一种安达喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因ump及其鉴定方法与流程

本发明涉及一种安达喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因ump及其鉴定方法，属于分子生物学和基因工程技术领域。

背景技术：

土壤作为人类赖以生存的环境资源，保障了人们的基本生活，土壤盐渍化现象日趋严重，据联合国教科文组织和粮农组织的不完全统计，世界盐渍土壤面积约为109hm²；据我国第二次全国土壤普查结果显示，中国盐渍土总面积约36×l06hm²，占全国可利用土地面积4.88％。耕地盐渍化面积达到9.21×l06hm²，占全国耕地面积6.62％，且主要分布在东北、西北、华北和沿海地区；土壤的盐化不但影响到植物的生长，而且降低农、牧业产量，公共设施及出土遗迹也备受影响，被称为世界性低产土壤；因此，开发利用盐渍土壤对耕地面积的增加，农、林、牧、副、渔业的有利发展，生态环境的改善等发挥重要作用。目前，土壤盐渍化己经成为全球科研工作者的研究热点问题之一，人们及科研工作者非常重视盐渍土壤的改良及可持续利用这项工作。

我国的东北地区作为农、林业和畜牧业生产基地，素以肥沃的黑土地著称，但目前，盐渍土面积在东北地区的已达到了3.84×l06hm²，约占全国总盐渍土地面积的10％，达到该地区总面积的3.1％，而耕种盐渍土地面积达到了该地区总耕种面积的6.8％，是我国盐碱土四大分布区之一且已经严重影响了该地区的农、林、畜牧业等产业及经济的快速发展；自20世纪以来，世界各国均对盐碱土采取改良措施；如苏联，对盐碱土壤造林，选育耐盐植物等，取得了一系列的成果；其中由于生物改良措施具有取于自然并还予自然，对生态环境破坏较少等优点，相对于其他改良措施而言，既保护了生态平衡又恢复和改良了盐渍土，发挥了重要作用；主要的生物改良措施包括：耐盐作物的选择、有效微生物的利用、生物有机肥料施用等措施；分离高效耐盐微生物与种植耐盐植物的二者协同作用可以有效的改善土壤盐渍土，因此高效耐盐微生物和植物资源的挖掘，对于盐渍土的改良具有重要的意义；由于细菌耐盐机理与植物的存在很大的相似性，因此对耐盐细菌资源库以及耐盐机理的深入研究，特别是发掘新的耐盐功能基因显得尤其重要。

从分子生物学和基因工程技术角度来看，构建高效耐盐碱的基因工程菌株以及转基因植物是获得耐盐碱微生物和植物的首选途径；由于细菌与植物在耐盐碱方面有很大的相似性，它们在高渗条件下，均在细胞内积累相似的化合物；因此，高效耐盐碱细菌资源库的构建及关键新功能基因的发掘，不仅可以解决构建耐盐碱细菌基因工程菌株的问题，而且优良的高效耐盐碱细菌基因可以为构建高效耐盐碱转基因植物提供重要基因资源储备。

钠离子对细胞正常的生长代谢及物质运输起到极其重要的作用，na⁺的浓度超出一定范围就会对细胞产生毒害作用；微生物在不断的生物进化过程中，形成了多种na⁺转运相关的调节机制，使高浓度的na⁺对细胞的毒性降至最低；如na⁺离子所具有的外排作用，是某些膜蛋白通过行使转运功能将细胞内多余的na⁺排出胞外，从而使细胞内的na⁺浓度维持在正常状态下，这类蛋白在大多数细菌中都存在，如钠/氢逆向转运蛋白(na⁺/h⁺antiporters)；除该类蛋白之外，另外一些耐盐微生物能够在形成一种富含酸性氨基酸的特殊结构在其细胞壁上，利用其所带的负电荷与na⁺结合，进而维持细胞壁的稳定；其他的学者研究表明，钠/氢逆向转运蛋白在嗜盐微生物运输na⁺时发挥最主要的作用；钠/氢逆向转运蛋白是位于细胞膜上的一种跨膜蛋白，也常常被叫作钠/氢泵；生物体中(微生物、植物、动物体)存在着大量的钠/氢泵，主要作用是维持细胞内的ph及na⁺离子的平衡。

所以，对抗盐基因的分离是当前利用基因工程方法进行抗盐作物培育的首要任务；基于基因文库筛选法并结合钠离子耐受性功能互补法，从安达喜盐芽孢杆菌的基因组中随机筛选有关na⁺输出的相关基因，并通过测序分析及生理生化实验来进一步确定有研究价值的基因，通过对其离子转运功能的鉴定和自身蛋白的定位和分析，初步验证该基因的离子转运机制，从而获得一个新型的na⁺/h⁺逆向转运蛋白；本发明的ha_ump是新型的首次被挖掘和鉴定的新型na⁺/h⁺逆向转运蛋白。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提出了一种安达喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因ump及其鉴定方法，提供一种与耐盐碱相关的基因，命名为ump；提高植物耐盐碱性的转基因技术领域提供一种新的有效选择；对功能未知的ump基因及其编码的蛋白的进行了功能注释；丰富微生物耐盐碱基因资源，以构建高的效耐盐碱工程菌，为应用转基因植物方面和开发微生物肥料提供新的基因资源。

本发明以安达喜盐芽胞杆菌作为分离新型有效的耐盐碱基因的研究对象供体，借助大肠杆菌(escherichiacoli)盐敏感突变株knabc(δnhaa，δnhab，δchaa)的生理特征，将基因文库筛选和功能互补相结合的技术手段，成功获得耐盐碱基因ump，利用各种生物软件对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，发现该基因序列全长270bp，其编码的蛋白属于ump蛋白(unknownmembraneprotein)，而且其功能尚未被注释；所以，我们将其基因命名为ump，其编码的蛋白命名为ump；功能互补实验显示，ump可使盐敏感突变株knabc在0.2mnacl或5mmlicl的培养基上恢复生长，而且在偏碱性的环境中，其生长能力要明显好于负对照，这表明了该基因具有一定的耐盐碱能力；且利用荧光猝灭技术，发现ump具有钠/氢逆向转运蛋白活性；跨膜预测分析显示，ump具有3个跨膜区，同源比对和系统进化发育学分析表明，ump是一种新型有效的耐盐碱基因；

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了安达喜盐芽胞杆菌相关基因ump的克隆鉴定及用途；其中，所述的ump基因长270bp，是一个完整开放阅读框(orf)，orf的核苷酸序列如seqidno.1所示。

更进一步的，本发明还提出了ump基因的编码蛋白在构建高效耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的用途。

其中，所述的ump为ump基因在异源原核宿主细胞中表达的蛋白。

再进一步的，本发明还提出了一种耐盐碱基因的分离方法，包括以下步骤：

(1)通过基因文库和功能互补相结合的方法，以0.2mnacl的氨苄抗性固体培养基作为筛选工具，首先得到含有耐盐碱基因的片段；

(2)利用生物信息学软件对基因片段进行分析，确定可能的耐盐碱的基因，通过pcr扩增得到ump基因，该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；构建含有ump基因的原核表达载体；

(3)通过基因功能互补的方法，首先对该基因的生理功能进行鉴定；再通过荧光猝灭技术手段，对ump基因编码的蛋白功能进行鉴定。

本发明公开安达喜盐芽胞杆菌耐盐碱基因鉴定及其用途，从此菌中获取并具有序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，本发明所提出的ump基因对盐碱地土壤改良具有重要意义，可用于构建高的效耐盐碱工程菌、开发微生物肥料和提高植物耐盐碱性的转基因领域的研究。

附图说明

图1是在线生物软件分析ha_ump蛋白的跨膜区及疏水性示意图；

其中，a.蛋白的跨膜区预测(方块表示跨膜区；a1线表示靠近周质空间一侧的亲水性环；a2线表示靠近细胞质一侧的亲水性环)；b.蛋白的疏水性分析。

图2是ha_ump基因原核表达载体pet-22b-ump的构建策略流程图。

图3是ha_ump基因亚克隆和构建ha_ump基因表达载体pet-22b-ump的电泳检测图；

a.ha_umpwithitssdandpromoter基因pcr产物电泳结果(第1-4泳道为umpwithitssdandpromoterpcr产物)；b.1-2泳道为peasy-t3-ump,3泳道为peasy-t3作为对照；c.peasy-ump鉴定结果(1、2:peasy-umpdigestedbyecori)；d.ha_ump基因pcr产物电泳结果(第1-3泳道为umppcr产物)e.2-4泳道为peasy-t3-ump,1泳道为peasy-t3作为对照；f.peasy-t3-umpdigestedbyndei-xhoi；g.peasy-t3-ump和pet-22bdigestedbyndei-xhoi胶回收图；h.2-4:pet-22b-ump质粒，1:pet-22b对照；i.pet-22b-ump酶切鉴定(1:pet-22b酶切对照2：pet-22b-umpdigestedbybglii-xhoi)。

图4是ha_ump基因生理功能的鉴定图；

由图可知，原始克隆e.coliknabc/puc-sl43,knabc/pet22b-ump能,但是阴性对照knabc/puc18以及knabc/pet22b不能,在0.2mnacl或5mmlicl的胁迫条件下生长。即该基因具有耐nacl的能力，能够使盐敏感突变株e.coliknabc恢复生长,此结果也明确了ump基因具有licl的耐受能力，

图d&e可知：基因ump在50mmnacl胁迫下，还能够在ph8.0的环境下使大肠杆菌(e.coli)knabc生长良好，这又进一步明确基因ump具有耐受盐碱的能力。

图5是ha_ump蛋白的同源性比对图；

其中，━表示跨膜区。

图6是ha_ump蛋白活性的鉴定图；

其中，a代表na⁺/h⁺逆向转运活性，b代表li⁺/h⁺逆向转运活性，c代表k⁺/h⁺逆向转运活性。

图7是ha_ump蛋白活性的ph轮廓图。

图8是ha_ump对na⁺、li⁺、k⁺的亲和能力图。

图9ha_ump蛋白细胞定位图；

其中，m为预染蛋白分子量标准marker，1、3、5泳道为表达有ump蛋白的相应样品，2、4、6泳道为阴性对照相应样品。

图10为图2x1和x2处局部放大结构示意图。

具体实施方式

实施例1.在线生物软件分析ha_ump蛋白的跨膜区及疏水性测试，本发明利用在线预测网站http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/和http://web.expasy.org/protscale/对ump基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白ump具有三个跨膜区，且蛋白呈现出高疏水性；如图1所示，

实施例2.如图2和图10所示，ha_ump基因原核表达载体表达载体pet28b-ump，pet22b-ump的构建流程包括：

首先对原始克隆puc-sl43中的ump基因进行亚克隆，确认其是否为真正的耐盐碱基因，即从原始克隆上从ump启动子序列到终止密码子利用primer5软件设计ump-f¹/ump-r¹特异引物(如表1所示)pcr亚克隆到peasy-t3上化转大肠杆菌缺陷株knabc验证其能在0.2mlbk培养基中互补，即ump为真正的耐盐碱基因，接下来pet22b-ump表达载体的构建，根据ump基因序列，首先利用primer5软件设计ump-f/ump-r特异引物(如表2所示)，并在基因的5’和3’端分别引入ndei、xhoi两个酶切位点，然后进行ump基因的扩增(如表2所示)，对ump基因进行亚克隆。

表1ump亚克隆引物序列

表2ump基因表达载体构建引物序列

表3pcr扩增反应

将pcr产物加a纯化后连接到克隆载体peasy-t3上，化转到trans1-t1感受态细胞中，将转化产物进行蓝白斑筛选。结果如图3可知，pcr产物:ump(270bp)大小与dnamarker比对，应符合pcr产物的实际长度。为了进一步鉴定peasy–ump重组质粒是否正确，用限制性内切酶进行酶切验证。如图3可知，双酶切产生的片段大小与pcr产物大小基本一致，为进一步确定序列的准确性，对插入片段进行测序，测序结果与原始序列一致。以上结果表明ump基因成功插入peasyt3载体中。

ump亚克隆(ndei-xhoi)建到pet28b(卡那抗性)(ndei-xhoi)，然后用bglii-xhoi，构建到pet22b(氨苄抗性)化转至大肠杆菌(e.coli)knabc中，获得重组质粒pet22b-ump,对插入片段进行双酶切验证，酶切结果正确的质粒进行基因测序，测序结果与原始序列一致。表明重组质粒pet22b-ump构建成功(图3)。

实施例3ha_ump基因生理功能的鉴定

为了鉴定ha_ump基因的生理功能，本发明以knabc/puc18为负对照，将原始克隆knabc/puc-sl43的菌液按1％接种量转接到含有不同盐浓度(0-0.3mnacl或50mmlicl)的新鲜lbk培养基中培养24h。结果如图4a-b所示：在0.2mnacl或5mmlicl的胁迫下，与负对照相比，亚克隆knabc/pet22-ump和原始克隆knabc/puc-sl43均能使盐敏感突变株knabc恢复生长，并且他们的生长趋势基本一致。在碱性环境中(如图4c-d)，原始克隆knabc/puc-sl43在加入50mmnaclph8时能使盐敏感突变株knabc恢复生长，而在不加nacl的ph8.5的环境中，恢复生长。这就说明ump基因具有明显的耐盐碱能力。

实施例4ump基因表达蛋白的生物信息学分析

一、ha_ump基因编码蛋白理化性质

采用expasyprotparam对ump基因编码蛋白进行基本的理化性质的预测和分析。结果表明：耐盐碱基因ump编码89个氨基酸，相对分子量为0.928055kd，等电点11.00，为碱性蛋白；组成的原子是c(437)h(731)n(105)o(104)s(5)，一共1382个原子，理论半衰期10h，不稳定参数50.67，是不稳定蛋白，氨基酸中带正电荷氨基酸(arg、lys)4个，带负电荷氨基酸(asp、glu)1个。ump蛋白的氨基酸组成(表3)，结果显示其中包含的疏水性氨基酸、亲水性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸分别为66.3％、21.1％、1.1％、6.6％。说明耐盐碱基因ump编码蛋白具有一定疏水能力且不稳定的碱性蛋白。

表3ha_ump基因编码蛋白氨基酸组成

二、ha_ump与同系物的同源性比对

本发明选择了与它进化距离最近的10个同源蛋白进行多序列比对(图6)，结果发现：ha_ump与这些同系物的同源性在59.6-73％之间，其中与halobacillusmassiliensis的同源性最高为73％，但是高度保守的区域很少，黑线表示的是三个跨膜区。我们通过neighbour-joining算法试着构建ha_ump蛋白的系统发育树，我们选取了ha_ump和它的10个同源性最近的60-73％蛋白,10个同源性较近43-58％蛋白和10个同源性非常远的30-39％蛋白以及选取具有代表性的、已知的及推测的具有na⁺/h⁺逆向转运蛋白活性的蛋白和其它具有na⁺/h⁺逆向转运活性的蛋白共同建树。结果表明(图未出示)：ha_ump与它的同系物及已知的na⁺/h⁺逆向转运蛋白或具有na⁺/h⁺逆向转运活性的蛋白聚簇阙值(bootstrapvalues)都低于为60％，进化距离都较远，这就表明了ump的进化树分支是不可信的，但是同时也说明，ha_ump应该是一类新型的na⁺/h⁺逆向转运蛋白，与http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp在线比对的所有ump蛋白并不属于一类蛋白家族，而且该蛋白并非是已经鉴定过的na⁺/h⁺逆向转运蛋白或具有na⁺/h⁺逆向转运活性的其他蛋白

实施例5ha_ump蛋白功能的鉴定

一、ha_ump蛋白活性的鉴定

本发明将含有pet-ump和pet22b的knabc细胞，用法式细胞破碎机制备成反转膜，以吖啶橙作为荧光指示剂，检测其na⁺(li⁺，k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性(图7)。结果发现：在荧光猝灭的最低平衡点加入单一的单价阳离子溶液，反转膜knabc/pet-ump的荧光值升高(图7-a&b&c左侧)，而负对照knabc/pet22b在加入单价阳离子溶液后荧光值没有变化(图6-a&b&c右侧)。所以，我们认为ha_ump是具有转运na⁺(li⁺、k⁺)/h⁺逆向转运蛋白活性的。

二、ha_ump蛋白活性的ph轮廓

钠/氢逆向转运蛋白对ph是具有一定的依赖性的，即它的转运活性会随环境中ph的变化而改变。因此，本发明在不同ph(7.0-9.5)的反应体系中，检测ha_ump的蛋白活性。结果发现：在ph7.0-9.0的范围内，ha_ump对na⁺、li⁺、k⁺的转运活性会随ph的变化而改变(其趋势见图7)，而且当反应体系中的ph为9.0时，ump的离子转运活性最高，并且对三种不同离子的转运活性也存在一定的差距。

三、ha_ump对na⁺、li⁺、k⁺的亲和能力

由于ha_ump对na⁺、li⁺、k⁺三种离子转运能力是有差别的，即对底物偏好性不同。当k0.5值越小时，就表示对某一底物的转运偏好性越好。所以，本发明通过prism5.0数据分析软件计算k0.5值(图8)。发现，当转运活性达到最大反应活性的一半时，na⁺、li⁺、k⁺的k0.5值分别是0.78±0.07mm、0.94±0.11mm、1.18±0.10mm，换而言之，ha_ump对na⁺的偏好性最好，对三种离子的偏好由强到弱依次：na⁺>li⁺>k⁺。

实施例六ha_ump蛋白的细胞定位

本发明利用超离法将knabc/pet22-ump细胞的胞浆蛋白与膜蛋白分离开，再通过蛋白印迹杂交(westernblot，简称wb)的技术手段，分别对提取的细胞全蛋白(超声破碎上清液)、胞浆蛋白(超离上清液)和膜蛋白(超离沉淀)进行检测。理论上，wb实验只能在制备的细胞全蛋白(超声破碎上清液)和膜蛋白(超离沉淀)样品中检测出目的条带(即ha_ump所携有的标签抗体信号)，而胞浆蛋白样品(超离上清液)则检测不出目的条带。

发现(图9)：第一，与负对照相比(b-2、4、6)，ha_ump蛋白只在细胞的全蛋白和膜蛋白样品中被检测出条带(b-1、5)，而胞浆蛋白样品中没有(b-3)，综上所述，ha_ump的确是位于在内膜上的膜蛋白，这与之前对它的分析是相互印证的。

上述实施例，仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。