辐射(例如伽马辐射、电子束或使用确保所述生物反应器袋装配的无菌性的高能x射线)照射。此外，所述生物反应器袋装配的所有各种组件(例如所述生物反应器袋、所述端口、所述管装置、所述废物袋、所述连接头、所述过滤器等)可由抗辐射材料构造，例如乙烯共聚物、聚硅酮、苯乙烯共聚物、聚砜等。在一些实施方案中，本文公开的生物反应器袋装配在无额外灭菌的情况下可以是无菌的和即可使用的。在一些实施方案中，所述生物反应器袋装配以灭菌状态密封(即无打开的管)。在一些实施方案中，所述生物反应器袋装配可包括塞子、密封件或管上的夹子以防止打开管。
在一些实施方案中，本文公开的pvc管可以是无dehp的pvc可结合管。在一些实施方案中，本文所述的所述硅树脂管可以是硅树脂泵管。此外，所述生物反应器袋装配可优选地包括倒钩状的连接头。在一些情况中，鲁尔锁连接可能不能未充分紧固或意外断开，从而损害所述生物反应器袋装配的完整性。
ii.培养和处理细胞的方法
在一些实施方案中，本文所提供的生物反应器袋装配(例如灌注生物反应器袋装配)可用于培养细胞，例如其与制造、产生或引起细胞疗法相关。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括用重组受体(例如嵌合型抗原受体)改造的细胞(例如t细胞)，例如cart细胞。在一些实施方案中，在培养和/或扩增所述细胞(例如刺激所述细胞)的条件下进行所述培养，例如，以诱导它们增殖和/或活化。
在一些实施方案中，可经由包括一个或多个进一步处理步骤(例如分离、分开、选择、活化或刺激、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞的步骤)的过程使用所述生物反应器袋装配进行培养细胞，例如其与制造、产生或引起细胞疗法相关。在一些实施方案中，产生或引起细胞疗法的方法包括从受试者中分离细胞、制备、处理、在一个或刺激条件下培养，其中使用提供的生物反应器袋装配进行至少一部分的所述培养，和/或改造(例如转导)所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括按照以下顺序进行的处理步骤：首先从生物样品中分离(诸如选择或分开)细胞(例如原代细胞)；任选地在刺激试剂存在下刺激分离的细胞的步骤之后，将选择的细胞与病毒载体颗粒一起温育用于转导；培养转导的细胞，例如以扩增该细胞；且将转导的细胞配制成组合物。在一些实施方案中，在低温储藏之前或之后，将产生的经工程改造的细胞再引入进同一受试者中。
在一些实施方案中，进行所提供的方法，使得在不将所述细胞暴露于无菌条件的情况下和在不需要使用无菌室或柜子的情况下进行制备临床上用于(例如)过继性细胞疗法的细胞中的一个、多个或全部步骤。在此过程的一些实施方案中，将所述细胞分离、分开或选择、转导、冲洗、任选地活化或刺激和配制，以上全部在封闭系统中进行。在一些实施方案中，所述封闭系统为或包括本文所述的生物反应器袋装配，例如灌注生物反应器袋装配。在一些实施方案中，所述方法以自动化的方式进行。在一些实施方案中，一个或多个所述步骤与所述封闭系统或装置分开执行。
在一些实施方案中，本文所述的生物反应器袋装配提供用于扩增细胞的封闭系统，该封闭系统可被整合进已知的细胞扩增系统和/或整合进进行用于制造、产生或引起细胞疗法的方法中的一个或多个其他处理步骤的系统。在一些实施方案中，使用具有集成或独立系统和/或以自动化或可编程方式的系统、装置或设备进行所述处理步骤中的一个或多个或全部，例如，分离、选择和/或富集、处理、与转导和改造相关的温育，以及配制步骤。在一些方面中，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许使用者编程、控制、评估所述处理、分离、工程改造和配制步骤的结果和/或调整所述处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。在一个实例中，所述系统是国际专利申请，公开号wo2009/072003或us20110003380a1中描述的系统。在一个实例中，所述系统是国际公开号wo2016/073602中描述的系统。
a.培养细胞
在一些实施方案中，本文提供的生物反应器袋装配(例如灌注生物反应器袋装配)可经由(例如)所述进料口填充有细胞培养基和/或细胞，用于培养添加的细胞。所述细胞可以来自任何细胞源，其中所述细胞的培养需要(例如)扩增和/或增殖所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞为或含有免疫细胞，例如获自受试者的原代细胞或源自获自受试者的原代细胞的原代细胞。在一些方面中，所述细胞为或含有t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含cd4+和cd8+t细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含cd4+或cd8+t细胞。在一些实施方案中，用于培养的细胞是经改造或已经经工程改造(例如转导)以表达重组受体(例如嵌合型抗原受体(car))的细胞，例如根据用于制造、引起或产生细胞疗法的一个或多个处理步骤产生的细胞。以下描述了这些经转导的细胞的示例，以及所述一个或多个处理步骤。
在一些实施方案中，将所述生物反应器袋装配配置以用于整合和/或可操作的连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置，和/或将所述生物反应器袋装配整合或可操作地连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置。在一个实例中，所述系统是如国际公开号wo2016/073602所述的系统。在一些实施方案中，所述系统包括离心室，且所述过程包括实现从用于培养的细胞样品(例如包含转导了编码所述重组受体的病毒载体的细胞的细胞样品)的离心室的内腔到所提供的装配的生物反应器袋中的表达。在一些实施方案中，将所述袋在输出线或输出位置处连接至含有所述离心室的系统，从而导致细胞从所述室的内腔转移到所述生物反应器袋中，用于随后的培养(culturing)或培养(cultivation)。
在一些实施方案中，经转移或填充进所述生物反应器袋的细胞和培养基的总体积为或约为50ml至5000ml，例如为或约为300ml至3000ml、300ml至1500ml、300ml至1000ml、300ml至1000ml、300ml至500ml、500ml至3000ml、500ml至1500ml、500ml至1000ml、1000ml至2000ml、1000ml至1500ml或1500ml至2000ml。在一些实施方案中，经转移或填充进所述生物反应器袋的细胞和培养基的总体积为至少或约至少或约50ml、100ml、300ml、500ml、750ml、1000ml、1250ml、1500ml、1750ml或2000ml。在一些实施方案中，所述生物反应器袋能够容纳的总体积为或约为300ml至10l，例如为或约为500ml至5000ml、500ml至2500ml、500ml至2000ml、500ml至1500ml、500ml至1000ml、1000ml至5000ml、1000ml至2500ml、1000ml至2000ml、1000ml至1500ml、1500ml至5000ml、1500ml至2500ml、1500ml至2000ml、2000ml至5000ml、2000ml至2500ml或2500ml至5000ml。
在一些方面中，所述培养基是经改造的培养基，其支持细胞(例如t细胞)的生长、培养、扩增或增殖。在一些方面中，所述培养基可以是含有盐、氨基酸、维生素、糖或其任何组合的混合物的液体。在一些实施方案中，所述培养基进一步含有一个或多个刺激条件或试剂，例如以在温育期间刺激细胞的培养、扩增或增殖。在一些实施方案中，所述刺激条件是或包括一个或多个选自il-2、il-7或il-15的细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，在培养或温育期间的培养基中的一个或多个细胞因子的浓度，各自地，为或约为1iu/ml至1500iu/ml，例如为或约为1iu/ml至100iu/ml、2iu/ml至50iu/ml、5iu/ml至10iu/ml、10iu/ml至500iu/ml、50iu/ml至250iu/ml或100iu/ml至200iu/ml、50iu/ml至1500iu/ml、100iu/ml至1000iu/ml或200iu/ml至600iu/ml。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞因子的浓度，各自地，为至少或至少约1iu/ml、5iu/ml、10iu/ml、50iu/ml、100iu/ml、200iu/ml、500iu/ml、1000iu/ml或1500iu/ml。在某些方面中，能够激活tcr复合物的细胞内信号传导结构域的试剂，例如抗cd3和/或抗cd28抗体，也可以包括在一部分温育期间或至少一部分温育期间或温育之后。
在一些方面中，在转移所述细胞和培养基后，将所述生物反应器袋(例如本文提供的灌注袋)温育至少一段时间。在一些实施方案中，刺激条件通常包括适用于原代免疫细胞(例如人t淋巴细胞)生长的温度，例如，至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，且通常在或约37摄氏度。在一些实施方案中，将所述生物反应器袋在25至38℃的温度温育，例如30至37℃，例如在或约37℃±2℃。在一些实施方案中，将所述温育进行一段时间直至所述培养(培养或扩增)产生所期望的或临界的细胞密度、数量或剂量。在一些实施方案中，所述温育大于或大于约或为约或为24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或以上。
在一些实施方案中，在一定条件下培养所述生物反应器袋装配，以维持细胞培养中二氧化碳的目标量。在一些方面中，这确保了细胞在生长期间的最佳培养、扩增和增殖。在一些方面中，二氧化碳(co2)的量在所述气体的10％和0％(v/v)之间，例如在所述气体的8％和2％(v/v)之间，例如约5％或5％(v/v)二氧化碳的量。
在一些情况下，所述生物反应器可经受运动或摇摆，这在一些方面可以增加氧气转移。使所述生物反应器运动可包括但不限于沿水平轴旋转、沿垂直轴旋转、沿所述生物反应器的倾斜或倾斜水平轴的摇摆或其任何组合。在一些实施方案中，至少一部分温育是通过摇摆进行的。可以调节摇摆速度和摇摆角度以实现期望的搅动。在一些实施方案中，所述摇摆角度是20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，所述摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，所述摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，所述摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，所述摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、112、13、1415、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，所述摇摆速率在4和12rpm之间，例如在4和6rpm之间，包括端值。
在一些实施方案中，至少一部分温育是在静态条件下进行。在一些实施方案中，至少一部分温育是在灌注的情况下进行的，例如在培养期间灌出用过的培养基和灌进新鲜培养基。在一些实施方案中，所述方法包括，例如通过进料口，将新鲜培养基灌注到所述细胞培养物中的步骤。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基含有一个或多个刺激剂，例如，一个或多个重组细胞因子，例如il-2、il-7和/或il-15。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基与静态温育期间使用的培养基相同。
在一些实施方案中，在所述温育之后，将所述生物反应器袋装配件重新连接至用于进行制造、产生或引起细胞疗法的一个或多个其他处理步骤的系统，例如重新连接至包含离心室的系统。在一些方面，将经培养的细胞从所述生物反应器袋转移至所述室的内腔中以配制该经培养的细胞。
b.其他处理步骤
在一些实施方案中，培养可以结合一个或多个其他处理步骤进行，例如结合细胞工程。这样的一个或多个处理步骤可以作为同一封闭系统的一部分或与同一封闭系统可操作地连接来进行。
在一些实施方案中，所述一个或多个处理步骤包括下列中的一个或多个：(a)冲洗含有细胞的生物样品，例如全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(pbmc)样品、未分级的t细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞去除术产物，(b)从所述样品中分离(例如选择)所期望的细胞亚群或细胞群(例如cd4+和/或cd8+t细胞)，例如，通过将细胞与选择或免疫亲和试剂温育用于基于免疫亲和性的分开；c)将所述分离的细胞(例如选择的细胞)与病毒载体颗粒温育，(d)例如依照上述方法，培养(culturing)、培养(cultivating)或扩增细胞，且(e)例如在药学上可接受的缓冲液、冷冻保存剂或其他合适的培养基中，配制经转导的细胞。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括(e)通过将细胞暴露于刺激条件来刺激细胞，其可以在细胞与病毒载体颗粒温育之前、期间和/或之后进行。在一些实施方案中，洗涤或悬浮步骤中的一个或多个其他步骤(例如用于细胞的稀释、浓缩和/或缓冲液交换)也可以在任何上述步骤之前或之后进行。
i.从样品中分离或选择细胞
在一些实施方案中，所述处理步骤包括从生物样品(例如获自受试者或源自受试者(例如具有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者)的生物样品)中分离细胞或其组合物。在一些方面，所述受试者是人，例如其是需要特定治疗干预(例如其中细胞经分离、处理和/或工程化的过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括直接取自所述受试者的组织、液体和其他样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，其包括由其衍生的经处理的样品。
在一些方面，所述样品是血液或血液衍生的样品，或是或来自单采血术或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(pbmc)、白血球、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实例中，来自受试者的循环血液中的细胞是，例如通过单采血术或白细胞去除术获得的。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞，其包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白血细胞、红细胞和/或血小板，且在一些方面包含除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从所述受试者中收集的血细胞，例如以除去血浆部分并将所述细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，cobe2991细胞处理器，baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明，通过切向流过滤(tff)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如不含ca++/mg++的pbs。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、选择和/或富集和/或用于转导和工程化的温育之前或之后冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和随后的解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，且在一定程度上，去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，将所述细胞悬浮在冷冻溶液中。在一些方面，可以使用各种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个实例涉及使用含有20％dmso和8％人血清白蛋白(hsa)的pbs，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基1:1稀释，使得dmso和hsa的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所述细胞或群体的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，在一个或多个试剂的存在下洗涤、离心和/或温育细胞，例如，以去除不需要的组分、富集所期望的组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一个或多个性质分离细胞，例如密度、粘附性质、大小、灵敏度和/或对特定组分的抗性。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过裂解红细胞和通过percoll或ficoll梯度离心从外周血制备白血细胞。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂温育。与选择试剂或试剂一起温育，例如，作为选择方法的一部分，其可以使用一种或多种选择试剂进行基于细胞中或细胞上的表达或存在的一个或多个特定分子(例如表面标记物，例如表面蛋白质、细胞内标记物或核酸)来选择一种或多种不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的使用选择试剂或基于这些标记物分离的试剂的方法。在一些实施方案中，所述选择试剂导致分离，即基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述选择包括与用于基于细胞的一个或多个标记物(通常是细胞表面标记物)的表达或表达水平分离细胞和细胞群的试剂一起温育，例如通过与特异性结合这些标记物的抗体或结合配偶体温育，随后通常通过洗涤步骤且从未与所述抗体或结合配偶体结合的那些细胞中分离已结合了所述抗体或结合配偶体的细胞。
在这些过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的所期望的基于亲和力的选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可使用的任何系统或方法进行，所述系统和或方法导致经分离的细胞与特异性结合至该细胞上的标记物的分子之间的有利的能量相互作用，例如抗体或固体表面上的其他结合配偶体，例如，微粒。在一些实施方案中，使用诸如珠子的微粒进行方法，例如磁珠，所述微粒被涂覆对所述细胞的标记物特异的选择剂(例如抗体)。所述微粒(例如珠子)可以以恒定的细胞密度与微粒(例如，珠子)比率在容器(例如管或袋)中与细胞温育或混合，同时摇动或混合，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中全部或部分选择在离心室的内腔中进行，例如，在离心旋转下进行。在一些实施方案中，细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)的温育在离心室中进行。在某些实施方案中，使用国际专利申请公开号wo2009/072003或us20110003380a1中描述的系统、装置或设备进行分离或分开。在一个实例中，所述系统是如国际公开号wo2016/073602中描述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的腔中进行这些选择步骤或其部分(例如与抗体包被的微粒(例如磁珠)一起温育)，使用者能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理及其定时期间添加溶液，与其他可用方法相比，其可以提供优势。例如，在温育期间减少所述腔中液体体积的能力可以增加所述选择中使用的微粒(例如珠试剂)的浓度，从而增加溶液的化学势，而不影响所述腔中的细胞总数。这反过来可以增强经处理的细胞和供选择使用的微粒之间的成对发生的相互作用。在一些实施方案中，在所述室中进行温育步骤，例如当所述室与本文所述的系统、电路和控制相关时，允许使用者在温育期间的预期时间实现溶液的搅拌，这也可提高相互作用。
在一些实施方案中，至少一部分的选择步骤在离心室中进行，其包括将细胞与选择试剂温育。在这些过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的所期望的基于亲和力的选择试剂混合，所述选择试剂远远少于根据制造商的说明书在管或容器中进行类似的选择以选择相同的细胞数量和/或细胞体积时通常使用的选择试剂。在一些实施方案中，应用一定量的选择试剂或试剂，该选择试剂或试剂的量不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％的根据制造商的说明书选择相同的细胞数量和/或相同的细胞体积的基于管或容器的温育中的细胞的同一选择试剂的量。
在一些实施方案中，对于选择，例如基于免疫亲和力的细胞选择，将细胞以组合物的形式在所述室的腔中温育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，例如特异性结合至期望富集和/或消耗的细胞上的表面标记物的分子(而非所述组合物中的其他细胞上的分子)，例如抗体，其任选地偶联至诸如聚合物的骨架或表面，例如珠子，例如磁珠，诸如偶联至对cd4和cd8特异的单克隆抗体的磁珠。在一些实施方案中，如所描述的，当选择在处于摇动或旋转的管中进行时，将所述选择试剂以一定的量添加至所述室的腔中的细胞，所述量显著小于相较于实现选择相同细胞数量或相同细胞体积的相同或相似效率通常使用的或所必需的选择试剂的量(例如不大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的量)。在一些实施方案中，通过向细胞和选择试剂添加选择缓冲液来进行所述温育，以实现温育时所述试剂的目标体积达，例如，10ml至200ml，例如至少或至少约或约或10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、150ml或200ml。在一些实施方案中，在将选择缓冲液和选择试剂添加至所述细胞之前，预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂分别添加至所述细胞。在一些实施方案中，以周期性温和的混合条件进行选择温育，这有助于促进能量上有利的相互作用，由此允许整体上使用较少的选择试剂，同时实现高选择效率。
在一些实施方案中，与选择试剂一起温育的总持续时间为或约为5分钟至6小时，例如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，所述温育通常在混合条件(例如在旋转的存在下)下进行，通常以相对低的力或速度进行，例如低于用于沉淀细胞的速度，例如以或以约600rpm至1700rpm(例如以或约或或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如以或以约80g至100g(例如，以或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)的所述室或其他容器的样品或壁处的rcf。在一些实施方案中，使用重复间隔的旋转以这样低的速度进行旋转，随后静置一段时间，例如旋转和/或静置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，随后静置大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这种方法在所述室是其组件部分的完全封闭的系统内进行。在一些实施方案中，此过程(并且在一些方面还有一个或多个额外的步骤，例如洗涤含有细胞的样品(例如单采术样品)的在先洗涤步骤)以自动化方式进行，使得在适当的时间将细胞、试剂和其它组分吸入并推出所述室并进行离心，使得使用自动化程序在单个封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在使细胞和一个选择试剂和/或多个试剂温育和/或混合后，对经温育的细胞进行分离，以基于特定的一个或多个试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在相同的封闭系统中进行分离，在该封闭系统中进行细胞与选择试剂的温育。在一些实施方案中，在与选择试剂温育后，将经温育的细胞(包括选择试剂已结合的细胞)转移到用于基于免疫亲和力分离细胞的系统中。在一些实施方案中，基于免疫亲和力分离的系统是或包含磁性分离柱。
这些分离步骤可基于阳性选择，其中已经结合了所述试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞被保留用于进一步使用和/或阴性选择，其中未与所述试剂(例如抗体或结合配偶体)结合的细胞被保留。在一些实例中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，当没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体时，阴性选择可以特别有用，使得最好基于由除所期望的群体之外的细胞表达的标记物进行分离。
在一些实施方案中，所述过程步骤进一步包括对经温育的细胞进行阴性和/或阳性选择，例如使用可进行基于亲和力的选择的系统或设备。在一些实施方案中，通过阳性选择富集特定的细胞群或通过阴性选择消耗特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一个或多个抗体或其他结合剂一起温育来实现阳性或阴性选择，所述抗体或其他结合剂分别与在经阳性或阴性选择的细胞上表达的或以相对较高的水平(标记物高)表达(标志物+)的一个或多个表面标记物特异性结合。
所述分离不必导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记物的细胞。例如，特定类型的细胞(例如表达标记物的细胞)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不必导致不表达所述标记物的细胞的完全缺乏。同样，特定类型细胞(例如表达标记物的细胞)的阴性选择、去除或消耗是指减少此类细胞的数量或百分比，但不必导致所有此类细胞的完全去除。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，例如随后的阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可同时消耗表达多个标记物的细胞，例如通过将细胞与多个抗体或结合配偶体一起温育，每个抗体或结合配偶体对阴性选择靶向的标记物是特异性的。同样地，通过将细胞与多个抗体或在各种细胞类型上表达的结合配偶体一起温育，可同时阳性选择多种细胞类型。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术分离特定亚群的t细胞，例如一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞，例如cd28+、cd62l+、ccr7+、cd27+、cd127+、cd4+、cd8+、cd45ra+和/或cd45ro+t细胞。在一些实施方案中，通过与一个或多个特异性结合这些标记物的抗体或结合配偶体温育来选择此类细胞。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体可以，例如直接或间接地，缀合至固体支持物或基质(例如磁珠或顺磁珠)以实现选择。例如，可以使用cd3/cd28缀合的磁珠(例如，
在一些实施方案中，通过阴性选择在非t细胞(例如b细胞、单核细胞或其他白血细胞，例如cd14)上表达的标记物，将t细胞从pbmc样品中分离。在一些方面，cd4+或cd8+选择步骤用于分离cd4+辅助细胞和cd8+细胞毒性t细胞。通过对一种或多种幼稚、记忆和/或效应t细胞亚群上表达的或以相对较高程度表达的标记物的阳性或阴性选择，可以将这些cd4+和cd8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，cd8+细胞进一步富集或耗尽幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在一些实施方案中，进行中枢记忆t(tcm)细胞的富集以增加功效，例如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，在一些方面，这在此类亚群中特别强效。参见terakura等人,(2012)blood.1:72–82；wang等人(2012)jimmunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含tcm的cd8+t细胞和cd4+t细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆t细胞存在于cd8+外周血淋巴细胞的cd62l+和cd62l两个亚群中。pbmc可以富集或耗尽cd62l-cd8+和/或cd62l+cd8+级分，例如使用抗cd8和抗cd62l抗体。
在一些实施方案中，中枢记忆t(tcm)细胞的富集基于cd45ro、cd62l、ccr7、cd28、cd3和/或cd127的阳性或表面高表达；在某些方面，它基于对表达或高度表达cd45ra和/或颗粒酶b的细胞的阴性选择。在一些方面，通过耗尽表达cd4、cd14、cd45ra的细胞和对表达cd62l的细胞的阳性选择或富集来进行分离cd8+群体富集的tcm细胞。在一个方面，中心记忆t(tcm)细胞的富集以基于cd4表达选择的阴性级分的细胞开始进行，所述阴性级分的细胞经受基于cd14和cd45ra的表达的阴性选择，以及基于cd62l的阳性选择。在一些方面中的这些选择是同时进行的，且在其他方面中，以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备cd8+细胞群或亚群的基于cd4表达的相同选择步骤也用于产生cd4+细胞群或亚群，使得来自基于cd4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个进一步的阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，同时进行cd4+细胞群的选择和cd8+细胞群的选择。在一些实施方案中，以任一顺序依次进行cd4+细胞群和cd8+细胞群的选择。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可包括如公开的美国申请号us20170037369所述的方法。在一些实施方案中，可以在所述选择之后组合选择的cd4+细胞群和选择的cd8+细胞群。在一些方面，可以在如本文所述的生物反应器袋中组合选择的cd4+细胞群和选择的cd8+细胞群。
在特定实例中，pbmc样品或其他白血细胞样品经受cd4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后使所述阴性级分经受基于cd14和cd45ra或cd19的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆t细胞(如cd62l或ccr7)的标记物特性的阳性选择，其中所述阳性和阴性选择均以任一顺序进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可将cd4+t辅助细胞分选为幼稚、中枢记忆和效应细胞。cd4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚cd4+t淋巴细胞是cd45ro-、cd45ra+、cd62l+或cd4+t细胞。在一些实施方案中，中枢记忆cd4+细胞是cd62l+和cd45ro+。在一些实施方案中，效应cd4+细胞是cd62l-和cd45ro-。
在一个实例中，为了通过阴性选择富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在一些实施方案中，将所述抗体或结合配偶体结合到固体支持物或基质(例如磁珠或顺磁珠)，以允许阳性和/或阴性选择的细胞分离。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离所述细胞或细胞群(综述于methodsinmolecularmedicine,第58卷:metastasisresearchprotocols,第2卷:cellbehaviorinvitroandinvivo,第17-25页由s.a.brooksandu.
在一些方面，将经温育的样品或待分开的细胞组合物与含有小的、可磁化的或磁响应性材料(例如磁响应性微粒或小微粒，例如顺磁性珠子(如dynalbeadsor
在一些实施方案中，所述磁性微粒或珠子包含与特定结合成员(例如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应性材料。磁性分离方法中使用的许多公知的磁响应性材料是已知的，例如molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书ep452342b中所述的磁响应性材料，其通过提述并入本文。胶体大小的微粒(例如owen美国专利号4,795,698和liberti等人,美国专利号5,200,084中所述的胶体大小的微粒)也可使用。
所述温育通常在如下条件下进行：如果样品中存在细胞，则附接于磁性微粒或珠子的所述抗体或结合配偶体，或分子(例如二抗或其他试剂，所述分子可与这些抗体或结合配偶体特异性结合)特异性结合细胞表面分子。
在某些实施方案中，所述磁响应性微粒以一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素包被。在某些实施方案中，所述磁性微粒经由包被对一个或多个标记物特异的一抗附着至细胞。在某些实施方案中，所述细胞，而非所述珠子，用一抗或结合配偶体标记，然后添加包被了细胞类型特异性二抗或其它结合配偶体(如链霉亲和素)的磁性微粒。在某些实施方案中，包被了链霉亲和素的磁性微粒用于与生物素化的一抗或二抗结合。
在一些方面，在将样品置于磁场中的步骤中实现分离，并且具有附着于其上的磁响应性或可磁化的微粒的那些细胞将被吸引至磁体，且与未标记的细胞分开。对于阳性选择，保留吸引至磁体上的细胞；对于阴性选择，保留未吸引至磁体上的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在相同的选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或进行进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选术的(macs)(miltenyibiotech,auburn,ca)。磁激活细胞分选术(macs)，例如clinimacs系统能够高纯度选择具有附着于其上的已磁化的微粒的细胞。在某些实施方案中，macs以一定的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非目标和目标种类。即，附着于已磁化的微粒上的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成此第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放在磁场中被捕获的且防止被洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记且从异质细胞群中耗尽非靶细胞。
在一些实施方案中，将磁响应性微粒附着于所述细胞，随后将其一起温育、培养和/或工程化；在一些方面，将所述微粒附着于用于施用至患者的细胞。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化的或磁响应性的微粒。从细胞中去除可磁化的微粒的方法是已知的，且包括例如使用竞争的非标记抗体、可磁化的微粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，所述可磁化的微粒是可生物降解的。
2.基因工程
在一些实施方案中，所述处理步骤包括引入编码重组蛋白的核酸分子。这些重组蛋白的示例是重组受体，例如第iii部分中描述的任何重组受体。在所述细胞中引入编码重组蛋白质(例如重组受体)的核酸分子，可以使用许多已知载体中的任何一种进行。这些载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，例如piggybac或基于睡美人的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码所述受体的核酸的方法，其包括通过病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔。
在一些实施方案中，基因转移通过以下来完成：首先刺激所述细胞(例如通过将其与诱导应答(诸如增殖、存活和/或活化)的刺激物组合，例如如通过细胞因子或激活标记物的表达测定的应答)，然后转导经活化的细胞，且在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、腺相关病毒(aav)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移至t细胞中(参见如koste等人(2014)genetherapy2014apr3.doi:10.1038/gt.2014.25；carlens等人(2000)exphematol28(10):1137-46；alonso-camino等人(2013)molthernuclacids2,e93；park等人,trendsbiotechnol.2011november29(11):550–557)。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(ltr)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、骨髓增生性肉瘤病毒(mpsv)、鼠胚胎干细胞病毒(mesv)、鼠干细胞病毒(mscv)、脾脏病灶形成病毒(sffv)或腺相关病毒(aav)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的逆转录病毒。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染几种物种的宿主细胞，包括人。在一个实施方案中，待表达的基因取代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多示例性逆转录病毒系统(例如美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；miller和rosman(1989)biotechniques7:980-990；miller,a.d.(1990)humangenetherapy1:5-14；scarpa等人(1991)virology180:849-852；burns等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:8033-8037；和boris-lawrie和temin(1993)cur.opin.genet.develop.3:102-109)。
慢病毒转导的方法是已知的。例如，wang等人(2012)j.immunother.35(9):689-701；cooper等人(2003)blood.101:1637–1644；verhoeyen等人(2009)methodsmolbiol.506:97-114；和cavalieri等人(2003)blood.102(2):497-505中描述了示例性方法。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移至t细胞中(参见，例如chicaybam等人(2013)plosone8(3):e60298和vantedeloo等人(2000)genetherapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移至t细胞中(参见，例如manuri等人(2010)humgenether21(4):427-437；sharma等人(2013)molecthernuclacids2,e74；和huang等人(2009)methodsmolbiol506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork.n.y.中所述的)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(johnston,nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶dna共沉淀(brash等人,mol.cellbiol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号：wo2014055668和美国专利号7,446,190中描述的方法和载体。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后，例如，用t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)转染所述细胞(例如t细胞)。例如，这种用于引入期望受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以从初始刺激(例如cd3/cd28刺激物)中释放遗传修饰的细胞群，且随后用第二种类型的刺激物刺激细胞群，例如经由重新引入的受体。第二种类型的刺激物可包括肽/mhc分子形式的抗原刺激、遗传导入的受体的同源(交联)配体(例如car的天然配体)或在新受体的框架内直接结合的任何配体(例如抗体)(例如通过识别所述受体内的恒定区)。参见，例如cheadle等人“chimericantigenreceptorsfort-cellbasedtherapy”methodsmolbiol.2012；907:645-66或barrett等人,chimericantigenreceptortherapyforcancerannualreviewofmedicinevol.65:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要细胞(例如t细胞)是激活的的载体。在一些这样的情况下，可在激活之前选择和/或转导所述细胞。因此，可在细胞培养之前或之后对所述细胞进行工程化，且在一些情况下，所述工程化与至少一部分培养同时或在其期间进行。
在一些方面，对所述细胞进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。其他核酸，例如引入的基因，是用于改善治疗功效的核酸，例如通过促进经转移的细胞的活力或/或功能；提供用于选择和/或评价细胞(例如评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；提高安全性的基因，例如，通过使细胞对体内阴性选择敏感，如luptons.d.等人,mol.andcellbiol.,11:6(1991)；和riddell等人,humangenetherapy3:319-338(1992)所述的；还参见由lupton等人公开的pct/us91/08442和pct/us94/05601，其描述源自将显性阳性选择标记与阴性选择标记融合的双功能可选择的融合基因的用途。参见，例如riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
在一些实施方案中，通过使组合物的一个或多个细胞与编码所述重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行引入。在一些实施方案中，所述接触可在离心的情况下进行，例如旋转接种(例如离心接种)。这些方法包括国际公开号wo2016/073602中描述的任何方法。示例性离心室包括由biosafesa生产和销售的离心室，包括与
在一些实施方案中，所述系统包括在其他仪器中和/或使所述系统与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动操作、控制和/或监测转导步骤的方面和所述系统中进行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可与本文所述或国际公开号wo2016/073602所述的离心室系统一起进行或与其相连进行的一个或多个处理步骤)的仪器。在一些实施方案中，此仪器包含在机柜内。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所该机柜包括含有控制电路的壳体、离心机、盖子、马达、泵、传感器、显示器和用户界面。在美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和美国专利号2008/0171951中描述了示例性装置。
在一些实施方案中，所述系统包括一系列容器，例如袋、管、活塞、夹子、连接头和离心室。在一些实施方案中，所述容器(例如袋)包括一个或多个在同一的容器或单独的容器中包含待转导的细胞和病毒载体颗粒的容器(例如袋)，例如同一的袋或单独的袋。在一些实施方案中，所述系统进一步包括一个或多个含有介质(例如稀释剂和/或洗涤溶液)的容器(例如袋)，所述介质被推入所述室和/或其他组件中以在所述方法期间稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。可将所述容器连接在系统中的一个或多个位置处，例如连接在对应于输入管线、稀释管线、清洗管线、废液管线和/或输出管线的位置处。
在一些实施方案中，将所述室与离心机相关联，所述离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴线。旋转可以在与转导细胞有关的温育之前、期间和/或之后和/或在一个或多个其他处理步骤中发生。因此，在一些实施方案中，各种处理步骤中的一个或多个是在旋转下进行的，例如在特定的力下进行。所述室通常能够垂直或大致垂直旋转，使得所述室在离心期间垂直放置，且侧壁和轴线是垂直的或大致垂直的，而端壁是水平的或大致水平的。
在一些实施方案中，含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物可通常以相对低的力或速度旋转，例如低于用于使所述细胞沉淀的速度，例如600rpm至1700rpm或约600rpm至1700rpm(例如以或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，所述旋转以或以约100g至3200g(例如以或约或至少以或约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如相对离心力)进行，例如在所述室或腔的内壁或外壁处所测量的。术语“相对离心力”或rcf通常被理解为施加在物体或物质(例如所述室或旋转的其他容器中的细胞、样品或沉淀和/或点)上的有效力，其为相对于地球的重力，在空间的特定点与旋转轴相比。所述值可以使用公知的公式来确定，考虑到重力、旋转速度和旋转半径(距旋转轴到测定rcf处的物体、物质或微粒的距离)。
在一些实施方案中，在至少一部分基因工程期间(例如转导)和/或在基因工程之后，将所述细胞转移至所述生物反应器袋装配中，用于培养基因工程化的细胞，例如用于培养或扩增所述细胞，如上所述。
制备用于转导的病毒载体颗粒
病毒载体基因组通常以可被转染至包装或生产细胞系中的质粒形式构建。在任何这样的实例中，将编码重组蛋白质的核酸(例如重组受体)插入或置于病毒载体的区结构域中，例如通常在病毒基因组的非必需区结构域中。在一些实施方案中，将所述核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。
可以使用多种已知方法中的任何一种以产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的rna拷贝。在一些实施方案中，至少两种组件参与制备基于病毒的基因递送系统：首先，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，其次是病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组件中的一个或两个时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，所述包装质粒可含有除包膜蛋白之外的所有逆转录病毒(例如hiv-1)蛋白(naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可缺少额外的病毒基因(例如与毒力相关的病毒基因，例如vpr、vif、vpu和nef)和/或tat，hiv的一种主要反式激活因子。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于hiv的慢病毒载体)仅包含亲本病毒的三种基因：gag、pol和rev，其降低或消除了通过重组重构野生型病毒的可能性。
在一些实施方案中，将所述病毒载体基因组引入包装细胞系，所述包装细胞系含有将病毒基因组rna包装成病毒颗粒所需的所有组件，所述病毒基因组rna由病毒载体基因组转录。或者，所述病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组件的基因，除了一个或多个感兴趣的序列，例如重组核酸。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中的复制，除去复制所需的内源病毒基因，且分别地提供在所述包装细胞系中。
在一些实施方案中，用一个或多个含有产生所述颗粒所必需的组件的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组的质粒转染包装细胞系，所述质粒包括ltr、顺式作用包装序列和感兴趣的序列，即编码抗原受体的核酸，例如car；编码病毒酶和/或结构组件(例如gag、pol和/或rev)的一个或多个辅助质粒。在一些实施方案中，利用多个载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组件。在一些这样的实施方案中，向包装细胞提供单独的载体降低了重组事件的可能性，否则重组事件可产生能够复制的病毒。在一些实施方案中，可使用具有所有逆转录病毒组件的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将所述逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用vsv-g糖蛋白假型化，这提供宽的细胞宿主范围，扩展了可经转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，例如以包括异嗜性、多变性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒包膜、galv或vsv-g。
在一些实施方案中，所述包装细胞系提供转移所需的用于将病毒基因组rna包装成慢病毒载体颗粒的组件(包括病毒调控和结构蛋白)。在一些实施方案中，所述包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白且产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(atcccclx)、293t、hela(atccccl2)、d17(atccccl183)、mdck(atccccl34)、bhk(atccccl-10)和cf2th(atcccrl1430)细胞。
在一些实施方案中，所述包装细胞系稳定表达病毒蛋白。例如，在一些方面，可以构建包含gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含ltr和包装组件的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一个或多个病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸瞬时转染包装细胞系。
在一些实施方案中，通过转染或感染将病毒载体和包装和/或辅助质粒引入所述包装细胞系。所述包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是公知的。非限制性实例包括磷酸钙、deae-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
当将重组质粒和逆转录病毒ltr和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)时，所述包装序列可允许将所述重组质粒的rna转录物包装进病毒颗粒中，然后该病毒颗粒可会被分泌到培养基中。然后收集含有一些实施方案中的重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至所述包装细胞系后，从培养基中回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法滴定。
在一些实施方案中，可通过引入质粒在包装细胞系(例如示例性hek293t细胞系)中产生逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)，以允许产生慢病毒颗粒。在一些实施方案中，包装细胞经转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，和编码重组受体(例如抗原受体，例如car)的多核苷酸。在一些实施方案中所述包装细胞系任选地和/或另外地用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有编码rev蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，所述包装细胞系任选地和/或另外地用编码非天然包膜糖蛋白(例如vsv-g)的多核苷酸转染和/或含有编码非天然包膜糖蛋白(例如vsv-g)的多核苷酸。在一些这样的实施方案中，转染细胞(例如hek293t细胞)后约两天，细胞上清液含有重组慢病毒载体，该重组慢病毒可被回收和滴定。
使用所述方法，经回收的和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可用于转导靶细胞。一旦进入靶细胞，病毒rna被逆转录，进入细胞核并稳定整合至宿主基因组中。在整合病毒rna后一天或两天，可检测重组蛋白(例如抗原受体，例如car)的表达。
3.活化和刺激
在一些实施方案中，所述一个或多个处理步骤包括刺激经分离的细胞(例如经选择的细胞群)的步骤。温育可在基因工程之前或与基因工程相关联，例如由上述转导方法的实施方案产生的基因工程。在一些实施方案中，所述刺激导致细胞的活化和/或增殖，例如，在转导之前。
在一些实施方案中，所述处理步骤包括温育细胞，例如经选择的细胞，其中温育步骤可包括细胞的培养(culture)、培养(cultivation)、刺激、活化和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下温育所述组合物或细胞。这些条件包括其经设计以诱导群中的细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，以模拟抗原暴露和/或触发细胞的基因工程(例如引入重组抗原受体)的那些条件。
在一些实施方案中，刺激和/或活化的条件可包括特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体)和任何其他旨在激活所述细胞的试剂)中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述刺激条件或试剂包括一种或多种试剂(例如配体)，其能够激活tcr复合物的细胞内信号传导结构结构域。在一些方面，所述试剂开启或启动t细胞中的tcr/cd3细胞内信号传导级联，例如适用于递送初级信号的试剂，例如以启动itam诱导的信号的激活，例如对tcr组件特异的试剂，和/或促进共刺激信号的试剂，例如对t细胞共刺激受体特异的试剂，例如抗cd3、抗cd28或抗-41-bb(例如，其结合至诸如珠子的固体支持物)，和/或一种或多种细胞因子。所述刺激剂中有抗cd3/抗cd28珠子(例如
所述条件可包括一种或多种特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的试剂)。
在一些方面，根据诸如riddell等人的美国专利号6,040,177、klebanoff等人(2012)jimmunother.35(9):651–660,terakura等人(2012)blood.1:72–82,和/或wang等人(2012)jimmunother.35(9):689-701中描述的技术进行温育。
在一些实施方案中，在一个或多个刺激条件或刺激剂存在下至少一部分温育在离心室的内腔中进行，例如，在离心旋转下，例如国际公开号wo2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的至少一部分温育包括与一个或多个试剂混合以诱导刺激和/或活化。在一些实施方案中，将细胞(例如经选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在这些过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一个或多个刺激条件或试剂混合，所述刺激条件或试剂的量远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的量。
在一些实施方案中，将所述刺激剂以一定的量添加至所述室的腔中的细胞，相较于所述刺激剂通常用于实现当未在离心室(例如在具有周期性摇动或旋转的管或袋中)中混合的情况下进行选择时选择相同数量的细胞或相同体积的细胞的相同或相似的效率或实现此效率所必需的量，所述一定量显著小于该量(例如不多于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的该量)。在一些实施方案中，通过向所述细胞和刺激剂添加温育缓冲液进行温育以达到温育所述试剂时的目标体积为，例如，10ml至200ml，例如至少或约至少或约或为10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、150ml或200ml。在一些实施方案中，所述温育缓冲液和刺激剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将所述温育缓冲液和刺激剂分别添加至所述细胞。在一些实施方案中，所述刺激温育以周期性温和混合条件进行，这可有助于促进能量上有利的相互作用，由此允许整体上使用较少的刺激剂，同时实现细胞的刺激和活化。
在一些实施方案中，通常在混合条件下进行所述温育，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度，例如低于用于沉淀所述细胞的速度，例如以或以约600rpm至1700rpm(例如以或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如以为或约为80g至100g(例如以或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)的所述室或其它容器的样品或壁处的rcf。在一些实施方案中，使用重复间隔的旋转以如此低的速度进行所述旋转，随后静置，例如旋转和/或静置达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，随后静置大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，所述温育(例如具有所述刺激剂)的总持续时间为或为约1小时～96小时、1小时～72小时、1小时～48小时、4小时～36小时、8小时～30小时或12小时和～24小时，例如至少或约至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步的温育持续时间为或为约1小时～48小时、4小时～36小时、8小时～30小时之间12小时～22小时，包括端值。
4.制剂
在一些实施方案中，用于制造、产生或引起细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个处理步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行的步骤)可包括配制细胞，例如配制来源于所述培养(例如培养和扩增)之前或之后的所提供的转导处理步骤和/或所述的一个或多个其他处理步骤的基因工程化的细胞。在一些实施方案中，所提供的与配制细胞相关的方法包括在封闭系统中处理经诱导的细胞，例如使用如上所述的处理步骤诱导和/或扩增的细胞。
在一些实施方案中，配制通过一个或多个所述处理步骤产生的t细胞(例如cd4+和/或cd8+t细胞)。在一些方面，分别制造、产生或生成多个组合物，每个组合物含有来自所述受试者的不同细胞群和/或亚型，例如其用于分别或独立地施用，任选地在一定时间内。例如，含有不同细胞群或亚型的工程化细胞的单独制剂可分别包括cd8+和cd4+t细胞，和/或分别包括富集cd8+-和cd4+-的群体，例如，每个单独包括经基因工程改造以表达所述重组受体的细胞的cd4+和/或cd8+t细胞。在一些实施方案中，用经基因改造以表达所述重组受体的cd4+t细胞配制至少一个组合物。在一些实施方案中，用经基因改造以表达所述重组受体的cd8+t细胞配制至少一个组合物。在一些实施方案中，剂量的施用包括施用包含一定剂量的cd8+t细胞或一定剂量的cd4+t细胞的第一组合物，和施用包含另一个该剂量的cd4+t细胞和该剂量的cd8+t细胞的第二组合物。在一些实施方案中，包含一定剂量的cd8+t细胞或一定剂量的cd4+t细胞的第一组合物在施用包含另一个该剂量的cd4+t细胞和该剂量的cd8+t细胞的第二组合物之前施用。在一些实施方案中，剂量的施用包括施用包含一定剂量的cd8+t细胞和一定剂量的cd4+t两者的组合物。
在一些实施方案中，所述细胞在药学上可接受的缓冲液中配制，在一些方面，该药学上可接受的缓冲液可包括药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，所述处理包括将培养基交换成其为药学上可接受的或期望施用至受试者的培养基或配制缓冲液。在一些实施方案中，所述处理步骤可涉及洗涤经转导的和/或扩增的细胞以替换可包括一个或多个任选的药学上可接受的载剂或赋形剂的药学上可接受的缓冲液中的细胞。这些药物形式(包括药学上可接受的载剂或赋形剂)的示例可以是下文所述的任何形式，连同施用细胞和组合物至受试者的可接受的形式。在一些实施方案中，所述药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量的细胞，例如治疗有效量或预防有效量。
“药学上可接受的载剂”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载剂的选择部分地由特定细胞和/或由施用方法确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，所述药物组合物可含有防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两个或更多个防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。例如，由remington’spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.ed.(1980)描述的载剂。药学上可接受的载剂在所用的剂量和浓度处通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。
一些方面，缓冲剂包括在组合物中。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两个或更多个缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,lippincottwilliams&wilkin；第21版，(2005年5月1日)。
所述制剂可包括水溶液。所述制剂或组合物还可含有一种以上的对用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症有益的活性成分，优选具有与所述细胞互补活性的活性成分，其中各活性不会相互产生不利影响。这些活性成分适当地以对预期目的有效的量存在于组合物中。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包括其他药物活性剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，在一些方面，该无菌制剂可缓冲至选定的ph。液体组合物可包含载剂，该载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可通过将所述细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载剂、稀释剂或赋形剂混合，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。所述组合物可含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素，这取决于施用途径和所期望的制剂。在某些方面可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可以确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，所述制剂缓冲液含有冷冻保存剂。在一些实施方案中，所述细胞用含有1.0％至30％dmso溶液的冷冻保存剂配制，例如5％至20％dmso溶液或5％至10％dmso溶液。在一些实施方案中，所述冷冻保存溶液是或含有，例如含有20％dmso和8％人血清白蛋白(hsa)的pbs，或其他合适的细胞冷冻培养基。在一些实施方案中，所述冷冻保存溶液是或含有，例如至少或约7.5％dmso。在一些实施方案中，所述处理步骤可涉及洗涤经转导的和/或扩增的细胞以替换冷冻保存溶液中的细胞。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述处理步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞，例如经培养的或扩增的细胞。在一些实施方案中，所述处理可包括将细胞稀释或浓缩至所期望的浓度或数量，例如包括以给定剂量或其部分施用的细胞数的单位剂量形式的组合物。在一些实施方案中，所述处理步骤可包括减少体积，由此根据需要的增加细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理步骤可包括添加体积，由此根据需要的降低细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理包括将一定体积的制剂缓冲液添加至经转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，制剂缓冲液的体积为或约为10ml至1000ml，例如至少或约至少或约或为50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml或1000ml。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的这些处理步骤在封闭系统中进行。这些处理步骤的示例可以使用离心室来进行，该离心室结合一个或多个与细胞处理系统相关联的系统或试剂盒，例如由biosafesa生产和销售的离心室，其包括与
在一些实施方案中，所述封闭系统(例如与离心室或细胞处理系统相关联)包括多端口输出套件，所述多端口输出套件包含在管线的每一端与端口相关联的多向管道歧管，其中可将一个或多个容器连接至该端口以表达所配制的组合物。在一些方面，可将期望数量的或多个输出容器(例如袋)无菌地连接至一个或多个多端口输出的端口，通常为两个或更多个，例如至少3、4、5、6、7、8或更多个。例如，在一些实施方案中，可将一个或多个容器(例如袋)连接至端口，或连接至少于全部的端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将所述输出组合物表达到多个输出袋中。在一些方面，可以将细胞以剂量施用的量表达至多个输出袋中的一个或多个，例如用于单个单位剂量施用或多剂量施用。例如，在一些实施方案中，所述输出袋可各自包含用于以给定剂量或其部分施用的细胞数。因此，在一些方面，每个袋可包含用于施用的单个单位剂量，或可包含所期望剂量的一部分，使得一个以上的多个输出袋(例如两个输出袋或3个输出袋)共同构成施用剂量。
因此，所述容器(例如输出袋)通常含有待施用的细胞，例如其一个或多个单位剂量。所述单位剂量可以是待施用至所述受试者的细胞的量或数量，或者是待施用的细胞的数量的两倍(或更多)。它可以是施用至所述受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个所述容器(例如袋)分别包含单位剂量的所述细胞。因此，在一些实施方案中，每个所述容器包含相同或近似或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x106、2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个工程化的细胞、总细胞、t细胞或pbmc。在一些实施方案中，每个袋中配制的细胞组合物的体积为10ml至100ml，例如至少或约至少20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml。
在一些实施方案中，将由所述方法产生的这些细胞或包含这些细胞的组合物施用至受试者以治疗疾病或病症。
iii.重组蛋白
在一些实施方案中，用于培养(例如用于细胞的扩增或培养)的方法在用重组蛋白基因工程化(例如转导)的细胞上进行。在一些实施方案中，所述重组蛋白是或包括重组受体，例如抗原受体。所述抗原受体可包括功能性非tcr抗原受体，其包括嵌合抗原受体(car)和其他抗原结合受体，如基因改造的t细胞受体(tcr)。所述受体还可包括其他受体，例如其他嵌合受体，例如与特定配体结合并具有与car中存在的信号传导结构域类似的跨膜和/或细胞内信号传导结构域的受体。
示例性抗原受体(包括car)以及将这些受体工程化并引入细胞的方法，包括下列中所述的受体和方法：例如国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061、美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337、美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118和欧洲专利申请号ep2537416和/或sadelain等人,cancerdiscov.2013april；3(4):388–398；davila等人(2013)plosone8(4):e61338；turtle等人,curr.opin.immunol.,2012october；24(5):633-39；wu等人,cancer,2012march18(2):160-75。在一些方面，所述抗原受体包括如美国专利号7,446,190和国际专利申请公开号wo/2014055668a1中所述的car。所述car的实例包括任何上述公开中公开的car，例如wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利号:7,446,190、美国专利号:8,389,282、kochenderfer等人,2013,naturereviewsclinicaloncology,10,267-276(2013)；wang等人(2012)j.immunother.35(9):689-701；和brentjens等人,scitranslmed.20135(177)。还参见wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利号：7,446,190和美国专利号:8,389,282。
在一些实施方案中，编码重组蛋白的核酸进一步编码一个或多个标记物，例如，用于确认细胞的转导或工程化，以表达受体和/或选择和/或靶向表达由所述多核苷酸编码的分子的细胞。在一些方面，这种标记物通常可以经由相同的方法(例如通过本文提供的任何方法转导，例如经由相同载体或相同类型的载体)由不同的核酸或多核苷酸编码，所述核酸或多核苷酸也可在基因工程过程中引入。
在一些方面，所述标记物(例如转导标记物)是蛋白质和/或是细胞表面分子。示例性标记物是天然存在的截短变体，例如内源标记物，例如天然存在的细胞表面分子。在一些方面，与天然或内源细胞表面分子相比，所述变体具有降低的免疫原性、降低的转运功能和/或降低的信号传导功能。在一些实施方案中，所述标记物是细胞表面受体的截短形式，例如截短的egfr(tegfr)。在一些方面，所述标记物包括cd34、ngfr或表皮生长因子受体(例如tegfr)的全部或部分(例如截短形式)。在一些实施方案中，编码所述标记物的核酸与编码接头序列(例如可切割的接头序列，例如t2ap2a、e2a和/或f2a)的多核苷酸可操作地连接。参见，例如wo2014/031687。
在一些实施方案中，所述标记物是非天然地存在于t细胞上的或非天然地存在于t细胞表面上的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。
在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即未被宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质，其中所述细胞将会过继转移至该宿主的免疫系统中。
在一些实施方案中，所述标记物不起任何治疗功能和/或不产生除用作基因工程的标记物(例如，用于选择成功工程化的细胞)外的作用。在其他实施方案中，所述标记物可以是治疗性分子或在其他方面上发挥一些期望的作用的分子，例如针对体内遇到的细胞的配体，例如以增强和/或抑制过继转移和遇到配体时细胞的应答的共刺激或免疫检查点分子。
a.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，car通常是具有与一个或多个细胞内信号传导组件连接的细胞外配体结合结构域(例如含有抗体或其片段的细胞外部分)的基因工程化的受体。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域和/或细胞内结构域。这些分子通常模拟或接近通过天然抗原受体的信号，和/或通过与共刺激受体组合的这种受体的信号。
在一些实施方案中，构建具有对特定标记物(例如在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的标志物，例如癌症标志物和/或所述的任何抗原)的特异性的car。因此，所述car通常包括一个或多个抗原结合片段、结构域或部分的抗体或一个或多个抗体可变结构域和/或抗体分子。在一些实施方案中，所述car包括抗原结合部分或部分的抗体分子，例如可变重链(vh)或其抗原结合部分或源自单克隆抗体(mab)的可变重链(vh)和可变轻链(vl)的单链抗体片段(scfv)。
在一些实施方案中，所述car含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原(例如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如scfv)。
在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记物。在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是或包括孤儿酪氨酸激酶受体ror1、b细胞成熟抗原(bcma)、碳酸酐酶9(caix)、tegfr、her2/neu(受体酪氨酸激酶erbb2)、l1-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、上皮糖蛋白2(epg-2)、上皮糖蛋白40(epg-40)、epha2、erb-b2、erb-b3、erb-b4、erbb二聚体、egfrviii、叶酸结合蛋白(fbp)、fcrl5、fcrh5、胎儿乙酰胆碱受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯y、l1细胞粘附分子、(l1-cam)、黑色素瘤相关抗原(mage)-a1、mage-a3、mage-a6、优先表达的黑素瘤抗原(prame)、生存素、tag72、b7-h6、il-13受体α2(il-13ra2)、ca9、gd3、hmw-maa、cd171、g250/caix、hla-aimagea1、hla-a2ny-eso-1、psca、叶酸受体-a、cd44v6、cd44v7/8、avb6整合素、8h9、ncam、vegf受体、5t4、胎儿achr、nkg2d配体、cd44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠cmv、粘蛋白1(muc1)、muc16、psca、nkg2d、ny-eso-1、mart-1、gp100、癌胚抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白b2、cd123、c-met、gd-2、o-乙酰化gd2(ogd2)、ce7、威尔姆氏瘤肿瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白a2、ccl-1、cd138、病原体特异性抗原和与通用标签相关联的抗原，和/或生物素化分子，和/或由hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，由所述受体靶向的抗原包括与b细胞恶性肿瘤相关的抗原，例如许多已知的b细胞标记物中的任何一种。在一些实施方案中，由所述受体靶向的抗原是cd20、cd19、cd22、ror1、cd45、cd21、cd5、cd33、igκ、igλ、cd79a、cd79b或cd30。
在一些实施方案中，所述抗原是病原体特异性的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原(例如来自hiv、hcv、hbv等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述car含有tcr样抗体，例如特异性识别细胞表面上呈递的作为mhc-肽复合物的细胞内抗原(例如肿瘤相关抗原)的抗体或抗原结合片段(例如scfv)。在一些实施方案中，识别mhc-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体的一部分在细胞上表达，例如抗原受体。其中所述抗原受体是功能性非tcr抗原受体，例如嵌合抗原受体(car)。通常，含有针对肽-mhc复合物表现出tcr样特异性的抗体或抗原结合片段的car也可称为tcr样car。
在一些实施方案中，所述car的细胞外部分，例如其抗体部分，进一步包括间隔，例如抗原识别组件(例如scfv)和跨膜结构域之间的间隔区。所述间隔可以是或包括至少一部分的免疫球蛋白恒定区或其变体或其修饰形式，例如铰链区(如ig4铰链区)和/或ch1/cl和/或fc区。在一些实施方案中，所述恒定区或部分是人igg的恒定区或部分，例如igg4或igg1。与不存在所述间隔时相比，所述间隔的长度可以提供抗原结合后细胞的增强的响应性。在一些实例中，所述间隔的长度为或约12个氨基酸或长度不超过12个氨基酸。示例性间隔包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸的间隔，且包括任何所列的范围的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，间隔区具有约12个氨基酸或更少、约119个氨基酸或更少或约229个氨基酸或更少。示例性间隔包括单独的igg4铰链，与ch2和ch3结构域连接的igg4铰链，或与ch3结构域连接的igg4铰链。示例性间隔包括但不限于hudecek等人(2013)clin.cancerres.,19:3153或国际专利申请公开号wo2014/031687中描述的间隔。
细胞外配体结合，例如抗原识别结构域，通常与一个或多个细胞内信号传导组件相连，例如就car而言，模拟通过抗原受体复合物(例如tcr复合物)的激活的信号传导组件，和/或模拟经由另一种细胞表面受体的信号。在一些实施方案中，跨膜结构域连接细胞外配体结合和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述car包括与细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用天然地与所述受体(例如car)中的一个结构域相关联的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然或合成的来源。在所述来源是天然的情况下，在某些方面，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自下列的跨膜区(即至少包含下列的跨膜区)：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面，所述合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成的跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接通过接头、间隔和/或跨膜结构域。
在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度为2至10个氨基酸的接头，例如含有甘氨酸和丝氨酸的接头(例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并在所述car的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。
所述重组受体，例如car，通常包括至少一个细胞内信号传导组件或多个组件。在一些实施方案中，所述受体包括tcr复合物的细胞内组分，例如介导t细胞活化和细胞毒性的tcrcd3链(例如cd3ζ链)。因此，在一些方面，所述抗原结合部分与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括cd3跨膜结构域、cd3细胞内信号传导结构域和/或其他cd跨膜结构结构域。在一些实施方案中，所述受体，例如car，进一步包括一部分的一个或多个额外的分子，例如fc受体γ、cd8、cd4、cd25或cd16。例如，在一些方面，所述car或其他嵌合受体包括cd3-ζ(cd3-ζ)或fc受体γ和cd8、cd4、cd25或cd16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在结合所述car或其他嵌合受体时，所述受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如工程化以表达car的t细胞)的正常效应器功能或应答中的至少一种。例如，在一些情况下，所述car诱导t细胞的功能，例如细胞溶解活性或t辅助活性，例如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组件或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如，如果该截短部分转导效应器功能信号的话。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括t细胞受体(tcr)的细胞质序列，且在一些方面还包括共同受体的细胞质序列，和/或这些分子的任何衍生物或变体，和/或具有相同功能能力的任何合成序列，所述细胞质序列在天然情况下与这些受体协同作用以启动抗原受体结合后的信号转导。
在天然tcr的情况下，完全激活通常不仅需要通过tcr的信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全活化，用于产生次级或共刺激信号的组件也包括在所述car中。在其他实施方案中，所述car不包括用于产生共刺激信号的组件。在一些方面，额外的car在同一细胞中表达，且提供用于产生次级或共刺激信号的组件。
t细胞活化在某些方面被描述为通过至少两类细胞质信号序列介导：一类通过tcr启动抗原依赖性初级活化的细胞质信号序列(初级细胞质信号序列)和一类以抗原依赖的方式作用以提供次级或共刺激信号的细胞质信号序列(次级细胞质信号序列)。在一些方面，所述car包括这些信号传导组件中的一个或两个。
在一些方面，所述car包括调控tcr复合物的初级活化的初级细胞质信号序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号序列可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam。含有初级细胞质信号传导序列的itam的实例包括源自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd8、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的itam。在一些实施方案中，所述car中的细胞质信号传导分子含有细胞质信号传导结构域，其部分或源自cd3ζ的序列。
在一些实施方案中，所述car包括共刺激受体的信号传导结构域和/或跨膜部分，例如cd28、4-1bb、ox40、cd27、dap10和icos。在一些方面，相同的car包括活化和共刺激两种组件。
在一些实施方案中，所述激活结构域包含在一个car内，而所述共刺激组件由识别另一抗原的另一个car提供。在一些实施方案中，所述car包括激活性或刺激性car和共刺激性car，二者在同一细胞上表达(参见wo2014/055668)。在一些方面，所述car是刺激性或激活性car；在其他方面，它是共刺激性car。在一些实施方案中，所述细胞进一步包括抑制性car(icar，参见fedorov等人,sci.transl.medicine,5(215)(december,2013))，例如识别不同抗原的car，其中通过抑制性car与其配体的结合来减弱或抑制通过识别第一抗原的car传递的激活信号，例如，以减少脱靶效应。
在一些实施方案中，所述cd8+细胞毒性t细胞的细胞内信号传导结构域与cd4+辅助t细胞的细胞内信号传导结构域相同。在一些实施方案中，cd8+细胞毒性t细胞的细胞内信号传导结构域不同于cd4+辅助t细胞的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含与cd3(例如cd3-ζ)细胞内结构域连接的cd28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含嵌合的cd28和cd137(4-1bb、tnfrsf9)共刺激结构域，其与cd3ζ细胞内结构域连接。
在一些实施方案中，所述car包括细胞质部分中的一个或多个(例如两个或多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性car包括cd3-ζ、cd28和4-1bb的细胞内组件。
在一些情况中，car是指第一代、第二代和/或第三代car。在一些方面，第一代car是在抗原结合时仅仅提供cd3链诱导的信号的car；在某些方面，第二代car是提供这种信号和共刺激信号的car，例如包括来自诸如cd28或cd137的共刺激受体的细胞内信号传导结构域的信号；在一些方面，第三代car在一些方面是包括多个不同共刺激受体的共刺激结构域的car。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括细胞外配体结合部分(例如抗原结合部分，例如抗体或其片段)和细胞内结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scfv和单结构域vh抗体，且细胞内结构域含有itam。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括cd3-ζ(cd3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括连接所述细胞外结构域和所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面，所述跨膜结构域含有cd28的跨膜部分。所述细胞外结构域和跨膜可直接或间接地连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔连接，例如本文所述的任何间隔。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有t细胞共刺激分子的细胞内结构域，例如跨膜结构域和细胞内信号结构域之间的细胞内结构域。在一些方面，所述t细胞共刺激分子是cd28或4-1bb。
在一些实施方案中，所述car含有抗体(例如抗体片段)、作为或含有cd28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有cd28的信号传导部分或其功能变体和cd3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述car包含抗体(例如抗体片段)、作为或含有cd28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有4-1bb的信号传导部分或其功能变体和cd3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些这样的实施方案中，所述受体进一步包括含有一部分ig分子(例如人ig分子，例如ig铰链)的间隔，例如仅含铰链的间隔。
在一些实施方案中，所述受体(例如所述car)的跨膜结构域是人cd28或其变体的跨膜结构域，例如人cd28的27个氨基酸的跨膜结构域(登记号：p10747.1)。在一些实施方案中，所述细胞内结构域包含人cd28或其功能变体的细胞内共刺激信号传导结构域，例如其第41个氨基酸结构域和/或在天然cd28蛋白的第186-187位具有ll至gg取代的这样的结构域。在一些实施方案中，所述细胞内结构域包含4-1bb或其功能变体的细胞内共刺激信号传导结构域，例如人4-1bb的第42个氨基酸的细胞质结构域(登记号q07011.1)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含人cd3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，例如人cd3ζ的同种型3的112aa胞浆质结构域(登录号：p20963.2)或美国专利号7,446,190中描述的cd3ζ信号传导结构域。在一些方面，所述间隔仅含有igg的铰链区，例如仅含有igg4或igg1的铰链。在其他实施方案中，所述间隔是ig铰链，例如，和igg4铰链，其与ch2和/或ch3结构域连接。在一些实施方案中，所述间隔是ig铰链，例如igg4铰链，其与ch2和ch3结构域连接。在一些实施方案中，所述间隔是ig铰链，例如igg4铰链，其仅与ch3结构域连接。在一些实施方案中，所述间隔是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，例如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，所述car包括：细胞外配体结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体或其片段，包括sdab和scfv，该细胞外配体结合部分特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔，例如任何含ig铰链的间隔；跨膜结构域，其是cd28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有cd28或其功能变体的信号传导部分；和cd3ζ信号传导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，所述car包括：细胞外配体结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体或其片段，包括sdab和scfv，该细胞外配体结合部分特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔，例如任何含ig铰链的间隔；跨膜结构域，其是cd28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有4-1bb或其功能变体的信号传导部分；和cd3ζ信号传导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，这些car构建体进一步包含t2a核糖体跳跃元件和/或tegfr序列，例如car的下游。
b.t细胞受体(tcr)
在一些实施方案中，所述重组蛋白质是或包括重组t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，所述重组tcr对抗原特异，所述抗原通常是靶细胞上存在的抗原(例如肿瘤特异性抗原)，与自身免疫或炎性疾病相关的特定细胞类型上表达的抗原或源自病毒病原体或细菌病原体的抗原。
在一些实施方案中，所述tcr是已克隆自天然存在的t细胞的tcr。在一些实施方案中，鉴定并从患者中分离针对靶抗原(例如癌抗原)的高亲和力t细胞克隆。在一些实施方案中，已在经人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或hla)工程改造的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的tcr克隆。参见，例如肿瘤抗原(参见，例如parkhurst等人(2009)clincancerres.15:169–180和cohen等人(2005)jimmunol.175:5799–5808)。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的tcr(参见，例如varela-rohena等人(2008)natmed.14:1390–1395和li(2005)natbiotechnol.23:349–354)。
在一些实施方案中，在获得t细胞克隆后，分离tcrα和β链并将其克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，通过微小核糖核酸病毒2a核糖体跳跃肽将tcrα和β基因连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，编码tcr的核酸进一步包括标记，以确认细胞的转导或工程化以表达所述受体。
iv.定义
除非另有规定，否则本文使用的所有术语、符号和其他技术和科学术语或用词法旨在具有与所要求保护的主题的所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况中，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不应被解释为表示不同于本领域通常理解的实质性差异。
如本文所用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。例如，“一(a)”、“一(an)”意指“至少一个”或“一个或多个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“组件”和/或“基本上由......组件”的方面和变化。还应理解，本文所用的术语“和/或”是指且包含一个或多个相关的所列项目的任何和所有可能的组合。还应理解，术语“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”，当其在本文中使用时，指定了所述特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或单元的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组件、元和/或其组的存在或添加。
本申请公开了文本和附图中的几个数值范围。所公开的数值范围固有地支持所公开的数值范围内的任何范围或值，包括端值，即使在说明书中没有逐字说明精确的范围限制，因为本公开可以在所公开的数值范围内实施。
如本文所用，术语“载体”是指能够扩增另一核酸的核酸分子，该另一核酸与该核酸分子连接。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入至宿主细胞的基因组中的载体，其中所述载体已被引入该宿主细胞中。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。所述载体中有病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体和慢病毒载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，且指已引入外源核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和由其衍生的子代，而不考虑传代次数。子代可不与亲代细胞的核酸含量完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与最初转化的细胞中筛选或选择的子代的功能或生物活性相同的突变子代。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标记是“阳性”的陈述是指细胞上或细胞中特定标记物(通常是表面标记物)的可检测的存在。当提及表面标志物时，该术语是指通过流式细胞术检测的表面表达的存在，例如，通过用特异性结合所述标记物的抗体染色并检测所述抗体，其中，在显著高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配的对照进行相同步骤检测到的染色的水平，和/或在与已知对标记物呈阳性的细胞基本相似的水平，和/或在显著高于已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平，所述染色可通过流式细胞术检测。
如本文所用，细胞或细胞群对于特定标志物是“阴性”的陈述是指缺少细胞上或细胞中特定标记物(通常是表面标记物)的显著的可检测的存在。当提及表面标记物时，该术语是指通过流式细胞术检测表面表达的缺少，例如，通过用特异性结合标记物的抗体染色并检测所述抗体，其中，在显著高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配的对照进行相同步骤检测到的染色的水平，和/或在显著低于已知对标记物呈阳性的细胞的水平，和/或在与已知对所述标记物呈阴性的细胞相比基本上相似的水平，通过流式细胞术未检测到染色。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产品、物质或化合物的任何混合物，包括细胞。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊、水性溶液、非水性溶液或其任何组合物。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，例如人或其他动物，并且通常是人。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文献、科学文章和数据库，出于所有目的通过提述以其整体并入，其程度如同每个单独的出版物通过提述单独并入。如果本文所述的定义与通过提述并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中所述的定义相反或不一致，则本文所述的定义优先于通过提述并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于编制目的，不应解释为限制所描述的主题。
v.示例性实施方案
本文提供的实施方案包括：
1.一种生物反应器袋装配，其包含：
生物反应器袋，其包含：
正面，其包含多个端口，其中所述多个端口包含进料口、取样口和灌注口；
反面；
灌注过滤器，其不定地连接至所述灌注口；和
废物袋，其不定地连接至所述生物反应器的灌注口。
2.实施方案1的生物反应器袋装配，其中所述生物反应器袋的正面具有第一端和与所述第一端相对的第二端，且所述灌注口比所述第一端更靠近所述第二端。
3.实施方案1-2的生物反应器袋装配，其中所述进料口和所述取样口比所述第二端更靠近所述第一端。
4.实施方案1-3的生物反应器袋装配，其中所述生物反应器袋的正面具有第一侧和与所述第一侧相对的第二侧，且所述进料口比所述第二侧更靠近所述第一侧。
5.实施方案4的生物反应器袋装配，其中所述取样口比所述第一侧更靠近所述第二侧。
6.实施方案4-5的生物反应器袋装配，其中所述灌注口比所述第一侧更靠近所述第二侧。
7.实施方案1-6的生物反应器袋装配，其中所述灌注过滤器在所述生物反应器袋内部。
8.实施方案1-7的生物反应器袋装配，其进一步包含不定地连接至所述进料口的进料管装置。
9.实施方案8的生物反应器袋装配，其中所述进料管装置包含聚氯乙烯(pvc)管。
10.实施方案8-9的生物反应器袋装配，其中所述进料管装置包含y连接头，使得所述进料管装置具有两个入口。
11.实施方案1-10的生物反应器袋装配，其进一步包含不定地连接至所述取样口的取样管装置。
12.实施方案11的生物反应器袋装配，其中所述取样管装置包含pvc管。
13.实施方案1-12的生物反应器袋装配，其中将所述废物袋经由废物管装置不定地连接至所述灌注口。
14.实施方案13的生物反应器袋装配，其中所述废物管装置包含pvc管。
15.实施方案1-14的生物反应器袋装配，其中所述多个端口进一步包含进气口和出气口。
16.实施方案15的生物反应器袋装配，其中所述生物反应器袋的正面具有在所述第一端至所述第二端的中间的中部，且所述进气口和所述出气口比所述第一端或第二端更靠近所述中部。
17.实施方案15-16的生物反应器袋装配，其中所述多个端口由所述进料口、所述取样口、所述灌注口、所述进气口和所述出气口组件。
18.实施方案15-17的生物反应器袋装配，其进一步包含含有不定地连接至所述进气口的进气过滤器的进气管装置和含有不定地连接至所述出气口的排气过滤器的出气管装置。
19.一种生物反应器系统，其包含：
生物反应器摇杆；和
生物反应器袋，其支撑在所述生物反应器摇杆上，所述生物反应器袋包含：
正面，其包含多个端口，其中所述多个端口包含进料口、取样口和灌注口；
反面；
灌注过滤器，其不定地连接至所述灌注口；和
废物袋，其不定地连接至所述生物反应器袋的灌注口。
20.实施方案19的生物反应器系统，其进一步包含不定地连接至所述进料口的进料管装置。
21.实施方案20的生物反应器系统，其中所述进料管装置包含y连接头，使得所述进料管装置具有第一和第二入口。
22.实施方案21的生物反应器系统，其中将细胞培养基源不定地连接至所述进料管装置的各入口。
23.实施方案22的生物反应器系统，其中各入口包含pvc，且将所述细胞培养基源结合至所述入口的pvc。
24.实施方案21的生物反应器系统，其中将细胞源不定地连接至所述第一入口，且将细胞培养基源不定地连接至所述第二入口。
25.实施方案24的生物反应器系统，其中各入口包含pvc，且将所述细胞源结合至所述第一入口的pvc，且将所述细胞培养基源结合至所述第二入口的pvc。
26.实施方案19-25的生物反应器系统，其中所述灌注过滤器在所述生物反应器袋内部。
27.实施方案19-26的生物反应器系统，其中所述生物反应器袋的正面具有第一端和与所述第一端相对的第二端，且所述灌注口比所述第一端更靠近所述第二端。
28.实施方案27的生物反应器系统，其中所述进料口和所述取样口比所述第二端更靠近所述第一端。
29.实施方案19-28的生物反应器系统，其中所述生物反应器袋的正面具有第一侧和与所述第一侧相对的第二侧，且所述进料口比所述第二侧更靠近所述第一侧。
30.实施方案29的生物反应器系统，其中所述取样口比所述第一侧更靠近所述第二侧。
31.实施方案29-30的生物反应器系统，其中所述灌注口比所述第一侧更靠近所述第二侧。
32.实施方案19-31的生物反应器系统，其中所述灌注过滤器在所述生物反应器袋内部。
33.实施方案19-32的生物反应器系统，其进一步包含不定地连接至所述进料口的进料管装置。
34.实施方案33的生物反应器系统，其中所述进料管装置包含聚氯乙烯(pvc)管。
35.实施方案33-34的生物反应器系统，其中所述进料管装置包含y连接头，使得所述进料管装置具有两个入口。
36.实施方案19-35的生物反应器系统，其进一步包含不定地连接至所述取样口的取样管装置。
37.实施方案36的生物反应器系统，其中所述取样管装置包含pvc管。
38.实施方案19-37的生物反应器系统，其中将所述废物袋经由废物管装置不定地连接至所述灌注口。
39.实施方案38的生物反应器系统，其中所述废物管装置包含pvc管。
40.实施方案19-39的生物反应器系统，其中所述多个端口进一步包含进气口和出气口。
41.实施方案40的生物反应器系统，其中所述生物反应器袋的正面具有位于所述第一端至所述第二端的中间的中部，且所述进气口和所述出气口比所述第一端或第二端更靠近所述中部。
42.实施方案40-41的生物反应器系统，其中所述多个端口由所述进料口、所述取样口、所述灌注口、所述进气口和所述出气口组件。
43.实施方案40-42的生物反应器系统，其进一步包含含有不定地连接至所述进气口的进气过滤器的进气管装置和含有不定地连接至所述出气口的排气过滤器的出气管装置。
44.一种使用生物反应器系统的方法，其包括：
提供生物反应器袋装配的生物反应器袋，其中所述生物反应器袋装配包含：
生物反应器袋，其具有正面，所述正面包含多个端口，其中所述多个端口包含进料口、取样口和灌注口；反面；和灌注过滤器，其不定地连接至所述灌注口；
废物袋，其不定地连接至所述生物反应器袋的灌注口；且
通过所述进料口供给细胞培养基至所述生物反应器袋；
通过所述进料口供给细胞至所述生物反应器袋；
利用由生物反应器摇杆提供的搅动培养所述生物反应器袋中的细胞；
通过所述灌注口将废滤液转移至所述废物袋；且
收获经培养的细胞。
45.实施方案44的方法，其中所述生物反应器袋装配包含不定地连接至所述进料口的进料管装置，其中所述进料管装置包含y连接头，使得所述进料管装置具有第一入口和第二入口。
46.实施方案45的方法，其中通过将细胞培养基源结合至所述第一入口来添加所述细胞培养基。
47.实施方案45的方法，其中通过将细胞源结合至所述第一入口来添加所述细胞。
48.实施方案45的方法，其中通过将细胞培养基源结合至所述第一入口来添加所述细胞培养基，且通过将细胞源结合至所述第二入口来添加所述细胞。
49.实施方案44-48的方法，其中所述多个端口进一步包含进气口和出气口。
50.实施方案49的方法，其进一步包括通过所述进气口供给用于细胞培养的气体至所述生物反应器袋。
51.实施方案50的方法，其进一步包括通过所述出气口从所述生物反应器袋中去除一部分所述气体作为废气。
52.实施方案45的方法，其中通过将收集袋结合至所述第一或第二入口并反转所述进料管装置的流动方向来收获经培养的细胞。
53.实施方案44-52的方法，其中所述多个端口包含进气口，且所述方法进一步包括通过所述进气口用气体对所述生物反应器袋充气。
54.实施方案44-53的方法，其进一步包括通过所述取样口取回经培养的细胞的样品。
实施例
本文包括的下列实施例仅用于说明的目的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：产生用于自体细胞疗法的工程化t细胞的示例性过程
此实施例描述了利用任何所提供的实施方案的生物反应器袋装配的示例性过程，例如由图1-7所示的示例性生物反应器袋装配，以根据本文提供的某些实施方案制备用于自体细胞疗法的工程化t细胞。
通过基于免疫亲和的富集和冷冻从人白细胞分离术样品中分离含有cd4+和cd8+细胞的组合物。随后，在无菌条件下将cd4+和cd8+细胞解冻并转移至封闭系统。在刺激条件下培养所述细胞，然后用编码重组受体的病毒载体转导所述细胞，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。所述重组受体可以是嵌合抗原受体(car)，例如抗cd19car。转导后，在无菌条件下，将所述细胞转移进与所述封闭系统连接的生物反应器袋装配中，用于随后的扩增。
将所述生物反应器袋装配连接至在封闭系统下调节细胞培养条件的生物反应器(如xuriw25)。将含有一个或多个细胞因子的扩增培养基添加至所述细胞。所述生物反应器能够在静态条件下或在灌注情况下培养所述细胞，由此新鲜培养基以恒定的速率逐渐地取代用过的培养基。至少一部分的所述细胞培养扩增是在灌注的情况下进行的，例如以290ml/天、580ml/天或1160ml/天的速率。所述生物反应器通过保持温度在或接近37℃和co2水平在或接近5％以及稳定的空气流在或接近0.1l/分钟来调节细胞培养条件。至少一部分细胞培养扩增是在摇动的情况下进行的，例如以5°和～10°的角度，例如6°，例如以恒定的摇动速率，例如5～15rpm的速度，例如6rpm或10rpm。扩增所述细胞直至它们达到阈值量或细胞密度。当达到所述阈值时，将所述生物反应器袋和所述生物反应器之间的连接密封，且将所述袋转移用于随后的细胞配制，例如冷冻。
实施例2：产生用于自体细胞疗法的工程化cd4+和cd8+t细胞组合物的示例性过程
此实施例描述了利用任何所提供的实施方案的生物反应器袋装配的示例性过程，例如由图1-7所示的示例性生物反应器袋装配，以根据本文提供的某些实施方案制备用于自体细胞疗法的工程化cd4+和cd8+t细胞的各自组合物。
通过基于免疫亲和的富集和冷冻从人白细胞分离术样品中分离cd4+和cd8+细胞的各自组合物。随后，在无菌条件下将所述组合物的cd4+和cd8+细胞解冻并分别转移至封闭系统。在刺激条件下培养所述cd4+和cd8+细胞，然后用编码重组受体的病毒载体转导，例如逆转录病毒或慢病毒。所述重组受体可以是嵌合抗原受体(car)，例如抗cd19car。转导后，在无菌条件下，将所述cd4+和cd8+细胞分别转移进与所述封闭系统连接的生物反应器袋装配中，用于随后的扩增。
将所述生物反应器袋装配连接至在封闭系统中调节细胞培养条件的生物反应器(如xuriw25)。将含有一个或多个细胞因子的扩增培养基添加至所述cd4+和cd8+细胞。至少一部分所述细胞扩增是在灌注的情况下进行的，例如以290ml/天、580ml/天或1160ml/天的速率。所述生物反应器通过保持温度在或接近37℃和co2水平在或接近5％以及稳定的空气流在或接近0.1l/分钟来调节所述细胞培养条件。至少一部分的所述细胞培养扩增是在摇动的情况下进行的，例如以5°～10°的角度，例如6°，例如以恒定的摇动速率，例如5～15rpm的速度，例如6rpm或10rpm。分别各自扩增所述cd4+和cd8+细胞直至它们达到阈值量或细胞密度。当达到所述阈值时，将所述生物反应器袋和所述生物反应器之间的连接密封，且将所述袋转移用于随后的细胞配制，例如冷冻。
呈现以上描述是为了使本领域技术人员能够实现和使用本公开，并且在具体应用和其要求的背景下提供以上描述。对于本领域技术人员而言，对优选实施方案的各种修改是显而易见的，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，本文所定义的一般原理可以应用于其他实施方案和应用。因此，本公开不旨在限制所示的实施方案，而是与符合本文公开的原理或特征的最宽范围相一致。
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