本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种多功能解钾菌及其在土壤解钾溶磷和固氮中的作用以及一种用于土壤的解钾、溶磷和固氮的菌剂。
背景技术：
氮、磷、钾是作物生长必需的三种重要营养元素。氮是作物体内蛋白质、核酸和叶绿素的组成成分，磷对提高作物产量和改善作物品质具有重要作用，钾可以提高作物适应外界不良环境的能力。然而，我国大部分耕地的土壤全氮含量都在0.2％以下(即为缺氮土壤)，缺磷土壤面积更是多达10.09亿亩，土壤中可直接利用钾的含量只占全钾的2％～10％，其余90％以上的钾存在于长石和云母等硅酸盐矿物中，这些矿物化学性质稳定，很难被作物吸收利用。
为满足作物对营养元素的需求，我国绝大部分的耕地都要大量补充富含氮、磷、钾的各种化肥。大量施用化肥可以造成环境污染、土壤板结、地力衰退、农产品品质降低、土壤微生物数量减少、生态恶化、耕地土壤生态系统失衡等环境问题。因此，改善和提高我国耕作田土壤中营养元素特别是钾、磷和氮的利用率是一项战略性课题。从已有的文献报道来看，伯克霍尔德氏菌种、溶磷菌种和固氮菌种的种类繁多复杂，参差不齐，而且同时具备解钾、溶磷和固氮功能的菌种很少，在土壤中存活率不高，应用于实际生产的菌株种类少，缺乏创新。从这个角度看，筛选具有多种功能且有高效解钾能力及较好的溶磷和固氮作用的野生菌株的工作仍然具有重大意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种多功能解钾菌，和利用该多功能解钾菌在土壤解钾溶磷和固氮的应用技术。该技术不但能有效地对土壤进行解钾溶磷和固氮，而且成本低、操作简单、无污染、对环境不构成危害。
本发明的目的之一在于提供一种多功能解钾菌，该多功能解钾菌的分类学命名为伯克霍尔德氏菌(burkholderiatripica)h1，中国典型培养物保藏中心(cctcc)no.m2017281。本发明人从玉米根际土壤中筛选到一株细菌，证明该株细菌具有土壤解钾、溶磷和固氮的作用，该细菌经形态鉴定、生化鉴定及测序分析为伯克霍尔德氏菌(burkholderiatripica)h1，其中菌落形态结果如附图1，生化鉴定结果见实施例2。
本发明的目的之二在于提供所述多功能解钾菌在土壤解钾、溶磷和固氮中的应用。将所述多功能解钾菌按如下方法制备成菌剂用于土壤的解钾、溶磷和固氮：
将斜面保存的所述多功能解钾菌活化，接种于活化培养基上，放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养3～5d；挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30℃下180r/min振荡培养10d，得发酵液用于土壤的解钾，或者将发酵液进行干燥处理得到干燥物用于土壤的解钾、溶磷和固氮。
其中，所述活化培养基为亚历山鲍罗夫固体培养基，所述发酵培养基为亚历山鲍罗夫液体培养基，所述亚历山鲍罗夫液体培养基组分，按重量份数计：蔗糖5g、磷酸氢钠2g、七水合硫酸镁0.5g、氯化铁0.005g、碳酸钙0.1g、钾长石粉1.5g(去离子水清洗5次后50℃烘干样)、蒸馏水1000ml；调节培养基ph7.0～7.5，121℃灭菌30min后备用；所述亚历山鲍罗夫固体培养基为在所述亚历山鲍罗夫液体培养基组分的基础上加琼脂20g。
本发明的目的之三在于提供一种用于土壤的解钾、溶磷和固氮的菌剂，将所述多功能解钾菌进行发酵获得发酵液，经喷雾干燥获得的干粉菌剂。
本发明的有益效果是：所筛选得到的多功能解钾菌具有较高的解钾能力，同时也具有很好的解磷能力和固氮能力，可以增加土壤中有效钾、有效磷、可利用氮的含量，提高土壤中难溶性钾和磷的利用效率；将所述多功能解钾菌进行发酵获得的发酵液或该发酵液经喷雾干燥获得的干粉菌剂施用后可减少各种肥料的使用量，提高农作物产量，并减少水土流失，具有广阔的应用前景，操作简单、无污染、对环境不构成危害。
其中，本发明的菌株的保藏日期为2017年5月24日，保藏编号为cctccno.m2017281。其分类命名为伯克霍尔德氏菌(burkholderiatripica)h1，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，邮编：430072。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的多功能解钾菌在鉴定时平板划线中菌落形态图；
图2为本发明实施例3提供的多功能解钾菌的解钾效果图；
图3为本发明实施例4提供的多功能解钾菌的溶磷效果图；
图4为本发明实施例5提供的多功能解钾菌的固氮效果图；
图5为本发明应用实施例提供的多功能解钾菌在盆栽试验中对甜菜促生效果图。
具体实施方式
实施例1：多功能解钾菌的筛选
本发明所述的多功能解钾菌的筛选方法有如下步骤：
步骤1、取10g华中农业大学玉米地玉米根际土壤，放入带有玻璃珠的三角瓶中，加入90ml无菌水，在28～30℃恒温振荡30～45min，使样品均匀分散于无菌水中，得到稀释倍数为10-1的菌悬液，将菌悬液静置后取上清液，依次稀释得到10-3、10-5、10-7倍浓度梯度的样品菌悬液，10-3、10-5、10-7倍浓度梯度的菌悬液各取0.1ml，依次均匀的涂布在亚历山鲍罗夫固体培养基上，放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养3～5d；
步骤2、从所述步骤1恒温培养后的亚历山鲍罗夫固体培养基上挑选出长势较好的菌落进行分离纯化，然后接种到含有100ml亚历山鲍罗夫液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃下180r/min振荡培养30d，重复3瓶。
步骤3、在所述步骤2接种后的1、3、5、7、9、11、13、15、20、30d取发酵液5ml，加入1ml6％h2o2，在沸水浴中消化1h，将消化液5000r/min离心10min，取上清液在火焰光度计上测定k+浓度。筛选出解钾量最高的菌株，最高解钾量是31.86mg/l，解钾率为16.04％，即得到一株编号为h1的菌株。
所述亚历山鲍罗夫液体培养基组分，按重量份数计：蔗糖5g、磷酸氢钠2g、七水合硫酸镁0.5g、氯化铁0.005g、碳酸钙0.1g、钾长石粉1.5g(去离子水清洗5次后50℃烘干样)、蒸馏水1000ml；调节培养基ph7.0～7.5，121℃灭菌30min后备用；所述亚历山鲍罗夫固体培养基为在所述亚历山鲍罗夫液体培养基组分的基础上加琼脂20g。
通过上述分离路线从土壤中得到一株编号为h1的菌株，证明该株细菌具有解钾的作用。
实施例2：多功能解钾菌的鉴定
对上述获得的一株编号为h1的菌株经形态鉴定、生化鉴定及16srrna测序分析为伯克霍尔德氏菌(burkholderiatripica)h1；
1、其中菌落形态结果如附图1，该菌的生长生理形态为菌落表面光滑，淡黄色，表面有透明夹膜，边缘整齐，圆形凸形；
2、生化鉴定结果为革兰氏阴性菌，有运动性及好氧性的棒状细菌；
3、利用引物27f和1492r对菌株h1进行扩增和正向测序，得到序列长度为1403bp，具体序列如下：
<tgcagtcgaacggcagcacgggtgcttgcacctggtggcgagtggcgaacgggtgagtaatacatcggaacgtgtcctgtagtgggggatagcccggcgaaagccggattaataccgcatacgatctacggatgaaagcgggggatcttcggacctcgcgctataggggcggccgatggcggattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgacgatccgtagctggtctgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggcgaaagcctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcacttttgtccggaaagaaatccctggtcctaatatggccgggggatgacggtaccggaagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggtgatgtaagaccgatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattggtgactgcatcgcttgagtatggcagaggggggtagaattccacgtgtagcagtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgatggcgaaggcagccccctgggtcaatactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactggttgtcgggtcttcattgacttggtaacgtagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacgcgaaaaaccttacctacccttgacatgtacggaattccgctgagaggtggaagtgcccgaaagggagccgtaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccctagttgctacgcaagagcactccagggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcggaacagagggttgccaagccgcgaggtggagccaatcccagaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttgccagaagtggctagtctaaccgcaaggaggacgtcaccac>
通过blast将序列与genbank数据库中序列进行对比，其与burkholderiatripica相似性达到99％。
实施3：多功能解钾菌的解钾能力测定
配制解钾培养基(无水溶性钾离子)按95ml分装并加入0.5g准确称取的钾矿粉于250ml三角瓶，121℃灭菌30min，将实施1所得的伯克霍尔德氏菌h1悬液以5％的接种量接入摇瓶菌种，做三个平行，同时设无接种对照。37℃水浴摇床培养30d之后结束培养，取发酵液5ml，加入1ml6％h2o2，在沸水浴中消化1h，将消化液5000r/min离心10min，取上清液在火焰光度计上测定k+浓度。伯克霍尔德氏菌h1的解钾效果如图2所示，由图2可知伯克霍尔德氏菌h1最高解钾量是31.86mg/l，解钾率为16.04％，具有较强的解钾能力。
实施例4：多功能解钾菌的溶磷能力测定
(1)无机磷培养基的配制：按重量份数计，培养基由下述成分：葡萄糖10g、(nh4)2so40.5g、mgso4·h2o0.3g、nacl0.3g、kcl0.3g、feso4·7h2o0.03g、mnso4·h2o0.03g、摩洛哥天然磷矿粉5g(去离子水清洗5次后50℃烘干样)、琼脂20g、蒸馏水1000g；将摩洛哥天然磷矿粉与其余成分开灭菌后混合，调节ph为7.0～7.5；
(2)解磷能力测定：接种5ml已活化的伯克霍尔德氏菌h1菌悬液到含有100ml无机磷液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃下180r/min振荡培养10d，重复3瓶。在接种后1、3、5、7d取发酵液5ml，5000r/min离心10min，采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷的含量。结果如图3所示，所述伯克霍尔德氏菌h1的最高溶磷量为199.92mg/l，解磷率为23.65％。
实施例5：多功能解钾菌的固氮能力测定
(1)无氮培养基的配制：按重量份数计，培养基由下述成分：葡萄糖10g、磷酸氢钾0.2g、七水合硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、碳酸钙5g、硫酸钙0.1g、蒸馏水1000ml；调节培养基ph为7.0～7.5，121℃灭菌30min后备用；
(2)固氮能力测定：取5ml活化后的伯克霍尔德氏菌h1菌悬液到含有100ml无氮液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃下180r/min振荡培养30d，重复15瓶。在接种后3、5、10、15、30d取整瓶发酵液加入浓硫酸和30％h2o2在电炉上进行高温消解测定含氮量。结果如图4所示，由图4可知伯克霍尔德氏菌h1固氮效果比较好，30d的固氮量为14.92mg/l。
由上可知。本发明筛选到的伯克霍尔德氏菌h1经鉴定后，不仅具有较高的解钾能力，同时也具有很好的解磷能力和固氮能力，所以我们将该伯克霍尔德氏菌h1称为多功能解钾菌。
实施例6：制备实施例
将斜面保存的所述多功能解钾菌活化，接种于活化培养基上，放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养3～5d；挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30℃下180r/min振荡培养10d，发酵获得发酵液，经喷雾干燥获得干粉菌剂。
其中，所述活化培养基为亚历山鲍罗夫固体培养基，所述发酵培养基为亚历山鲍罗夫液体培养基，所述亚历山鲍罗夫液体培养基组分，按重量份数计：蔗糖5g、磷酸氢钠2g、七水合硫酸镁0.5g、氯化铁0.005g、碳酸钙0.1g、钾长石粉1.5g(去离子水清洗5次后100℃烘干样)、蒸馏水1000ml；调节培养基ph7.0～7.5，121℃灭菌30min后备用；所述亚历山鲍罗夫固体培养基为在所述亚历山鲍罗夫液体培养基组分的基础上加琼脂20g。
应用实施例：多功能解钾菌在盆栽试验中对甜菜促生效果验证
取实施例6中的多功能解钾菌发酵液或制得的干粉菌剂在盆栽试验中验证其对甜菜的促生效果，试验分为多功能解钾菌组(盆栽中接种h1菌液100ml)和ck组(空白对照组，不接种任何菌种)。每组重复4个盆栽，每盆播种3粒经萌发处理后甜菜种子，且每盆按0.22g/kg土的尿素和0.42g/kg土的过磷酸钙的施用量施加氮肥及磷肥。随后将盆栽置于室外盆栽场遮雨棚下培养，待出苗后分期进行间苗，最后定苗，每盆保留2株，定期给每盆盆栽浇等量去离子水，连续培养147天。
甜菜生长状况如图5所示，由图5可知，添加多功能解钾菌后甜菜高度和根部均明显大于空白组。多功能解钾菌对甜菜主要生长指标，如植株鲜种、根鲜种、含氮量、含磷量、含钾量、产糖量的影响如表1所示。由表可知，接种多功能解钾菌后甜菜鲜种增加59.24％，株高增加18.47％，块根重增加81.90％，干重提高51.86％，总氮含量增加32.45％，总钾含量增加57.60％，总磷含量增加38.59％，产糖量增加34.64％。
表1多功能解钾菌对甜菜生长指标的影响
注明：表1中数据表示为3个重复实验的平均值±标准差，数据后的字母不同表示数据间差异性显著。
该应用实施例表明多功能解钾菌的发酵液或制得的干粉菌剂施用后，土壤中的磷和钾转化成可溶性养分，增加土壤中速效养分的含量，减少化肥的使用量，促进作物生长发育，提高产量。在培育和发挥土壤生态肥力、保持农业生态平衡方面具有重要意义和应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。