本发明属于生物学领域，具体涉及一种在山羊卵泡颗粒细胞中特异性地增加cdc25c基因表达量以促进山羊卵泡颗粒细胞增殖的方法。
背景技术：
卵巢的功能单位主要是由卵泡构成，并且每个卵泡里面含有一个卵母细胞和一层或多层围绕着卵母细胞的颗粒细胞。围绕在卵母细胞周围的单层扁平状细胞，随着卵母细胞生长、发育，它们会逐渐转变成为立方形，并且会由单层增生成多层，因为它们的细胞浆内含有颗粒状物质，所以它们被称为颗粒细胞(granulosacells)。卵泡的生长经历了原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡以及成熟卵泡等几个阶段。卵泡颗粒细胞的生长变化随着卵泡的变化而发生相应的改变。
颗粒细胞处于卵母细胞透明带外侧，与卵母细胞核的成熟、受精有着密切关系。卵泡颗粒细胞不仅可以与卵泡膜细胞作用从而影响卵泡的发育，还可以通过与卵母细胞形成间隙连接关系从而对卵母细胞的生长与发育进行调控。卵母细胞在生长发育过程中短时间内体积就可以迅速变大，通过间隙连接卵母细胞可以从颗粒细胞获得众多保障其生长发育的必须因素。此外卵母细胞还通过与卵泡颗粒细胞间隙连接摄取小分子代谢物，如能量、核苷酸和氨基酸等，从而弥补卵母细胞摄取小分子代谢能力的不足。通过与卵泡颗粒细胞的间隙连接，卵母细胞85％的代谢需要得以满足。因此，颗粒细胞在卵母细胞生长中还起着重要的营养作用。
表达载体(expressionvectors)是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、rbs、终止子等)，使目的基因能够表达，通常包含四个主要模块：启动子、目的基因、终止子、标记基因。pcmv-ha质粒表达型载体是众多表达载体中常用的一种，可以有效的使目的基因在细胞内完成瞬时表达。该载体为研究cdc25c基因在颗粒细胞中的表达及对上下游基因的调控提供了有效的手段。
本研究则是利用构建的重组pcmv-ha-cdc25c过表达载体，特异性地增加山羊卵泡颗粒细胞中cdc25c的表达量，以促进山羊卵泡颗粒细胞的增殖。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种促进山羊卵泡颗粒细胞增殖的方法。
本发明所述的扩增cdc25c基因的引物如表1所示。
本发明提供了一种促进山羊卵泡颗粒细胞增殖的方法，是在山羊卵泡颗粒细胞中特异性的增加cdc25c基因表达量以促进山羊卵泡颗粒细胞增殖。
具体地，是将目的片段cdc25c基因与pcmv-ha质粒连接，构建过表达载体pcmv-ha-cdc25c(图4)，并将阳性重组质粒导入山羊卵泡颗粒细胞内，以特异性提高cdc25c基因在山羊卵泡颗粒细胞中表达水平，并促进山羊卵泡颗粒细胞的增殖。
本发明中为了获得阳性重组载体具体的过程是：质粒pcmv-ha和切胶回收的目的基因同时用sal1和not1内切酶进行双酶切，并将目的基因与线性化pcmv-ha质粒载体连接形成重组质粒，将连接好的过表达载体转化到dh5α感受态细胞中，菌液pcr检测与过表达载体酶切鉴定选择阳性菌株，对阳性菌进行双酶切鉴定，获得重组质粒。
为了验证本发明的效果，分别选取幼龄母羊和成年母羊的卵巢颗粒细胞做转染，荧光定量pcr检测过表达效果，用流式细胞仪检测细胞周期。结果表明转染过表达载体pcmv-ha-cdc25c后，cdc25c在幼龄山羊卵泡颗粒细胞和成年山羊卵泡颗粒细胞中的表达水平都显著升高，细胞周期结果显示处于分裂期的细胞比例显著升高。说明采用本方法可以促进山羊卵泡颗粒细胞的增殖，为后续卵母细胞体外培养体系的改良提供了技术支撑。
本发明根据山羊cdc25c基因序列设计引物，pcr扩增目的基因，并构建过表达载体pcmv-ha-cdc25c，转染山羊卵泡颗粒细胞，通过qpcr及细胞周期检测颗粒细胞增殖的效果。结果表明过表达载体pcmv-ha-cdc25c能特异性地增加山羊卵泡颗粒细胞中cdc25c的表达量，并且促进山羊卵泡颗粒细胞的增殖。为后续卵母细胞体外培养体系的改良提供了技术支撑。
附图说明
图1.成年母羊与幼龄母羊卵泡颗粒细胞提取总rna，a成年母羊；b幼龄母羊。
图2.目的基因cdc25c片段，a成年母羊；b幼龄母羊。
图3.单克隆菌鉴定，a,b,c,d,e五个菌落皆为阳性。
图4.过表达载体pcmv-ha-cdc25c。
图5.cdc25c基因的相对表达量。
图6.成年山羊空白组细胞周期检测结果，
图7.成年山羊实验组细胞周期检测结果。
图8.幼龄山羊空白组细胞周期检测结果。
图9.幼龄山羊实验组细胞周期检测结果，
图10.各实验组和对照组中分裂期占间期的比例。
其中，图6-9中：fsc、前向散射角；ssc、侧向散射角；pi、碘化丙啶染色液；a、b、不加碘化丙啶；c、d、加碘化丙啶；e、各分裂期所占的比例。
具体实施方式
本发明中所使用的pcmv-ha质粒购于上海碧云天生物技术研究所。
1.山羊颗粒细胞总rna的提取并使用nanodrop1000超微量分光光度计进行测定，od值在1.8～2.0之间，使用1％琼脂糖凝胶电泳分析rna完整性及污染情况检测结果如图1，a为成年母羊，b为幼龄母羊，三条带28s，18s和5s都清晰可见，而且28s亮度是18s的两倍，说明了总rna的质量可靠，可用于后续的实验。
2.反转录：按照tiangen公司fastquantcdna第一链合成试剂盒的说明书操作，反转录产物于4℃保存。
3.引物的设计：根据ncbi数据库中山羊cdc25cmrna全序列(geneid：102187214)，应用ncbi中的primer-blast在线设计引物，扩增片段包括全部编码区，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如表1。
表1.cdc25c基因的引物设计
4.pcr扩增与条带的回收：以反转录后的cdna为模板，按照tiangen公司2×taqpcrmastermix的说明书操作进行pcr扩增，并于4℃保存。扩增出目的基因cdc25c片段，如图2(a为成年母羊，b为幼龄母羊)，目的基因全长为1158bp，如seqidno.3所示。切胶回收后的基因片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果吻合率在99.99％，这表明pcr的产物是所需要的cdc25c基因片段。
5.pcmv-ha质粒和切胶回收的目的基因同时用sal1和not1内切酶进行双酶切，并将目的基因与线性化pcmv-ha质粒按3:1的体积比，16℃过夜连接。
6.载体转化：冰上融化的感受态中加入10μl连接产物，冰上放置30min，然后42℃水浴90s，迅速冰上冷却2min。再加入1000μllb液体培养基(无抗性)，摇匀后37℃、100rpm震荡培养1h。将培养液接种于含氨苄抗生素的lb平板培养基上，倒置培养10-12h。
7.菌液pcr筛选阳性菌株，用sal1和not1内切酶进行双酶切，条件为37℃3h。双酶切之后的产物，使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，如图3，同时菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果与ncbi数据库中山羊cdc25cmrna全序列(geneid：102187214)做比对，比对结果完全吻合，证明过表达载体pcmv-ha-cdc25c构建成功，如图4。
9.山羊卵巢颗粒细胞转染：山羊卵巢颗粒细胞培养24h后，细胞密度达到60％左右之后按照
10.细胞周期检测：贴壁细胞经0.25％胰酶消化后1000rpm5min，去上清，1ml4℃预冷的1×的pbs，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管中。再次离心沉淀细胞，去上清，加入1ml4℃预冷的70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定12h，1000rpm离心5min去上清，加入1ml4℃预冷的pbs，重悬细胞，再次1000rpm离心5min，去上清，加入0.5ml碘化丙啶染色液(pi)，缓慢重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min，用流式细胞仪在波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测发散射情况。检测结果显示无论是成年山羊卵泡颗粒细胞还是幼龄山羊卵泡颗粒细胞，p4/p3都显著上升，过表达组与空白组和空载体组之间都存在显著性差异(p<0.05)，如图6、7、8、9、10，表明重组载体转染进入卵泡颗粒细胞之后可以促进卵泡颗粒细胞的增殖。上述结果表明，所构建的方法，可以促进山羊卵泡颗粒细胞的增殖，为后续卵母细胞体外培养体系的改良提供了技术支撑。
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