本发明属于法医遗传学领域，具体涉及一种用于对未知来源的中国男性生物学检材在y染色体进化树上的位置进行高分辨率划分的基于165个y-snp的法医学二代测序试剂盒。
背景技术：
y染色体是一类仅存在于男性个体的染色体，其95％区域为非重组区(non-recombinationregionsofychromosome，nry，以下未做特殊说明的y染色体均指非重组区)具有父系遗传、非重组、有效群体小和在生物地理学上具有特殊性等特点，使其在法医学方面，如在男性作为嫌疑人的性侵案件、群体灾难事件遇难者身源鉴定和失踪人员调查中，发挥着重要作用。y染色体短串联重复序列(ychromosomalshorttandemrepeat,y-str)用于寻找刑事案件的男性嫌疑人已经取得了巨大成功。然而，由于y-str突变率很高(约10-3)，同一父系的个体可能会发生突变而呈现出不同的y-str分型，这阻碍了对样本来源的推断。因此，解决y-str突变造成的潜在混淆，正确判断犯罪现场检材的地理、民族甚至是家系来源，是法医学需要解决的科学问题。
y染色体单核苷酸多态性(ychromosomalsinglenucleotidepolymorphism，y-snp)突变率比y-str低的多(约10-9)，同一父系个体发生突变的概率很低，据此已经建立了y染色体进化树。在人类的起源、进化、迁移的研究中，遗传学家能够通过y染色体进化树来估算某一个群体或人种最近的共同祖先存在的时间，从而为预测潜在的地理或祖先起源提供线索。不断发展的检测技术为y染色体进化树的构建提供了验证和优化，越来越多的y-snp位点得以被发现，这在极大程度上扩充了y染色体进化树，使得单倍群的划分可以愈发精细。截至2016年5月18日，国际遗传系谱学会(internationalsocietyofgeneticgenealogy，isogg)在线提供的可用于构建y染色体进化树的y-snp位点已达58198个。细分之下的y染色体进化树能追溯到更短世代数内的最近共同祖先，使其应用于对男性样本进行地理、民族甚至家系溯源成为可能。这启发我们运用y-snp单倍群克服在法医学溯源过程中因y-str突变造成的不利影响。来自同一父系的个体包括亲缘关系较远的个体均拥有完全相同的y-snp单倍群分型，可对应于y染色体进化树上的同一分枝。因此，若未知男性检材与参比父系单倍群不一致，则表明共祖关系发生在更远的时间，可排除来自于同一父系。若单倍群一致，则不能排除来自同一个父系。显然，对同一父系的确信，要依赖于单倍群细分程度与所使用遗传标记的密度。但是，仅为重建局部区域内的父系而使用目前现有最高分辨率y染色体进化树(http://www.isogg.org/tree/index.html)是繁琐且耗时的。vanoven等人用759个snp位点构建了一个最小参考树，提供了各主要单倍群在各大洲的分布概况(其中包括中国在内的亚洲主要单倍群为12个)，但该树分辨率较低，极大地限制了在实际应用中对某一区域内未知男性检材的具体来源推测。中国的国土面积位居世界第三，人口总数则位列世界第一，包含56个具有群体结构差异的民族。因此，我们需要选取最具代表性、最合理的y-snp构建一个针对中国群体的、非冗余的、高分辨率的y染色体进化树，同时，该树必须具有稳定且完整的拓扑结构。这将为推断中国群体来源的男性样本的地理、民族甚至是家系来源提供便利，为警方排查工作提供可靠的预测范围。
中国特异性y染色体进化树的完整性有赖于各级分枝代表性snp位点(包括indel位点)的无缺漏纳入，但使用法医传统的检测方法，如snapshot、焦磷酸测序等，无法进行多样本、大量snp位点的连续检测。二代测序技术在准确性和高通量方面具有巨大优势，适用于多样本、多y-snps的检测。将其作为技术手段使我们在构建高分辨率y染色体进化树时，不会因检测限制而被迫减少y-snp和分枝数目，从而在每一次的检测中都保证了体系的完整性，避免分型错误。
综上所述，急需筛选一组适宜的y-snp遗传标记，应用二代测序技术，构建一个基于适用于中国人群的、非冗余的、高分辨率的完整y染色体进化树的二代测序体系，为法医溯源提供一种新的技术手段。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是利用y-snp遗传标记对未知来源的中国男性生物性检材在y染色体进化树上的位置进行高分辨率划分，以推断其男性血统来源。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种基于165个y-snp的法医学二代测序试剂盒，该试剂盒包括复合扩增引物混合物。所述的基于165个y-snp遗传标记的法医学二代测序试剂盒中的复合扩增引物混合物包含了165个y-snp遗传标记的共计330条扩增引物。进一步的，各扩增引物的核苷酸序列分别如表2中seqidno.1至seqidno.330所示。
表2复合扩增引物
进一步的，所述试剂盒还包括复合扩增反应混合液。
更进一步的，上述试剂盒还包括标准dna。
优选的，所述标准dna为007标准dna。
本发明还提供了上述试剂盒在对未知来源的中国男性样本进行单倍群划分中的用途。
本发明的有益效果为：本发明试剂盒包含165个y-snp遗传标记，兼顾了y染色体进化树的完整性和高分辨率，以尽可能少的位点数达到了较高的体系分辨能力，可将任一中国男性个体检材正确地划分至现已公认的y染色体进化树分枝上。本试剂盒采用单管内复合扩增和具有更高通量的二代测序技术，可以一次性获得多个男性来源生物性检材的165个y-snp遗传标记的基因分型，快速实现对生物性检材的来源地、所属人群甚至家系溯源。本试剂盒包括了标准dna的分型结果，可确保分型准确；该试剂盒复合扩增产物长度最短仅125bp，最长不超过224bp，对于法医学常见的降解检材的检测具有优势，具有好的应用前景和推广价值。
附图说明
图1为本发明所检测的165个y-snp位点所构成的y染色体进化树，每一条横线末端指向一个单倍群，横线上方为该单倍群的决定性y-snp位点。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明基于y-snp遗传标记的法医学二代测序试剂盒，是基于筛选得到的165个y-snp遗传标记，利用目前迅速发展的二代测序体系构建的。该试剂盒由复合扩增引物混合物、标准dna和复合扩增反应混合液构成。
该试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，分别在单管内一次性同时扩增获得单一样本所有165个y-snp的165个dna片段(构建测序文库)。
然后以此165个dna片段为模板，分别加上接头(此接头在单个样本时是一致的，若要进行多个样本的同时测序，则需要在加接头的基础上分别给不同样本加上不同的标签以示区分。接头和标签均可购自abi公司)。混合包括分型标准dna样本在内的多个样本后进行乳液pcr扩增、文库富集。
最后，007标准dna的扩增产物作为阳性对照与样本同时进行测序反应，得到各样本的测序结果；此后，首先分析分型标准dna的测序结果准确与否，若该分型标准dna测序结果正确，表明该次测序结果可靠，则可进一步分析确定待测样本165个y-snp遗传标记的分型结果。
在本发明中，y-snp的选择对中国男性群体溯源复合检测试剂盒的构建极其关键。如前所述，y染色体遗传表现为父系遗传，在人类进化研究中有重要的意义。在运用y-snp构建的y染色体进化树中，用单倍群(haplogroup，hg)表示一组类似的单倍型(haplotype)的集合。现有研究结果表明，其分布具有明显的人群和地理特异性，任何合理的y染色体dna检测体系都不能忽视对单倍群的划分。isogg(网址www.isogg.org)在线提供的y染色体系统发育树给定了目前认为可用于划分单倍群的所有位点，这无疑是目前已知最完整、分辨率最高的y染色体进化树，但由于其所包含的位点数量极其庞大、部分位点的稳定性有待考证，且各节点上的snp位点存在冗余，使得其不适用于日常检案。vanoven等人在isogg和ycc所公布的系统发育树的基础上筛选出了包括各大洲主要单倍群节点在内的759个y-snp构建了一个最小参考树，但由于其分辨率低，在实际应用中，其对未知男性生物检材进行进一步地理、民族甚至家系溯源的能力有限。因此，我们需要选取最具代表性、最合理的y-snp构建一个针对中国群体的、非冗余的、高分辨率的y染色体进化树，来推断中国群体来源的男性样本的地理、民族甚至家系来源。
本发明试剂盒中y-snp位点的选择旨在使用较少y-snp位点的同时尽可能地提高y染色体进化树的分辨率。因此，本发明通过大量研究，得出了纳入本发明试剂盒中的y-snp位点的采纳标准：1)接近y染色体进化树根部且为中国群体所属单倍群的代表性y-snp位点，不同主要单倍群的下级分枝中所包含位点数目依照该单倍群在人群中所占百分比而有所差异，在人群中所占比重越大，则下级分枝所包含的y-snp位点越多；2)中国群体所属主要单倍群的重要中间节点y-snp，用以保证树的拓扑结构的完整性；3)在中国群体中多态性良好的y-snp位点；4)可以设计出250bp以内扩增产物。其中，最后一条是每个位点必备条件。根据上述标准，本发明首次设计了165个位点的组合测序，这些位点的选择关键是在于他们所决定的单倍群是否在中国群体内出现，只要单倍群在中国群体内被观察到，其决定位点将被纳入试剂盒。目前，仅在中国群体内观察到这165个位点所决定的单倍群，因此，本发明最后确认了165个y-snp遗传标记用于建立此基于二代测序技术的复合检测体系。
本发明研究确认的165个y-snp遗传标记可覆盖所有中国人群主要单倍群及其亚群，共计161个。经过群体调查实验(即实施例的检测实验)证明，本发明基于二代测序技术的y-snp复合检测体系可将任一中国男性样本正确归属至现已公认的y染色体进化树分枝上。
试剂盒中所涉及的165个y-snp位点信息如表3。
表3165个y-snp位点
本发明试剂盒在y-snp的检测中运用了复合扩增技术。该技术可以在单个反应体系中同时扩增多个目的dna片段，具有方便、快捷、节约样本和成本等优点。但这对引物设计有较高的要求，本次引物设计通过赛默飞公司“白手套”计划完成，设计完成后的165对引物混合在同一引物池中。
本发明试剂盒利用上述复合扩增引物，获得了包含165个y-snp遗传标记的扩增产物(即，文库)，继而以此为模板，进行二代测序反应。
本试剂盒采用的测序可在s5xl(ions5xlsequencer，来自赛默飞公司)平台上进行。该平台的二代测序技术是一种基于碱基延伸时释放氢离子，从而改变微环境ph值这一原理进行的检测技术。芯片中含有大量的微孔(依型号不同而有所差异)，每个微孔理论上仅容纳单个微珠，而经过乳液pcr反应之后，理论上一个微珠上仅存在一条扩增片段的多个克隆，即，理论上，单个微孔内仅存在一条扩增引物的多个克隆。通过同时检测各个微孔中反应液在加入不同碱基后ph是否变化，即可反映实际得以延伸的碱基类型，直至所有文库的检测完成。其特点在于，可以同时分析多个样本的多个snp位点，且得到的结果是包括侧翼序列在内的整条核苷酸序列，因而不仅可以了解到目的位置的碱基分布情况，还可以看到侧翼序列的碱基排布，通过对比标准序列，可以更直观地对分型结果的可靠性进行评估。
在每一样本检测snp位点数一定的情况下，为了实现单次检测更多样本，需要注意各测序模版间量的均衡性，而此均衡性的主要影响因素则为文库构建结果，即在于文库内各扩增产物片段间数量的差异，而导致这一差异的主要原因则在于不同引物扩增效能的差异，因而在进行引物设计和混合引物池时需要尤其注意。
最后设计出的所有165个y-snp位点复合扩增引物序列参见表2。
本发明试剂盒中引入阳性对照是作为质量控制，用以评估单次测序结果是否可靠。本发明中提供的阳性对照包括了007标准dna样本的所有165个y-snp遗传标记的标准分型结果。对未知样本进行检测时，并列地进行标准dna的扩增和测序，通过对007标准dna分型结果的分析，评估当次检测结果的可靠性，决定是否进行后续分析。若结果可靠，则可对未知样本进行分型，并对其所属单倍群进行划分。
更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：
a)复合扩增反应混合液：含dna聚合酶的pcr缓冲液、去核酸酶水；
b)复合扩增引物混合物：如表1所示的165个y染色体snp遗传标记的扩增引物对组成的复合扩增引物池；
c)部分消化引物序列试剂：fupa反应液；
d)接头连接反应试剂：包括接头、标签、转换液及连接酶；
e)文库纯化试剂：包括
f)文库定量反应试剂：包括e.coli标准品、
g)乳液pcr反应试剂：含有缓冲液、酶、isp(ionsphereparticle)、反应油以及破乳溶液在内的ion520tm&ion530tmchef试剂仓；
h)文库富集试剂：含有洗脱液、文库富集beads、naoh溶液、beads洗脱液、tween溶液、中和液、去核酸酶水的富集仓v2；
i)测序反应混合物：含有聚合酶、测序引物、内参isp的ions5tmchef溶液仓；
j)测序反应其它试剂：含有naoh溶液、dntps的ions5tm测序试剂仓、ions5tm洗涤溶液、ions5tm清洁溶液；
k)007标准dna：作为质控指标，从文库构建开始，与其他样本并行处理。
上述a、c、d、f到j中各试剂除纯水和naoh外，一般需使用配套的商业化的产品，本次所用试剂为hi-qtm系列，购自赛默飞公司。文库纯化试剂e中的
至于提取待检测样本中的dna的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取dna模板可以参照现有的常规方法即可进行，亦可使用商业化试剂按指南进行。
利用本发明所述试剂盒，可以对法医dna样本进行分析。分析方法包括以下步骤；
1)提取待检测样本的dna，作为扩增模板；
2)利用上述复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物对步骤1提取的dna以及上述007标准dna进行单管内复合扩增；
所述复合扩增pcr的反应的循环参数为：99℃，2分钟；99℃，15秒，60℃，4分钟，21个循环后10℃保存；
3)利用上述部分消化引物序列试剂部分消化步骤2)所构建文库的引物；
所述部分消化文库引物的循环参数为：50℃，10分钟，55℃，10分钟，60℃，20分钟；
4)利用上述接头连接反应试剂在上述方法步骤3中所述产物上加接头，并利用文库纯化试剂对其进行纯化；
所述加接头的循环参数为：22℃，30分钟，72℃，10分钟；
5)利用上述文库定量反应试剂对上述方法步骤4中所述产物进行定量，以保证后续的文库混合时各文库间量的均衡；
所述定量反应的循环参数为：50℃，2分钟，95℃，20秒；95℃，3秒，60℃，32秒，40个循环；
6)利用上述乳液pcr反应试剂及文库富集试剂在ionchefsystem进行乳液pcr反应，并对产物进一步富集，以保证测序时的质量和数量均达到较高水平；富集后的产物利用上述测序反应混合物在ionchefsystem内自动混合测序所需试剂并载入测序芯片内；
所述乳液pcr反应的循环参数依所使用试剂盒而定：仪器预设提供所有可用试剂盒的参数，使用时选择所用试剂盒即可；
7)利用测序反应其他试剂对上述步骤6中的芯片进行测序，获得标准dna及样本各位点基因型；
所述测序反应的循环参数依所需测序的遗传标记类型及片段长度、所用芯片等而定：仪器预设提供所有可用的参数，使用时选择相应设置即可。
进一步的，上述方法步骤7中所述的测序结果分析包括以下步骤：在ions5xlsequencer上进行测序反应，反应结束后得到含有该位点测序结果的excel表格，以及测序原始文件(包括序列信息文件bam.和对应的定位信息文件bai.)，在对007标准dna分型结果及序列分析，认为该次测序结果可信后，方可进行对该次测序其他样本进行分析，获得待测样本基因型。
以下用具体实例进一步具体说明本发明，其中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器：
1)nanodrop-1000微量紫外可见分光光度计，赛默飞公司；
2)proflexpcr扩增仪，赛默飞公司；
3)纯水装置，millipore公司；
4)台式高速离心机，赛默飞公司；
5)移液器eppendorf公司；
6)磁力架，赛默飞公司；
7)实时定量pcr仪7500型，赛默飞公司；
8)s5xl二代测序系统，赛默飞公司；
9)ion530芯片，赛默飞公司；
10)漩涡振荡器，赛默飞公司。
实施例1本发明试剂盒的制备
用于检测的y-snp复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：
a)复合扩增引物混合物。由表3所示的扩增引物混合得到，由赛默飞公司合成并混合至一个引物池。
b)复合扩增反应混合液、部分消化引物序列试剂。本实施例中使用赛默飞公司ionampliseqlibrarykit2.0提供的pcr反应混合液。
c)接头连接反应试剂。本实施例中使用赛默飞公司的ionxpressbarcodeadapter，将接头和标签按1：1混合为标签-接头混合物，2倍稀释备用。需要说明的是，由于标签的主要作用为区分不同样本，因而在单次测序样本数仅为1的情况下可不使用标签。
d)文库纯化试剂。本实施例中使用
e)文库定量反应试剂。本实施例中使用ionlibrarytaqman定量试剂盒，其中
f)乳液pcr反应试剂及文库富集试剂。本实施例中使用ion520&ion530kit-chef试剂盒。
g)测序反应所用试剂。本实施例中使用ions5sequencingkit测序试剂盒。
将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于y-snp遗传标记的法医学二代测序试剂盒，用于后继的实验。
实施例2使用本发明试剂盒检测51个无关男性个体检材
使用上述基于165个y-snp的法医学二代测序试剂盒，进行了51个无关中国男性个体检材的检测。具体的检测过程按如下步骤进行：
a、用试剂盒或盐析法从无关中国男性个体血样中提取dna，作为复合扩增模板(盐析法所提取dna来自实验室已有dna)；
b、以步骤a中的dna模版，利用上述复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物将dna模版及007标准dna进行单管内复合扩增，构建各样本文库。体系为20μl：扩增引物混合物10μl，复合扩增反应混合液4μl，模版dna1μl，加入去核酸酶水补足20μl；循环条件：99℃2分钟，99℃15秒、60℃4分钟、循环21次。
c、引物的部分消化：步骤b中的产物中分别加入2μlfupa反应液，使总体积为22μl，然后50℃10分钟，55℃10分钟，60℃20分钟。
d、加接头：在步骤c的各产物中分别加入转换液4μl，以及上述稀释好的标签-接头混合物2μl，充分混合后分别加入dna连接酶2μl，使体积达30μl，然后22℃30分钟，72℃10分钟。
e、文库纯化：将步骤d中得到的产物分别完全转移至含有45μl
f、文库定量：将步骤e中的产物分别取5μl，稀释100倍后，分别取9μl，加入
g、乳液pcr反应、文库富集、芯片载入：文库混合物的准备：步骤f中定量后的文库按原浓度最低者进行稀释(不低于30pm)、混合，使混合后各文库含量均一，取稀释后的文库混合物加入去核酸酶水至25μl，保证终浓度在30-60pm范围内。在ion520&ion530chef试剂仓的相应位置按操作手册指示加入前述文库20μl，安装至ionchefsystem，并同时安装富集仓v2、ions5chef溶液仓、芯片及相应配件，仪器根据所设程序自动完成乳液pcr反应及文库富集。富集后的产物在ionchefsystem内自动混合测序所需试剂并载入测序芯片内。
h、使用赛默飞公司的ions5xlsequencer二代测序系统进行测序：按操作手册安装反应用ions5测序试剂仓、ions5洗涤溶液、ions5清洁溶液等配件，清洗并初始化s5xl测序系统，安装已载入文库的芯片，进行测序反应。
测序条件：按提示选择所用试剂盒，设置flow数为500，本实施例的原始文件收集使用torrent_suiteserver(v5.2.1)，数据分析选用variantcaller(v5.2.1.38)和coverageanalysis(v5.2.1.2)。后续分析使用igv(integrativegenomicsviewer)v2.3.72.
所得的所有男性样本及007标准dna的分型的结果见表4(t：藏族样本；h：回族样本；u：维族样本)，从表中可以看到，共划分至28个单倍群。具体划分方法如下：如图1所示，因为进化树是呈树状分布的，不同单倍群即为树的分枝，而各snp在树上则分布于各自的节点。进行单倍群划分时，从树根部往上看，若该节点snp为突变型，即，阳性，则可沿分枝往上，若某节点为阴性，则该节点上一个snp所在节点为终点，其所提示单倍群为该样本所在单倍群。因而，一个单倍群往往系由多个snp分型决定的。
表4检测结果
序列表
<110>四川大学
<120>基于165个y-snp的法医学二代测序试剂盒
<130>a180012k
<160>330
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cacagaaacagattttctacaacaggaa28
<210>2
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