一种从北葶苈子中提取的北葶新碱J和北葶新碱K及其制备方法与应用与流程

本发明涉及医药，特别是一种从北葶苈子中提取的北葶新碱J和北葶新碱K及其制备方法与应用。

背景技术：

葶苈子为常用中药材，始载于《神农本草经》，列为草部下品，该药味辛、苦，性大寒，归肺与膀胱经，具有宣泄平喘、行水消肿的功效。2015版《中国药典》收录的“葶苈子”有南北之分，其中十字花科植物独行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟种子习称“北葶苈子”，而播娘蒿Descurainia Sophia(L.)Webbex Prantl.的干燥成熟种子习称“南葶苈子”。随着对北葶苈子的深入研究，发现北葶苈子具有很好的药用价值，含有丰富的多种具有药用效果的活性成分，但如何从北葶苈子中制备出不同活性成分，并用于制备治疗不同疾病的药物，是业内一直希望解决的技术问题。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从北葶苈子中提取的北葶新碱J和北葶新碱K及其制备方法与应用，可有效解决北葶苈子活性成分的制备，实现在制备治疗高脂多糖(LPS)造成心肌细胞(H9c2)损伤药物中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种从北葶苈子中提取北葶新碱J和北葶新碱K，其分子结构式分别为：

其制备方法是：取北葶苈子在240℃下炒制5.5min，每次加北葶苈子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，合次三次提取液，减压浓缩至相当于含生药量2g/mL的浸膏状，室温下，浓缩的浸膏用浸膏体积5倍、体积浓度为80％的乙醇醇沉，静置1h，收集上清液，再加入浸膏体积5倍、体积浓度为80％的乙醇醇沉，如此反复操作4次，将所得上清液浓缩至无醇味，上Dianion HP-20柱，依次用水、体积浓度20％、40％、60％乙醇梯度洗脱，流速6mL/min，每个部位的流动相用量为柱体积的10倍，收集体积浓度60％乙醇洗脱液，浓缩干燥，得组分 A；加组分A的5倍重量的水溶解，20℃下6000rpm离心15min，所得上清液记为水溶物组分B1，沉淀记为水不溶物组分B2；组分B2用甲醇溶解，成组分B2甲醇溶液，硅胶拌样，组分B2甲醇溶液与硅胶用量为1:1，以二氯甲烷：甲醇为流动相梯度洗脱，流速10mL/min，梯度比例依次为100:0、20:1、10:1、5:1、1:1，每200mL检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断洗脱终点，3d洗脱完毕，合并二氯甲烷︰甲醇＝5:1的流份，标为组分C4，组分C4用水溶解，通过ODS柱色谱，依次用水、体积浓度10％、20％、30％、 60％甲醇梯度洗脱，流速3mL/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断洗脱终点，每20mL检识一次，2d洗脱完毕，合并60％甲醇洗脱组分标为组分D5，组分D5用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×20mm,粒径5μm,孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为乙腈︰三氟乙酸水溶液＝25︰75，所述的三氟乙酸水溶液为每1000mL水中加入300μl三氟乙酸混匀制成(以下同)，流速5mL/min，收集保留时间tR＝10～30min的流份，标为组分E1，组分E1通过Sephadex LH-20柱色谱，用甲醇洗脱，流速1mL/min，以试管接取流份，每8mL 作为一管，以茴香醛-浓硫酸对试管中的流份进行薄层检识来判断洗脱终点，合并18-35管的流份标为组分F2；组分F2通过半制备HPLC，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径 12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为乙腈：三氟乙酸水溶液＝11︰89，流速 2.5mL/min，收集保留时间tR＝20.5～21.5min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新碱J；收集保留时间tR＝28.4～27.3min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新碱K。

从北葶苈子的水提物中从中分离并鉴定了两个新的尿苷类衍生物，即：北葶新碱J和北葶新碱K，具有提高脂多糖(LPS)造成心肌细胞(H9c2)损伤的细胞活力，有潜在的心肌保护作用，可有效用于制备治疗脂多糖(LPS)造成心肌细胞(H9c2)损伤的药物。

本发明原料丰富，制备方法易操作，科学合理，可有效解决从北葶苈子中提取北葶新碱 J和北葶新碱K，并实现北葶新碱J和北葶新碱K在制备脂多糖(LPS)造成心肌细胞(H9c2) 损伤的细胞活力药物的应用，开拓了北葶苈子的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。

附图说明

图1为本发明的分子结构式图。

图2为本发明的化合物北葶新碱J的¹H-NMR谱(in CD3OD)图。

图3为本发明的化合物北葶新碱J的¹H-¹H COSY谱图。

图4为本发明的化合物北葶新碱J的HSQC谱图。

图5为本发明的化合物北葶新碱J的HMBC谱图。

图6为本发明的化合物北葶新碱J的NOESY谱图。

图7为本发明的化合物北葶新碱J的HRESIMS谱图。

图8为本发明的化合物北葶新碱K的¹H-NMR谱(in CD3OD)图。

图9为本发明的化合物北葶新碱K的¹H-¹H COSY谱图。

图10为本发明的化合物北葶新碱K的HSQC谱图。

图11为本发明的化合物北葶新碱K的HMBC谱图。

图12为本发明的化合物北葶新碱K的NOESY谱图。

图13为本发明的化合物北葶新碱K的HRESIMS谱图。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，一种从北葶苈子中提取北葶新碱J和北葶新碱K，其分子结构式分别为：

其制备方法是：取北葶苈子10kg用清炒法，炒至温度为240℃，炒制5.5min，每次加100kg 的水煎煮提取三次，每次1.5h，合次三次提取液，减压浓缩成5000mL的浸膏状，室温下，浓缩的浸膏用体积浓度为80％的乙醇25L醇沉，静置1h，收集上清液，再加入体积浓度为 80％的乙醇25L醇沉，如此反复操作4次，将所得上清液浓缩至无醇味，上Dianion HP-20柱，依次用水、体积浓度20％、40％、60％乙醇梯度洗脱，流速6mL/min，每个部位的流动相用量为柱体积的10倍，收集体积浓度60％乙醇洗脱液，浓缩干燥，得组分A；组分A加入5 倍重量的水溶解，20℃下6000rpm离心15min，所得上清液记为水溶物组分B1，沉淀记为水不溶物组分B2；组分B2用甲醇溶解，成组分B2甲醇溶液，硅胶拌样，组分B2甲醇溶液与硅胶用量为1:1，以二氯甲烷：甲醇为流动相梯度洗脱，流速10mL/min，梯度比例依次为100:0、 20:1、10:1、5:1、1:1，每200mL检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断洗脱终点，3d洗脱完毕，合并二氯甲烷︰甲醇＝5:1的流份，标为组分C4，组分C4 用水溶解，通过ODS柱色谱，依次用水、体积浓度10％、20％、30％、60％甲醇梯度洗脱，流速3mL/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断洗脱终点，每20mL检识一次，2d洗脱完毕，合并60％甲醇洗脱组分标为组分D5，组分D5用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×20mm, 粒径5μm,孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为乙腈：三氟乙酸水溶液＝25： 75，流速5mL/min，收集保留时间tR＝10～30min的流份，标为组分E1，组分E1通过Sephadex LH-20柱色谱，用甲醇洗脱，流速1mL/min，以试管接取流份，每8mL作为一管，以茴香醛 -浓硫酸对试管中的流份进行薄层检识来判断洗脱终点，合并18-35管的流份标为组分F2；组分F2通过半制备HPLC，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为乙腈︰三氟乙酸水溶液＝11︰89，流速2.5mL/min，收集保留时间 tR＝20.5～21.5min的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新碱J，收集保留时间tR＝28.4～27.3min 的流份，浓缩干燥，得到化合物北葶新碱K。

本发明还对其他不同量的北葶苈子进行提取北葶新碱J和北葶新碱K，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一详述。

本发明方法稳定可靠，上述提取物经鉴定为北葶新碱J、北葶新碱K，具有心肌保护作用，试验证明，北葶新碱J和北葶新碱K能显著提高脂多糖(LPS)造成心肌细胞(H9c2)损伤的细胞活力，具有心肌保护作用，有效用于制备提高脂多糖(LPS)造成心肌细胞(H9c2) 损伤的细胞活力的药物，开拓了北葶苈子的药用价值和商业价值，并经实地试验和应用取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：

1仪器

核磁共振用Bruker AVANCEⅢ500核磁共振仪(TMS内标)(Bruker)，红外光谱用Nicolet is 10 Microscope Spectrometer(Thermo Scientific,USA)，高分辨质谱用Bruker maxis HD mass spectrometer，紫外光谱用Shimadzu UV-2401PC apparatus，圆二色谱仪用Chirascan qCD(Applied Photophysics Ltd,Britain)，高效液相色谱用Waters Alliance系列2695高效液相系统，配备2998 型二极管阵列检测器，Empower3色谱数据工作站，LC50型高压制备液相色谱仪，UV200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×10mm.D.S-5 mm,12mm)(YMC有限公司)，其余有N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，A-1000S 型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，N-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)， FDU-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，AB204-N万分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)，iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD)，二氧化碳培养箱(上海STIK)，超净工作台(苏净集团)，Arium 611VF超级组合型超纯水器(SARTORIUS)，倒置显微镜(Nikon)，PB-10酸度计(德国赛多利斯集团)， SORVALL ST16R Centrifuge高速低温冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司)；酶标仪 (BIO-RAD 680)；超净工作台(江苏苏净集团)；90-3磁力搅拌器(上海振捷实验设备有限公司)； RD-7080全自动新型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；微量加样器(Nichipet EX PLUS)；AB204-N电子读数分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品)；10cm培养皿、 96孔培养板、冻存管(Corning)；普通手术器械。

柱层析填料Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20(日本三菱化学公司)，Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司)，Sephadex LH-20(Parmacia Biotech公司)，柱层析所用硅胶H(160-200目) 为青岛海洋化工厂生产，培养皿、96孔培养板、细胞冻存管(Corning公司)，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。

H9C2大鼠心肌细胞株(中科院上海细胞库)；脂多糖(Sigma公司)；黄芪注射液(黑龙江珍宝岛药业股份有限公司)；DMEM高糖培养液(Gibco)、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、胰蛋白酶(Gibco)，DMSO(Solarbio)；氨苄青霉素、Tris碱(Sigma)；EDTA、MTT及 DMSO(Amresco)；水为超纯水，PBS缓冲液等为自配。

北葶苈子于2014年采自河南南阳，经河南中医学院陈随清教授及董诚明教授鉴定为十字花科植物独行菜Lepidium apetalum Willd.的干燥成熟种子。

2结构鉴定

北葶新碱J：无色结晶性粉末(DMSO-d6)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:618.1566 [M+Na]⁺(calcd.For C25H29N3O14Na 618.1547)，确定其分子式为C25H29N3O14Na；(c 0.01,MeOH)；UV(MeOH)λmax:208(0.53),258(0.21)nm；CD(MeOH):265(Δε+11.08)nm,239 (Δε-19.19)nm；IR(iTR)νmaxcm^-1：3288,2927,2856,1674,1201,1022cm^-1。其结构式及核磁数据如下：

北葶新碱K：无色结晶性粉末(CD3OD)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:618.1566 [M+Na]⁺(calcd.For C25H29N3O14Na 618.1547)，确定其分子式为C25H29N3O14Na；(c 0.01,MeOH)；UV(MeOH)λmax:206(0.99),257(0.37)nm；CD(MeOH):240(Δε+16.65)nm, 216(Δε-14.08)nm；IR(iTR)νmaxcm^-1：3366,2926,2853,1676,1202,1135,723cm^-1。其结构式及核磁数据如下：

表1北葶新碱J(in CD3OD)和北葶新碱K(in CD3OD)的NMR数据

根据上述核磁数据，北葶新碱J和北葶新碱K结构式如下：

鉴定图谱情况由图2-图13所示，这里不再一一详述。

3活性检测

H9c2细胞按照2×10⁴接种于96孔板中。称取LPS 1mg，用10μl溶媒DMSO溶解，后加入1mL含DMEM培养基中，母液浓度为1mg/mL的LPS，20μg/mL的终浓度于96孔板中。将细胞分为正常组、模型组及不同用药组。培养24h后每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL， 37℃继续培养4小时，小心吸净培养液，每孔加入150μLDMSO，震荡10分钟，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔的吸光度值(A)，以监测细胞的数目与活力。

4活性结果

北葶新碱J与北葶新碱K在10μM时与M组比，OD值明显升高(P<0.05)，表明北葶新碱J与北葶新碱K显著性提高LPS造成H9c2损伤的细胞活力，具有潜在的心肌保护作用。见表2。

表2北葶新碱J与北葶新碱K对LPS刺激H9c2细胞增殖的影响(n＝4)

注:与正常组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与M组相比，^#表示P<0.05，^##表示P<0.01。

以上试验清楚表明，本发明提取物北葶新碱J与北葶新碱K具有心肌保护作用，可有效用于制备治疗脂多糖(LPS)造成心肌细胞(H9c2)损伤的药物，开拓了北葶苈子的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。