本发明涉及微生物培养技术领域，具体是指一种用于培养布氏白僵菌的培养基及其培养方法。
背景技术：
布氏白僵菌又名卵胞白僵菌，是一种重要的昆虫病原真菌，能够寄生7目70多种昆虫。多年来，我国用布氏白僵菌防治农林重要昆虫如马尾松松毛虫、象甲、天牛等，已获得较好的技术效果。有研究表明，在田间每平方米土壤以1010孢子处理，能造成次年害虫流行病，而且真菌在虫尸和土壤中的宿存保证了对下一代害虫的侵染，从而维持其在田间的特效性，因而布氏白僵杀虫剂是目前防治地下害虫、发展无公害生产的首选生物药剂，在防治林业害虫方面，布氏白僵菌粉剂，已被大面积推广使用。真菌的大量培养生产是满足田间应用的前提，但迄今仍无成熟的白僵菌杀虫剂产品，也缺乏高技术的工业化生产。
基于此，研究并设计了一种利于提高布氏白僵菌产孢量及毒力的培养基及培养方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于：提供一种利于提高布氏白僵菌产孢量及毒力的培养基及培养方法，该培养基为布氏白僵菌菌株的生长和分生孢子的生产提供了良好的营养和空间环境。
本发明通过下述技术方案实现：一株布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)hfbbr001，2017年9月8日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号cgmccno.14157。
一种用于培养布氏白僵菌的培养基，其特征在于，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦麸，质量比为：1～5∶0.5～1.5∶2～6∶1～3。
进一步地，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦麸，质量比为：3∶1.5∶4∶3。
更进一步地，所述培养基的组分及组分含量如下：米粉+土元蜕+花生壳+麦麸，质量比为：3∶1∶4∶2。
本发明还提供了一种用于培养布氏白僵菌的培养基的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：1)布氏白僵菌固相发酵培养基种子液的制备
采用sdy+2％麦芽糖培养基制备布氏白僵菌固相发酵培养基种子液；方法为在超净工作台上用无菌接菌针将活化后的布氏白僵菌孢子均匀接种于500ml锥形瓶中含sdy+2％麦芽糖培养基液体培养基中，置于恒温摇床内，条件为温度25±1℃，170rpm培养96h，待培养基变为粘稠状和锥形瓶瓶壁出现白色黏状物，即为获得布氏白僵菌固相发酵培养基种子液。
2)固相发酵培养
用电子天平称取每处理固体培养基基本组分中花生壳、虫蜕、米粉、麦麸和麦芽糖质量，先将米粉溶于水制成均匀米粉溶液，然后将虫蜕和麦麸先后溶于米粉水溶液，再将其与用水浸泡后的花生壳混合，使其制成的溶液恰好在花生壳表面均匀分布，并置于直径等于40cm铁盆中，同时用纱布封口，然后放在灭菌锅中121℃高压灭菌20min。
3)接种与培养
将种子培养液分别均匀接种于各处理固相培养基中，接种量为固相培养基质量的10％菌悬液；培养基置于灭过菌的有网眼的不锈钢托盘中并置于恒温恒湿光照智能霉菌培养箱中固相发酵，培养基初始含水率为80±5％，25±1℃、95％rh条件下培养10d，前3d无光黑暗处理，从第4d开始在光照强度3000lx和光周期10:14h光照:黑暗条件下培养至第10d。
进一步地，所述sdy组成为葡萄糖4％、蛋白胨1％、酵母粉1％。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
(1)本发明通过设置固体培养基，在大米中加入花生壳作载体，花生壳能增加透气性，提高大米的营养率，增加菌物生长所需的微量元素，并添加土元蜕，为菌株的生长和分孢子的生产提供了良好的营养和空间环境，提高了产孢量，缩短生产周期。
(2)本发明的固体培养基产出的孢子对昆虫的毒力提高，为进一步降低真菌杀虫剂生产总成本提供一种新的途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：固相培养基组分为大米的制备方法
1)布氏白僵菌固相发酵培养基种子液的制备。
采用sdy+2％麦芽糖培养基制备布氏白僵菌固相发酵培养基种子液；方法为在超净工作台上用无菌接菌针将活化后的布氏白僵菌孢子均匀接种于500ml锥形瓶中含sdy+2％麦芽糖培养基液体培养基中，置于恒温摇床内，条件为温度25±1℃，170rpm培养96h，待培养基变为粘稠状和锥形瓶瓶壁出现白色黏状物，即为获得布氏白僵菌固相发酵培养基种子液。
2)固相发酵培养
用电子天平准确称取市场购买的廉价大米1000g，并置于直径等于40cm铁盆中，同时向铁盆中加适量水并用纱布封口，然后放在灭菌锅中121℃高压灭菌20min，冷却后作为待用固相培养基。
3)接种与培养
将种子培养液分别均匀接种于各处理固相培养基中，接种量为固相培养基质量的10％菌悬液；培养基置于灭过菌的有网眼的不锈钢托盘中并置于恒温恒湿光照智能霉菌培养箱中固相发酵，培养基初始含水率为80±5％，25±1℃、95％rh条件下培养10d，前3d无光黑暗处理，从第4d开始在光照强度3000lx和光周期10:14h光照:黑暗条件下培养至第10d。
实施例2：固相培养基组分为米粉+花生壳质量比为1：1的制备方法
与实施例1制备方法相同，步骤2)固相发酵培养为：用电子天平准确称取市场购买的廉价大米和花生壳各500g，用小型粉碎机将大米粉碎成米粉，将花生粉碎成近片状。将粉碎的米粉溶于水制成均匀米粉溶液并将其均匀分布在用水浸泡过的花生壳上，并置于直径等于40cm铁盆中，同时用纱布封口，然后放在灭菌锅中121℃高压灭菌20min，冷却后作为待用固相培养基。
实施例3：固相培养基组分为米粉+花生壳质量比为2:3的制备方法
分别应用电子天平准确称取市场购买的廉价大米400g和花生壳600g，应用实例2方法制备米粉和花生壳均匀混合物，灭菌冷却后作为待用固相培养基。
实施例4：固相培养基组分为米粉+花生壳+麦麸质量比为3∶4∶3的的制备方法
分别应用电子天平准确称取市场购买的廉价大米300g、花生壳400g和麦麸300g，应用实例2方法制备米粉、花生壳和麦麸均匀混合物，灭菌冷却后作为待用固相培养基。
实施例5：
与实施例1制备方法相同，步骤2)固相发酵培养为：用电子天平准确称取每处理固体培养基基本组分中米粉、土元蜕、花生壳、麦麸质量分别为300g、100g、400g、200g，先将米粉溶于水制成均匀米粉溶液，然后将虫蜕和麦麸先后溶于米粉水溶液，再将其与用水浸泡后的花生壳混合，使其制成的溶液恰好在花生壳表面均匀分布，并置于直径等于40cm铁盆中，同时用纱布封口，然后放在灭菌锅中121℃高压灭菌20min。
测定1：产孢量检测
待布氏白僵菌菌丝在各处理固相培养基上充分产孢后，将各处理置于无菌低温电热干燥箱(型号：yb1450)中25±1℃、干燥48h。用取样器(直径：d＝20mm、高：h＝40mm)从培养基质中随机多点取样，均匀混合后从中称取1g，置于250ml锥形瓶中，加100ml0.02％吐温-80无菌水溶液和若干玻璃珠，用sk-1型快速混匀器振荡15min，将得到的孢子液过滤稀释后，用血球计数板(型号：16格×25格)在显微镜(型号：ckx31)下显微计数，重复3次，取平均值。同时取样用烘干法测定基质含水量，以每克干基质的孢子含量作为产孢量。
布氏白僵菌孢子数/ml＝100小格内孢子个数/100×400×104×稀释倍数
表1布氏白僵菌在不同配方固相培养基上的产孢量
筛选的5个布氏白僵菌固相培养基配方以花生壳+米粉+麦麸+土元蜕组合在相同培养条件下的产孢量最高。当布氏白僵菌固相培养基以花生壳和米粉为主料时，在其中加入麦麸，产孢量明显提高，表明布氏白僵菌在固相发酵时需要多种营养成分。当以布氏白僵菌固相培养基以花生壳、米粉和麦麸为主料时，在其中加入土元蜕，产孢量进一步提高。
测定2：不同固相培养基配方培养的孢子对蛴螬的毒力
采用浸渍法测定不同菌种(菌株)对蛴螬的毒力。用无菌镊子将饲养好的3龄蛴螬置于制备好的各个固相培养基配方培养的孢子浓度1.0×108个孢子/ml菌悬液和对照0.02％的吐温-80无菌水溶液中10s，并在滤纸上晾干后置于含200g无菌土(湿度大于80％)的透明一次性杯中，每个杯中1头，每个杯中放置一株发芽的花生作为饲料。每处理10头3龄蛴螬(由安徽省庐江县植保站提供，种类为暗黑鳃金龟幼虫)，重复3次。各个处理均置于恒温恒湿培养箱中(温度：25±1℃，湿度：大于80％)。处理2d后每隔1d观察记录各个处理蛴螬累计死亡数和僵虫数。
表2不同固相培养基配方培养的孢子对蛴螬的毒力
不同固相培养基配方培养的孢子对蛴螬的毒力结果表明，处理后15d后，以米粉+土元蜕+花生壳+麦麸作为布氏白僵菌固相培养基产出的孢子对蛴螬的毒力最高，其累积校正死亡率达81.6，lt50最小为4.9d。
测定3：进一步对米粉+土元蜕+花生壳+麦麸的配方进行优化
表3.各组配方的产孢量和孢子对蛴螬的毒力
以米粉、土元蜕、花生壳和麦麸为培养基组成成分，研究出布氏白僵菌固相发酵最佳配方。布氏白僵菌发酵最佳配方组合为：300g米粉、150g土元蜕、400g花生壳、300g麦麸。在此最佳组合为固相培养基的条件下得到产孢量为21.96×109个/g，对昆虫毒力最高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。