本发明涉及生物技术领域，尤其是一种嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基及其菌粉制备方法。
背景技术：
目前动物饲养过程中长期、大量使用抗生素，使致病菌耐药性增强、动物肠道菌群失调、免疫力下降。益生菌可改善动物肠道菌群的平衡、增强动物机体免疫能力、促进动物生长发育、提高动物生产性能、降低肠道内有害物质的产生，是目前人们普遍认为有前途的抗生素的替代品。
嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)是益生菌中常见的一个种,其广泛存在于宿主(人和动物)的胃肠道及人体的口腔和阴道中。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，革兰氏阳性，兼性厌氧，不运动，无芽孢，无鞭毛，形态呈细长杆状，杆的末端呈圆形，过氧化氢酶阴性，不液化明胶,不产吲哚、硫化氢和细胞色素，不分解酪素。能在ph值为4.0-5.0甚至更低的酸性环境中生长，最适生长温度为35℃-38℃。能够同型发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖等产生dl型乳酸，而分解蛋白质的能力较弱，只能利用一些蛋白质的水解产物如氨基酸及肽类。
嗜酸乳杆菌是动物肠道的常驻菌群之一，其能够在胃液中存在并分泌乳酸、乙酸等促进胃部的消化能力；另外，嗜酸乳杆菌能够调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，嗜酸乳杆菌能分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素)，对肠道致病菌产生拮抗作用。作为益生菌，嗜酸乳杆菌同样具有增强机体免疫力，缓解乳糖不耐症，降低血清胆固醇含量，预防糖尿病、高血压等代谢性疾病，降低致癌物质酶的活性进而抑制肿瘤生长，产生激活物质抑制过敏因子缓解过敏等作用。由于嗜酸乳杆菌无残留，不产生耐药性等优点，目前，己普遍应用于动物词料生产中。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高水溶性的嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供应用上述嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基的菌粉制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基，由发酵罐培养基、补料培养基和冻干保护剂三部分组成，其中，
所述发酵罐培养基配方为：15-20g/l酵母浸粉，10-20g/l乳清粉，10-15g/l蛋白胨，10-30g/l蔗糖，0.1g/lmnso4，5g/l乙酸钠，0.5g/lmgso4·7h2o，2g/l磷酸氢二钾，2g/l柠檬酸氢二铵，0.0005-0.002g/ll-半脱氨基酸盐酸盐，1ml/l吐温80，0.5％消泡剂，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，20min；
所述补料培养基配方为：10-30g/l蔗糖，5-10g/l酵母浸粉，5-20g/l乳清粉，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，15min；
所述冻干保护剂的组成包括：5-20％脱脂奶粉，2-10％乳糖，1-10％海藻糖，0.1-1.0％抗坏血酸，0.2-0.5％甘油，0.01-0.1％山梨醇，混合获得。
优选的，上述嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基，各组分组成如下：
所述发酵罐培养基配方为：20g/l酵母浸粉，15g/l乳清粉，10g/l蛋白胨，18g/l蔗糖，0.1g/lmnso4，5g/l乙酸钠，0.5g/lmgso4·7h2o，2g/l磷酸氢二钾，2g/l柠檬酸氢二铵，0.001g/ll-半脱氨基酸盐酸盐，1ml/l吐温80，0.5％消泡剂，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，20min；
所述补料培养基配方为：20g/l蔗糖，5g/l酵母浸粉，15g/l乳清粉，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，15min；
所述冻干保护剂的组成包括：10％脱脂奶粉，4％乳糖，4％海藻糖，0.1％抗坏血酸，0.5％甘油，0.02％山梨醇，混合获得。
上述嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基的菌粉制备方法，具体制备步骤如下：
(1)嗜酸乳杆菌的种子培养：将保存在甘油管中的嗜酸乳杆菌菌株(中国工业微生物菌种保藏管理中心，cgmcc1.3221)接入5mlmrs液体培养基中37℃活化培养即为一级种子；再将活化好的一级种子液以3％的接种量接种于10mlmrs液体培养基中，37℃静置培养24h即为二级种子；最后将活化好的二级种子液以3％的接种量接入150mlmrs液体培养基中，37℃静置培养24h即为三级种子液；
(2)发酵罐培养：发酵罐体积为5l，装载上述发酵罐培养基3l，灭菌消毒温度为115℃，20min；以5％的接种量将培养得到的三级种子液全部泵入发酵罐，发酵培养温度为37℃，搅拌转速150r/min，ph采用50％的氨水自动维持在ph5.7-6.0，并且通入氮气维持发酵罐压力在0.05mpa；采用变速补料的方式，0.5h测定一次发酵罐内ph值的变化率，在8-9h处发现培养液中ph变化率急剧下降，说明此时培养基的营养物质(主要是碳源)已经被消耗完了，所以应在此时进行补料，通过发酵罐上的补料泵先以9ml/l·h的速率补充上述补料培养基，12-14h后ph变化率再次发生变化，改为18ml/l·h的速率进行补料，培养18-20h；
(3)发酵液的分离：将得到的嗜酸乳杆菌的发酵液4℃，5000-9000r/min离心10min-20min，得到菌泥；
(4)菌泥的真空冷冻干燥：按照湿菌体∶上述冻干保护剂＝1:1-1:2的重量比例将冻干保护剂添加液通过无菌操作加入到收集的嗜酸乳杆菌离心后的菌体沉淀物中，悬浮基质为ph6.8的磷酸缓冲液，搅拌30min使悬浮均匀，4℃静置5min，得到含有冻干保护剂的嗜酸乳杆菌菌体悬浮液，在-80℃冷冻冰箱中进行预冷冻处理12h，然后进行真空冷冻干燥，冷冻温度-55℃左右，真空度1-7pa，干燥18-30h后得到活菌数大于5.0×1011cfu/g的嗜酸乳杆菌冻干菌粉。
本发明的有益效果：
上述嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基，增强嗜酸乳杆菌的抗冻能力，提高产品活菌数，采用该培养基的菌粉制备方法所得嗜酸乳杆菌冻干菌粉的存活率可达到95％以上，在常温下保存12个月，活菌数不低于1010cfu/g。
附图说明
图1为本发明制备的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，如图1所示，具备步骤如下：
1、嗜酸乳杆菌的种子培养：将保存在甘油管中的嗜酸乳杆菌菌株(中国工业微生物菌种保藏管理中心，cgmcc1.3221)接入5mlmrs液体培养基中37℃活化培养即为一级种子；再将活化好的一级种子液以3％的接种量接种于10mlmrs液体培养基中，37℃静置培养24h即为二级种子；最后将活化好的二级种子液以3％的接种量接入150mlmrs液体培养基中，37℃静置培养24h即为三级种子液；所述mrs液体培养基的配方为：20g/l葡萄糖，10g/l大豆蛋白胨，5g/l酵母浸粉，10g/l牛肉膏，5g/l乙酸钠，2g/l磷酸氢二钾，2g/l柠檬酸钠，0.2g/lmgso4·7h2o，0.054g/lmnso4，1g/l吐温-80，余量为蒸馏水。
2、发酵罐培养：发酵罐体积为5l，装载发酵罐培养基3l，灭菌消毒温度为115℃，20min；以5％的接种量将培养得到的三级种子液全部泵入发酵罐，发酵培养温度为37℃，搅拌转速150r/min，ph采用50％的氨水自动维持在ph5.7，并且通入氮气维持发酵罐压力在0.05mpa；采用变速补料的方式，0.5h测定一次发酵罐内ph值的变化率，在8h处发现培养液中ph变化率急剧下降，说明此时培养基的营养物质(主要是碳源)已经被消耗完了，所以应在此时进行补料，通过发酵罐上的补料泵先以9ml/l·h的速率补充蔗糖、酵母浸粉和乳清粉的混合料液，13h后ph变化率再次发生变化，改为18ml/l·h的速率进行补料，培养18h；所述发酵罐培养基配方为：20g/l酵母浸粉，15g/l乳清粉，10g/l蛋白胨，18g/l蔗糖，0.1g/lmnso4，5g/l乙酸钠，0.5g/lmgso4·7h2o，2g/l磷酸氢二钾，2g/l柠檬酸氢二铵，0.001g/ll-半脱氨基酸盐酸盐，1ml/l吐温80，0.5％消泡剂，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，20min；所述补料培养基配方为：20g/l蔗糖，5g/l酵母浸粉，15g/l乳清粉，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，15min。
将上述获得样品进行mrs固体培养基平板计数培养，在18h结束时菌体浓度最高达到了1.0×1011cfu/ml的菌体浓度。
3、发酵液的分离：将得到的嗜酸乳杆菌的发酵液4℃，7000r/min离心10min，得到菌泥。
4、菌泥的真空冷冻干燥：按照湿菌体∶保护剂＝1:1的体积比例将保护剂添加液通过无菌操作加入到收集的嗜酸乳杆菌离心后的菌体沉淀物中，悬浮基质为ph6.8的磷酸缓冲液，搅拌30min使悬浮均匀，4℃静置5min，得到含有保护剂的嗜酸乳杆菌菌体悬浮液，在-80℃冷冻冰箱中进行预冷冻处理12h，然后进行真空冷冻干燥，冷冻温度-55℃左右，真空度5pa，干燥18h后得到活菌数为7.2×1011cfu/g的嗜酸乳杆菌冻干菌粉；所述冻干保护剂的组成包括：10％脱脂奶粉，4％乳糖，4％海藻糖，0.1％抗坏血酸，0.5％甘油，0.02％山梨醇；所述ph6.8的磷酸缓冲液的配制方法为：取6.8g的磷酸氢二钾溶于250ml的水中，加0.944g的氢氧化钠溶液118ml，用水稀释到1000ml，摇匀。
经检测，制备的嗜酸乳杆菌冻干菌粉的存活率可达到95.32％，将得到的嗜酸乳杆菌冻干菌粉在常温下保存12个月，其活菌数不低于1010cfu/g。
实施例2
嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，同实施例1，其中：
所述发酵罐培养基配方为：15g/l酵母浸粉，20g/l乳清粉，15g/l蛋白胨，10g/l蔗糖，0.1g/lmnso4，5g/l乙酸钠，0.5g/lmgso4·7h2o，2g/l磷酸氢二钾，2g/l柠檬酸氢二铵，0.002g/ll-半脱氨基酸盐酸盐，1ml/l吐温80，0.5％消泡剂，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，20min；
所述补料培养基配方为：10g/l蔗糖，10g/l酵母浸粉，5g/l乳清粉，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，15min；
所述冻干保护剂的组成包括：20％脱脂奶粉，10％乳糖，1％海藻糖，0.1％抗坏血酸，0.2％甘油，0.1％山梨醇，混合获得。
实施例3
嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，同实施例1，其中：
所述发酵罐培养基配方为：20g/l酵母浸粉，10g/l乳清粉，10g/l蛋白胨，30g/l蔗糖，0.1g/lmnso4，5g/l乙酸钠，0.5g/lmgso4·7h2o，2g/l磷酸氢二钾，2g/l柠檬酸氢二铵，0.0005g/ll-半脱氨基酸盐酸盐，1ml/l吐温80，0.5％消泡剂，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，20min；
所述补料培养基配方为：30g/l蔗糖，5g/l酵母浸粉，20g/l乳清粉，余量为蒸馏水，灭菌消毒温度为115℃，15min；
所述冻干保护剂的组成包括：5％脱脂奶粉，2％乳糖，10％海藻糖，1.0％抗坏血酸，0.5％甘油，0.01％山梨醇，混合获得。
上述参照实施例对该一种嗜酸乳杆菌高密度发酵培养基及其菌粉制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。