一种包含B细胞及肿瘤双识别性T细胞的免疫细胞药物的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体而言本发明提供一种免疫细胞治疗药物，这种细胞药物解决了肿瘤识别性t细胞的数量瓶颈难题。

背景技术：

t细胞是肿瘤免疫治疗的主力军，肿瘤免疫治疗的疗效在很大程度上取决于能识别肿瘤的t细胞的数量的多少。目前已经有多种技术手段来收集肿瘤识别性t细胞，包括从肿瘤组织中分离肿瘤浸润t淋巴细胞(til)，或者通过高通量测序获得肿瘤新抗原(neoantigen)从而在筛选出来neoantigen反应性t细胞，等等。

一般情况下，晚期肿瘤患者体内的天然存在的能特异识别肿瘤的、且可采集到的t细胞——无论是来自til或是neoantigen反应性t细胞，其总数量与肿瘤细胞总量相比，都是很少的，有可能相差4个数量级(万倍)以上。

另一方面，无论是neoantigen反应性t细胞，还是til，在体外都不可能无限扩增，而且反复刺激扩增容易使t细胞状态过早进入耗竭状态，从而严重影响其治疗效果，这一点对于til尤甚。

因此无论是til或新抗原疗法，都面临肿瘤识别性t细胞数量局限问题，这对于这类肿瘤免疫疗法是非常严重的瓶颈问题和困扰。

另一方面，来自对治b细胞血液肿瘤的大量cd19car-t的临床研究数据表明，靶向cd19、cd20、cd22等b细胞普遍表达的抗原的car-t细胞，可以在体内大量扩增。由此可见，借助患者体内广泛的海量的b细胞的类似疫苗的环境，靶向b细胞的car的t细胞的可在体内大量扩增。

技术实现要素：

上述car-t的临床研究的目的是为治疗b细胞血液肿瘤，本发明的实质是将b细胞对car-t的大幅扩增的效应，作为肿瘤识别性t细胞的辅助扩增体系，应用于实体瘤的治疗中。

本发明通过将靶向b细胞的car表达在肿瘤识别性t细胞上，制备“b细胞&肿瘤——双识别性t细胞”，解决了这一瓶颈问题。

首先双识别性t细胞的前提是这类t细胞是有肿瘤特异识别性的，这是本发明的基础条件，即先要收集患者的肿瘤识别性t细胞，再做靶向b细胞的car的基因改造。

基因改造可以通过慢病毒等体系来实现。转入car的肿瘤识别性t细胞即为“b细胞&肿瘤——双识别性t细胞”。

这类t细胞之所以被称为双识别性，是因为这类t细胞既可通过识别肿瘤新抗原而启动对肿瘤的杀伤，又可以通过识别b细胞而启动对正常b细胞的杀伤。在杀伤b细胞的同时，这类肿瘤识别性t细胞即在体内大量扩增，从而得以更有效的杀伤肿瘤细胞。

本发明应用于临床唯一的风险是这类双识别性t细胞药物有可能杀伤正常b细胞，导致患者体液免疫功能缺陷，但这一风险是有限的：首先当体内不再需要双识别性t细胞的时候，可以通过利用car结构中的表达调控或自杀开关元件的设计，清除双识别性t细胞，从而终止其对b细胞的杀伤；患者可以通过外源性补充免疫球蛋白而弥补这一缺陷，而且大多患者可在2～12个月内恢复b细胞的再生；另一方面，与威胁生命的肿瘤疾病相比，两害相权取其轻，b细胞被清除的风险可以被暂时忽略，正如car-t技术在b细胞血液肿瘤治疗中被广泛应用的情形。

附图表说明：

图1.bcar在tcr-t，til及neot中的表达。

图2.bcar在靶向nyes01基因的tcr-t的体外功能试验及扩增。

图3.bcar在til的体外功能试验及扩增。

图4.bcar在neot的体外功能试验及扩增。

图5.bcar-nyes01-tcrt细胞在动物实验中的肿瘤负荷变化。

图6.bcar-til细胞在动物实验中的肿瘤负荷变化。

图7.bcar-neot细胞在动物实验中的肿瘤负荷变化。

具体实施方式

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例一、肿瘤识别性t细胞——靶向肿瘤靶点ny-eso-1的tcr-t细胞的制备

本实施例用靶向肿瘤靶点ny-eso-1的tcr-t细胞模拟单靶点的新抗原反应性t细胞。

静脉采集健康人30ml外周血，，采用ficoll淋巴细胞分离液分离pbmc，贴壁2小时，取悬浮细胞-主要是t细胞。加入识别ny-eso-1的tcr慢病毒载体(hla-a：0201)，按照moi(慢病毒数目/细胞数)＝5加入慢病毒，培养72h，流式分选出tcr表达阳性的tcr-t细胞，流式检测tcr阳性率在95％以上。

实施例二、肿瘤识别性t细胞——肿瘤浸润t淋巴细胞(til)的制备

取患者肿瘤组织10克或以上，用酶消化法分离出肿瘤组织的细胞，并用cd3磁珠分离纯化出cd3阳性的t细胞，其余细胞贴壁培养获得患者自体的肿瘤细胞。

实施例三、肿瘤识别性t细胞——neoantigen反应性t细胞(neot)的制备

首先，抽取患者外周血或手术切除的肿瘤组织进行全外显子或rna转录组测序；选取突变位点，并结合患者hla分型进行亲和肽预测，选取约20个突变作为neoantigen。基因合成该neoantigen，并体外转录成rna；再次，单采或是直接抽取患者外周血，分离出pbmc并贴壁2小时，取贴壁单核细胞，加入相关细胞因子促进dc细胞分化成熟，并电转rna进入细胞；取悬浮细胞，主要为t细胞，与电转的dc细胞共培养，分离cd137+阳性的t细胞得到新抗原反应性t细胞(以下或简称neot)，并扩增该细胞。

实施例四、靶向b细胞的car(以下或简称bcar)的慢病毒载体的制备

选取cd19作为bcar的靶标，构建cd19car，代表bcar。

cd19car慢病毒载体，采用更安全的第四代慢病毒载体系统。将主载体cd19car，及包装载体pmdl-gag，rev，包膜载体pmd2.g，采用磷酸钙或是脂质体pei共转染293t细胞，48小时收集上清，并进行超速离心浓缩慢病毒。

cd19car慢病毒载体的滴度检测，采用3倍倍比稀释，取50ul感染293t细胞，感染48小时至72小时，收集293t细胞进行car染色，流式分析car+细胞的比例，并按照公式进行滴度计算：

滴度(tu/ml)＝起始293t细胞数×car⁺细胞百分比×稀释倍数×20(取第一个pd1⁺细胞百分比＜20％进行计算)，计算慢病毒滴度＞3×10⁷可进行下一步使用。

实施例五、bcar在前述肿瘤识别性t细胞的转染

根据制备的cd19car慢病毒滴度，按照moi＝5，将慢病毒加入前述三种新抗原识别性t细胞(即ny-eso-1-tcr-t，til，neot)中，分别得到bcar-ny-eso-1-tcr-t，bcar-til，bcar-neot，流式检测的结果显示，bcar在三种肿瘤抗原识别性t细胞都有约60％的表达(图1)，分别培养并扩增三种t细胞。

实施例六、表达bcar的ny-eso1tcr-t细胞的体外功能试验

为了验证bcar在靶向ny-eso-1的tcr-t中的作用，我们首先构建了hla分型为a：0201的j82-nyeso1-luc的肿瘤细胞系。为了验证bcar-nyeso1-tcrt的双识别性功能，我们首先在24孔板接种1×10⁵数量的j82-nyeso1肿瘤细胞，过夜贴壁后，分成4组进行实验，对照组a组加入2×10⁵数量的t细胞共培养；b组加入2×10⁵数量的bcar-t(car的阳性率为60％)共培养；c组加入2×10⁵数量的ny-eso1tcr-t共培养；d组加入2×10⁵数量的bcar-ny-eso1tcr-t共培养；同时，这四组细胞都加入5×10⁴的b细胞，分别检测：

1、t细胞的扩增情况。共培养48h，96h，分别对t细胞进行计数，如图2a所示，经过4天的共培养，a组t细胞扩增3倍左右；b组bcar-t扩增约12倍；c组nyeso1-tcrt扩增约10倍；而d组bcar-nyeso1-tcrt扩增最多，达到27倍。体外实验的结果表明，在b细胞的刺激环境下，tcr-t在转染cd19car后，数量可以得到大幅扩增。

2、肿瘤细胞的生长情况。共培养48h和96h后，去掉上清液，pbs漂洗3次，裂解贴壁的肿瘤细胞，采用试剂盒测定荧光素酶的活性来指示肿瘤细胞的存活率。图2b共培养48h的体外实验结果提示，在b细胞的刺激环境下，tcr-t在转染bcar后，杀伤肿瘤的能力明显提高。

实施例七、表达bcar的的til的体外功能试验

为了验证cd19car在til中的作用，我们首先将从患者新鲜肿瘤组织分离的肿瘤细胞接种到24孔板，过夜贴壁后，分别加入til和bcar-til共培养，同时所有的分孔中都加入相同数量的b细胞并进行检测：

1、t细胞的数量对比。与肿瘤细胞共培养96h，如图3a所示，til扩增了约10倍，而bcar-til扩增约25倍。体外实验的结果表明，在b细胞的刺激环境下，til在转染cd19car后，数量可以得到大幅扩增。

2、肿瘤细胞的生长情况。共培养96h后，去掉上清液，pbs漂洗3次，裂解贴壁的肿瘤细胞，采用试剂盒测定荧光素酶的活性来指示肿瘤细胞的存活率。图3b的体外实验结果表明，在b细胞的刺激环境下，til在转染bcar后，杀伤肿瘤的能力明显提高。

实施例八、表达bcar的的新抗原反应性t细胞的体外功能实验

为了验证cd19car在neot中的作用，我们首先将从患者新鲜肿瘤组织分离的肿瘤细胞接种到24孔板，过夜贴壁后，分别加入neot和bcar-neot共培养，同时所有的分孔中都加入相同数量的b细胞并进行检测：

1、t细胞的数量对比。与肿瘤细胞共培养96h，如图4a所示，_neot扩增了约9倍，而bcar-neot扩增约23倍。体外实验的结果表明，在b细胞的刺激环境下，neot在转染cd19car后，数量可以得到大幅扩增。

2、肿瘤细胞的生长情况。共培养96h后，去掉上清液，pbs漂洗3次，裂解贴壁的肿瘤细胞，采用试剂盒测定荧光素酶的活性来指示肿瘤细胞的存活率。图4b的体外实验结果表明，在b细胞的刺激环境下，neot在转染bcar后，杀伤肿瘤的能力明显提高。

实施例九、表达bcar的ny-eso-1tcr-t细胞的动物实验

动物模型构建：将1×10⁶数量的肿瘤细胞j82-ny-eso-1皮下接种到nsg小鼠体内，空白对照组皮下注射pbs(a0)，注射肿瘤细胞的小鼠，大约两周后开始成瘤，第23天测量肿瘤大小，并选取30只老鼠入组。

给药：空白对照组(a0)尾静脉注射pbs，接种肿瘤细胞的小鼠分成6组，分别为：pbs组(a1)；t细胞组(a2)；bcar-t细胞组(a3)；ny-eso-1tcr-t细胞组(a4)；bcar&ny-eso-1tcrt双识别性t细胞组(a5)；ny-eso-1tcr-t细胞高剂量组(a6)。给药方式：a1-5组均为1×10⁴个t细胞尾静脉静脉输注，a6组为1×10⁷个t细胞尾静脉输注，所有组均输注1×10⁷个b细胞。

给药后，每2-3天进行肿瘤大小的测量及小鼠状态观察，肿瘤体积＝1/2*长径*短径*短径，持续观察28天。

一、肿瘤负荷变化：

荷瘤小鼠在给药后的一周，肿瘤体积持续增长，第7天，检测到a4、a5和a6组肿瘤开始缩小，但a4组肿瘤缩小幅度不明显，并在第11天开始反弹并继续生长，a6组有明显缩小，但在第16天开始反弹；而a5组持续缩小至几近消失，第23天肿瘤才开始反弹。其他三组肿瘤均保持自然生长(图5)。

二、输注的t细胞在体内的总量变化：

在给药的四个组，给药之后第10天，从2、3、4、5组抽取外周血，使用流式方法检测cd3进行估计t细胞的总量，其结果分别为2.11×10⁵，1.91×10⁷，1.52×10⁶，5×10⁷，提示带bcar的a3、a5组所获得的t细胞总量远远超过a4组，表明bcar-t细胞以及b细胞&肿瘤——双识别性t细胞可以在体内大幅扩增。

实施例十、表达bcar的til细胞的动物实验

动物模型构建：将分离自新鲜肿瘤组织的1×10⁶数量的肿瘤细胞皮下接种到nsg小鼠体内，空白对照组皮下注射pbs(a0)，注射肿瘤细胞的小鼠，大约两周后开始成瘤，第25天测量肿瘤大小，并选取30只老鼠入组。

给药：空白对照组(a0)尾静脉注射pbs，接种肿瘤细胞的小鼠分成5组，分别为：不给药-pbs组(a1)；t细胞组(a2)；bcar-t细胞组(a3)；til细胞组(a4)；bcar-til细胞组(a5)。给药方式：a1～5组均为1×10⁴个t细胞尾静脉输注，所有组均输注1×10⁷个b细胞。给药后，每2-3天进行肿瘤大小的测量及小鼠状态观察，肿瘤体积＝1/2*长径*短径*短径，持续观察28天。

一、肿瘤负荷变化：

荷瘤小鼠在给药后的一周，肿瘤体积持续增长，第6天，检测到a4、a5组肿瘤开始缩小，但a4组肿瘤缩小幅度不明显，并在第14天开始反弹并继续生长，a5组持续缩小至几近消失，第21天肿瘤才开始反弹。其他三组肿瘤均保持自然生长(图6)。

二、输注的t细胞在体内的总量变化：

在给药的四个组，给药之后第10天，从2、3、4、5组抽取外周血，使用流式方法检测cd3进行估计t细胞的总量。其结果分别为1.87×10⁵，1.57×10⁷，9.52×10⁶，3×10⁷，提示带bcar的a3、a5组所获得的t细胞总量远远超过a4组，表明bcar-t细胞以及b细胞&肿瘤——双识别性t细胞可以在体内大幅扩增。

实施例十、表达bcar的新抗原反应性t细胞的动物实验

动物模型构建：将分离自新鲜肿瘤组织的1×10⁶肿瘤细胞皮下接种到nsg小鼠体内，空白对照组皮下注射pbs(a0)，注射肿瘤细胞的小鼠，大约两周后开始成瘤，第23天测量肿瘤大小，并选取30只老鼠入组。

给药：空白对照组(a0)尾静脉注射pbs，接种肿瘤细胞的小鼠分成6组，分别为：不给药-pbs组(a1)；t细胞组(a2)；bcar-t细胞组(a3)；普通neot细胞组(a4)；bcar-neot双识别性t细胞组(a5)；普通neot细胞高剂量组(a6)。给药方式：a1～5组均为1×10⁴个t细胞尾静脉静脉输注，a6组为1×10⁷个t细胞尾静脉输注，所有组均输注1×10⁷个b细胞。

给药后，每2-3天进行肿瘤大小的测量及小鼠状态观察，肿瘤体积＝1/2*长径*短径*短径，持续观察28天。

一、肿瘤负荷变化：

荷瘤小鼠在给药后的一周，肿瘤体积持续增长，第9天，检测到a4、a5和a6组肿瘤开始缩小，但a4组第11天反弹，a6组在第18天开始反弹；而a5组持续缩小至几近消失，第23天肿瘤才开始反弹。其他三组肿瘤均保持自然生长(图7)。

二、输注的t细胞在体内的总量变化：

在给药的四个组，给药之后第10天，从2、3、4、5组抽取外周血，使用流式方法检测cd3进行估计t细胞的总量。其结果分别为1.65×10⁵，1.23×10⁷，1，02×10⁷，3.15×10⁷，提示带bcar的a3、a5组所获得的t细胞总量远远超过a4组，表明bcar-t细胞以及b细胞&肿瘤——双识别性t细胞可以在体内大幅扩增。

上述b细胞&肿瘤——双识别性t细胞的动物实验表明：

1.b细胞&肿瘤——双识别性t细胞可以借助b细胞刺激实现大幅扩增。

a6组双识别性t细胞可以在体内大幅扩增，达到和car-t细胞相同数量级的数量。

2.同样是小剂量回输，b细胞&肿瘤——双识别性t细胞可以取得更好的疗效。

a5组双识别性t细胞在体内大幅扩增后，可以起到明显增强肿瘤特异杀伤的效果，效果远超小剂量回输的肿瘤识别性t细胞组，堪比大剂量肿瘤识别性t细胞组甚至可能更强。

数据表明，b细胞&肿瘤——双识别性t细胞可在小鼠体内扩增迅速并实现明显肿瘤抑制效果，无论是扩增效果还是疗效上，都远超给予同样小剂量给予肿瘤识别性t细胞组。