本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及陆地棉gst基因簇及其在提高植物黄萎病抗性中的应用。
背景技术：
棉花黄萎病(verticilliumwilt)是一种土传维管束病害，其病原菌主要是大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)和黑白轮枝菌(verticilliumalbo-atrum)，于1935年由美国引进斯字棉4b品种时传入我国。目前黄萎病已扩展到我国三大棉区，严重威胁着我国棉花产业安全。2009年，我国有超过50％的棉田不同程度的发生黄萎病。调查发现，大丽轮枝菌是我国各大棉区棉花黄萎病的主要致病菌。棉花黄萎病一旦发生，会造成发病面积不断扩大，发病程度不断加深，持续时间不断延长，最终造成连年减产及纤维品质下降。棉花黄萎病防治难度较大，化学防治常造成严重环境污染，且至今还没有有效的化学药剂或手段控制该病的发生。实践证明，培育抗病品种较轮作倒茬、药剂防治等措施更加环保、有效，越来越受到育种家的重视。常规育种方法在培育棉花抗病品种中发挥了重要作用，但由于育种方法单一、陆地棉遗传基础狭窄、棉属种间远缘杂交困难等原因，导致育种进展缓慢，不能满足生产需求。而利用生物技术手段发掘棉花黄萎病抗性基因，探索、解析棉花抗黄萎病机制，对于培育抗病品种具有极其重要的理论价值和应用前景。
gst基因家族是一类古老的、由多个亚类组成的多样性基因家族，广泛分布于动物、植物、细菌和真菌中。植物gst基因家族类型划分最初是根据gst蛋白质结构的保守性、底物特异性及免疫特性等，分为typei(phi)，typeii(zeta)，typeiii(tau)，typeiv(theta)四种类型。随着对gst研究的不断深入，科学家在植物体内又发现了脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbatereductase,dhar)和lambda两个新类型的gst亚类。随后，oakely等又将四氯氰醌脱卤素酶(tetrachlorohdroquinonedehalogenase,tchqd)、真核翻译延伸因子1b的γ-亚基(theγ-subunitoftheeukaryotictranslationelongationfactor1γ,ef1bγ)归入植物gst基因家族。最后，研究发现一类微粒体蛋白mapeg类(membraneassociatedproteinineicosanoidandglutathionemetabolism,mapeg)也属于gst基因家族，其具有膜相关蛋白特性。至此，植物中的gst包含tau、phi、zeta、theta、lambda、dhar、tchqd、ef1bγ和mapeg九个亚类。其中，tau类和phi类是植物中特有的gst，同时也是含量最为丰富的类别，具有抗除草剂功能，这两类是以丝氨酸为活性位点进行催化作用，也是唯一用同源亚基二聚化而行使解毒功能的gst。其中tau类通常有1个内含子；phi类一般有两个内含子。实际生产中，生物和非生物胁迫常导致棉花减产、纤维品质下降，而gst在植物抵抗生物和非生物胁迫过程中常发挥重要作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供陆地棉gst基因簇及其在提高植物黄萎病抗性中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的陆地棉gst基因簇，所述基因簇包括基因ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510，它们的核苷酸序列分别为：
i)seqidno:1-3所示的核苷酸序列；或
ii)seqidno:1-3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与seqidno:1-3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
其中，所述基因簇中的主效基因为ghat09g1509。
本发明还提供提供棉花黄萎病抗性基因，所述基因选自ghat09g1508、ghat09g1509或ghat09g1510中的至少一种。所述基因是从抗病陆地棉品种农大601中克隆获得的。
本发明还提供含有所述基因簇或所述抗性基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系。
本发明还提供所述基因簇、所述棉花黄萎病抗性基因或含有所述基因簇或所述抗性基因的生物材料在提高植物黄萎病抗性中的应用。
所述应用包括：
1)使植物包含所述基因簇或所述棉花黄萎病抗性基因；或
2)使植物表达所述基因簇或所述棉花黄萎病抗性基因。
携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2ndedition)。
本发明所述植物包括但不限于棉花、烟草。所述黄萎病是由大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)和/或黑白轮枝菌(verticilliumalbo-atrum)所致。
本发明还提供所述基因簇、所述棉花黄萎病抗性基因或含有所述基因簇或所述抗性基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。
本发明还提供所述基因簇、所述棉花黄萎病抗性基因或含有所述基因簇或所述抗性基因的生物材料在植物育种中的应用。其中，所述育种的目的为提高植物黄萎病抗性。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次公开了陆地棉gst基因簇，其包括棉花黄萎病抗性基因ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510，并揭示了其生物学功能，含有所述基因簇或所述抗性基因的植物显示出黄萎病抗病性。
本发明首次发现在四倍体棉花形成过程中，陆地棉a亚组09染色体上的一个tau类gst基因簇(涉及ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510三个基因)源于不平衡的基因丢失，并经历了正选择作用。基于主效基因ghat09g1509的烟草转基因和ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510三个基因的棉花vigs试验，首次证明该基因簇在棉花黄萎病抗性反应中具有重要功能。
附图说明
图1为本发明实施例1中黄萎病菌诱导的不同抗性棉花品种gst差异表达基因热图。
图2为本发明实施例3中ghgst基因在黄萎病菌胁迫下陆地棉抗、感品种根中的qrt-pcr分析。
图3为本发明实施例3中黄萎病菌胁迫下植株黄萎病抗性鉴定结果；其中，a：转基因烟草黄萎病抗性鉴定结果；b：植株部分茎组织黄萎病菌复苏培养结果；c：黄萎病菌胁迫下植株病级统计结果。wt：野生型烟草；oe：转基因植株。
图4为本发明实施例3中转基因和野生型植株h2o2含量和cat、pod的活性检测结果；其中，mock：水处理；vd：黄萎病菌胁迫处理。
图5为本发明实施例3中ghgst-vigs植株的抗病性鉴定结果；其中，a：黄萎病菌胁迫下植株表型；b：黄萎病菌胁迫下植株病级统计结果；c：黄萎病菌胁迫下根表型；d：黄萎病菌胁迫下植株茎组织黄化表型；e：植株部分茎组织黄萎病菌复苏培养结果。wt：野生型植株；vigs：干涉植株。
图6为本发明实施例3中黄萎病菌胁迫下沉默和野生型植株的h2o2含量和cat、pod的活性检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1陆地棉gst基因簇的功能分析
通过对陆地棉基因组进行gst基因家族分析首次发现，陆地棉形成后两个同源tau类cluster(包括gh_a09g1508,gh_a09g1509和gh_a09g1510；gh_d09g1520和gh_d09g1521)在基因组中正在发生遗传革新及基因再平衡，这两个同源cluster定位在陆地棉a、d亚组的9号染色体上。通过转录组，vigs(病毒诱导的基因沉默)及超表达试验证明a亚组中的cluster在棉花黄萎病抗性反应中发挥了重要功能，而位于d亚组中同源cluster正在发生退化(其中一个基因从雷蒙德氏棉遗传给陆地棉后已经丢失，一个基因丢失了一半，一个基因没有表达)。这一结果有力证明了位于a亚组的cluster可能经历了更高的选择压，且该功能cluster能够满足陆地棉正常的生长需求。通过对棉属近源物种可可基因组分析发现，该同源cluster已经存在，说明该cluster在6千万年前已经形成。
进一步对及进化节点自然选择分析发现包含目标cluster包括gh_a09g1508,gh_a09g1509和gh_a09g1510；gh_d09g1520和gh_d09g1521)的进化枝及节点经历了正选择，这一结果证明了前述结论，即位于a亚组的cluster经历了正选择效应。
在黄萎病菌胁迫下构建的转录组文库中，检测到11个a亚组和6个d亚组gst基因存在表达差异。其中a亚组9号染色体tau类基因ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510均存在差异表达，且ghat09g1509基因仅在抗性品种农大601中检测到特异表达(图1)。
实施例2棉花黄萎病抗性基因ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510的获得
根据陆地棉tm-1基因组测序结果(lietal.,2015；zhangetal.,2015)，设计如下引物：
ghat09g1508:f:ttgatatcatgggcgaagaagtgcaggtttttggc和r:ttggatcctcattgggaaagactagctttgacgcghat09g1509:f:gctgagctcttaggccttagcattatctt和r:agaggatccatgggtgaagaagtgaagghat09g1510:f:ccgaattcatgggtgaagaggtgaagg和r:ttcccgggtcatttggaaagatgagc
从棉花品种农大601中分别克隆获得基因ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510。
基因ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510的核苷酸序列分别如seqidno:1-3所示。
实施例3基因ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510的功能分析
1.陆地棉gst基因簇的核心基因gh_a09g1509的功能分析
1.1.qrt-pcr分析表明，黄萎病菌诱导下gh_a09g1509在抗病品种农大601根中的表达高于感病品种ccri8，并且在接菌(大丽轮枝菌)后12h表达量最高(图2)，说明该基因参与棉花与黄萎病菌的互作。
1.1.1无菌棉苗的种植培养
将农大601和ccri8种子用浓硫酸脱绒处理，用清水冲洗干净后晾干。在清水中浸泡催芽12h，期间换水2-3次，在超净工作台中用0.1％的氯化汞浸泡露白的种子1min，再用无水乙醇消毒浸泡30s后，用灭菌的超纯水冲洗5次。用镊子去掉种皮后将种子放入装有ms培养基的玻璃培养瓶中，在光强为3500lux、光周期为14h、白天28℃、夜间23℃的培养室中培养。
1.1.2黄萎病菌的活化与培养
将高致病力落叶型黄萎病菌株临西2-1从4℃冰箱取出，用无菌接种环接种在制备好的pda平板上，放于25℃恒温培养箱中暗培养，直至病菌长满整个平板。然后将其接种于czapek液体培养基中，置于25℃摇床，150rpm震荡培养10d。使用前将黄萎病菌临西2-1(大丽轮枝菌)孢子悬浮液的浓度调整到1×107cfu/ml。
1.1.3接菌处理与取样
将整齐、健壮的棉苗从装有ms的三角瓶中连根拔起，在调试好浓度的黄萎病菌孢子悬浮液中蘸根30s，再次转移到ms培养基，25℃培养室中培养。取接菌后0h、6h、12h、24h、36h和48h的根组织，每个时间点取3株，用无菌水冲洗后液氮速冻，储存于-80℃，以上处理均以接水处理作为对照，并分别取样保存，同时每个时间点取三个生物学重复。
1.1.4总rna的提取
参照北京艾德来easyspinrna快速提取试剂盒提取rna，具体步骤参照试剂盒说明书。
1.1.5rna的纯化
(1)按照下列反应体系纯化rna:总rna20μg；rnase抑制剂(40u/μl)0.24μl；dnaseⅰ(rnase-free5u/μl)0.8μl；10×dnaseⅰbuffer2μl，用nuclease-freeh2o补足至20μl。
(2)将配制好的体系在室温条件下反应30min后，用80μl的rnase-freeh2o补足至100μl，加入相同体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)，上下轻微颠倒混匀至没有分层。
(3)将混合液迅速置于4℃冷冻离心机中，13000rpm离心10min，轻轻取出离心管将上层溶液转移到一个新的1.5ml离心管中，根据吸取上清的体积加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，上下轻微颠倒混匀至没有分层。
(4)再次冷冻离心10min，取上层(水层)到新的离心管中，加入上清体积1/5的3m三水乙酸钠，以及上清5倍体积的冰冻无水乙醇，在-20℃冰箱中冷冻析出90min。
(5)12000rpm冷冻离心10min后弃上清，再次用1ml70％的酒精清洗沉淀，重复冷冻离心。在超净台下冷风干燥后，用适量的nuclease-freeh2o溶解，-75℃保存备用。
1.1.6总rna的纯度及浓度检测
配制1.5％的琼脂糖凝胶(电泳所用器具用depc水浸泡消毒处理)，取1μl的rna，加入3μl的10×loadingbuffer和2μlrnase-freeh2o混合点样，在150v、300ma、80w条件下电泳检测rna的质量。吸取1μl的rna用k5500超显微分光光度计测定rna的浓度。
1.1.7cdna的合成
使用上海东洋纺生物科技公司的revertra
(1)rna的变性：从-75℃冰箱中取出纯化的rna立即置于冰上融化，取1μg于微量离心管中，65℃下热变性5min后，立即置于冰上冷却。
(2)去除基因组dna，在冰上配制如下反应液：在变性的rna中加入4×dnmastermix4μl用nuclease-freeh2o补足至16μl。将反应液轻轻混匀离心后，37℃温浴5min去除gdna。
(3)反转录反应，在冰上配制：步骤(2)的反应液16μl中加入5×rtmastermix4μl移液器吹打混匀瞬时离心后，在pcr仪上37℃保温15min，50℃加热5min完成反转录反应，98℃高温酶失活5min，最后于4℃保存。
(4)反应结束后，取2μl的cdna加入3μl的10×loadingbuffer电泳检测。
1.1.8荧光定量pcr
利用premier5.0对ghgst基因保守区段进行实时定量(real-time)pcr引物设计，以ghubq14基因作为内参(表1)。所用染料为东洋纺公司
表1实时荧光定量pcr引物
1.2.烟草过表达实验：黄萎病菌胁迫下，转gh_a09g1509基因烟草植株抗病表型较对照抗性明显增强；通过病菌分离试验，分离植株体内黄萎病菌，超表达植株体内病菌侵入量明显少于野生型(图3)；转gh_a09g1509基因烟草体内氧化抗氧化系统中与活性氧微平衡有关的h2o2含量、cat和pod活性高于野生型(图4)，说明gh_a09g1509在烟草体内的表达增强了植株在抵抗黄萎病时体内ros物质的微平衡，从而提高植株的抗病性。
过表达所用载体为pbi121，将gh_a09g1509基因插入质粒pbi121的酶切位点bamhi和saci之间，得到重组质粒，转化农杆菌，培养至烟草无菌苗长出真叶时准备作叶盘法转化。
1.3.vigs(病毒诱导的基因沉默)实验
构建了ghgst沉默载体ghgst-ptrv2。构建方法如下：
(1)ghgst的vigs引物设计
利用premier5.0在ghgst基因中寻找pyl156载体应用的多克隆酶切位点，设计特异性引物见表2。
表2ghgst基因vigs引物
以上引物是以gh_a09g1509基因为靶标设计的。
(2)目的片段的获得及酶切
在ghgst超表达载体质粒上经pcr扩增得到目的片段，经过琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收后获得目的片段，连接t载体pmd19-t构建完成中间载体，测序正确后将pyl156空载体、ghgst-pmd19中间载体进行双酶切，上游酶切位点为bamhⅰ，下游为sacⅰ。37℃培养箱中酶切20min。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳回收，测定浓度。
(3)目的片段与pyl156的连接与转化
将回收的目的基因片段连接到pyl156载体上。将连接产物转化到大肠杆菌dh5α，通过pcr检测阳性克隆，将测序正确的表达载体ghgst-ptrv2加1/2体积的50％甘油，-20℃保存。
采用叶片注射法沉默抗病品种农大601中gh_a09g1509基因。黄萎病菌胁迫下ghgst-ptrv2转基因植株黄萎病抗性较空载体对照显著下降；黄萎病菌胁迫下的植株根系分析发现，空载体对照植株根系明显比ghgst-ptrv2转基因植株根系要发达；病菌分离试验发现，ghgst-ptrv2转基因植株分离出大量的大丽轮枝菌菌丝，而对照组只有很少的大丽轮枝菌菌丝被分离出，同时ghgst-ptrv2转基因植株茎部维管束褐化程度也明显较对照植株严重(图5)；体内h2o2含量及cat和pod活性显著低于对照(图6)，说明gh_a09g1509基因的表达对调节ros平衡关键物质h2o2含量、cat和pod表达量的提高具有促进作用，进而增强了棉株的黄萎病抗性。
real-timepcr分析显示，vigs(ghgst-ptrv2转基因植株)幼苗中gh_a09g1508，gh_a09g1509，gh_a09g1510的沉默效率分别为86％，97％和60％。综上所述，陆地棉a亚组9号染色体tau类基因簇(ghat09g1508、ghat09g1509和ghat09g1510)在棉花黄萎病抗性反应中发挥了重要功能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>河北农业大学
<120>陆地棉gst基因簇及其在提高植物黄萎病抗性中的应用
<130>khp181110931.5
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>654
<212>dna
<213>陆地棉(gossypiumhirsutum)
<400>1
atgggcgaagaagtgcaggtttttggattctgggcaagcccttacagccacagggtagag60
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aagagtgatttactcttgaaatataatcccattcataaaaaagtcccagtttttctccac180
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