本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种用于检测轻型脑外伤的微小核糖核酸(microrna,简称mirna)组合及其应用。
背景技术：
：：创伤性颅脑损伤(traumaticbraininjury，tbi)，也称为脑外伤或头部外伤，即由外伤引起的脑组织损害。tbi不仅发生在损伤瞬间，而且在其后的数分钟到数天内由于脑血流量、颅内压的改变引起继发性损伤，致死、致残率高1。据世界各国不同时期的统计显示，tbi的发病率居创伤的首位2，是发达国家青少年伤病致死的首位病因。随着我国社会经济水平不断提高，高速交通工具的普及，建筑业高速发展，加之出现的各种快速、刺激性的体育运动使tbi的发病率呈持续升高的趋势。尽管tbi的总体死亡率由30年前的50％降低至目前的30％左右，但生存质量却无相应改善，给家庭及社会均造成很大负担。存活的患者中，轻度损伤患者10％会遗留永久残疾，而中度和重度患者可达到66％和100％3。tbi患者中，轻型脑损伤(mtbi)约占tbi的61.7％，占有比例较高。与重型脑损伤相比，mtbi的损伤程度相对较小，但其临床症状较隐匿，若未得到及时有效的诊断和治疗，将会对给许多患者留下多种不易缓解的后遗症。因此，加强对tbi，尤其是mtbi患者早期诊断对神经重症监护的救治工作具有重要的指导意义；通过相应指标对颅脑损伤严重程度进行早期评估，确定有效的治疗及康复计划对于降低患者的伤残率、提高其生存质量至关重要。目前可用于脑外伤病人诊断的指标有主要有：格拉斯哥昏迷积分(giasgowcomascale，gcs)，影像学表现(ct和mri)，脑电图，生化代谢指标等4,5，但每种方法都具有其局限性和片面性，如：①gcs评分主要从是否有自动睁眼、执行命令、言语和肢体运动等神经行为来判断，经常受到镇静药、气管插管等因素的制约；②ct和mri是目前脑外伤后最常用的辅助检查，ct能从结构上对颅脑损伤程度进行直接评估，但敏感性和特异性较低，mri可以克服ct的缺点，但成本高，耗时长；③s100β(星形胶质细胞蛋白)，nse(神经元特异性烯醇化酶)，uch-1(泛素羧端水解酶)以及gfap(神经胶质纤维酸性蛋白)等可作为重型脑外伤的诊断的生物标志物，但它们对轻型脑外伤的诊断有待证明6,7。因此，探索和发现用于轻型脑外伤患者特异性标志物，为临床提供简便、快捷、准确、特异的伤情观察与疗效判断指标，也已成为摆在我们面前的一项十分紧迫的任务。近年来研究发现微小核糖核酸(microrna,mirna)是临床诊断和治疗的一类潜在的标志物。mirna是一类长约19到24个核苷酸的非编码、内源性单链小核糖核酸分子，主要通过与靶基因mrna3m端非翻译序列完全或部分互补结合,导致靶mrna降解或转录后翻译抑制，在基因转录后水平上调控靶基因的表达。人体大约有1000余种mirna，这些mirna可以调控20％～30％的基因表达，从而调节人体生长、发育、生理和病理等过程。近年研究发现，血清mirna具高度稳定性8、特异性，且在多种疾病状态下异常表达9，相比组织mirna具有取材方便的特点，预示血清mirna可作为疾病诊断的无创性指标。目前国内外有关血清mirna的研究从开始的主要集中在肿瘤疾病，逐渐涉及肝炎、糖尿病、冠心病、脑损伤等各种疾病10。最近的研究发现一些与脑外伤有关的mirnas，但主要停留在在细胞和动物实验水平，分析组织和细胞的mirna表达谱的变化11-14。2012年有研究者首次检测了颅脑损伤大鼠血清mirna表达谱的变化，发现血清mir-let-7i,mir-122和mir-340-5p水平显著上调，其中mir-let-7i在脑中富集15。2014年有研究报道了小鼠闭合性脑外伤的mirna表达谱,以上研究提示颅脑损伤后，组织和血清中存在一些特异变化的mirna，是潜在tbi标志物。然而，目前尚缺乏有关临床脑外伤患者血清特异性mirna的研究，2010有报道发现人脑外伤后血清中一些mirna水平发生了变化16，但该研究所观察的病人例数较少(仅10例)，所观察的病程只有3天，并且没有相应评估。本课题组发现在大鼠脑外伤后显著升高的mir-93，mir-191,andmir-499在人脑外伤后也显著升高，并与脑外伤的严重程度显著相关，可用于诊断脑外伤17，但是未做基因芯片分析。因此，进一步大样本筛选重度颅脑损伤患者血清特异性mirna，评价其对脑外伤诊断和病情监控的价值，对于轻型脑损伤患者的早期诊断和治疗具有重要意义。目前尚没有利用无创伤性、取材方便的血液标本检测判断与创伤性颅脑损伤相关的特异性mirna组合及检测生物芯片或试剂盒。技术实现要素：本发明的目的就在于通过研究轻型脑外伤患者血清mirna的特异性变化，筛选出与正常人表达差异显著的一组血清mirna，并利用这些mirna的探针制备出适用于临床诊疗的生物芯片和试剂盒，为实现轻型脑外伤早期检测提供特异性的中间结果以及迅速的无创伤性检测手段。本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的：一种用于检测轻型脑外伤的mirna组合，其包括下列mirna：mir-103a、mir-219a、mir-422a和mir-520d。该mirna组合可以进一步包括以下mirna的一种或多种：mir-302d、mir-518f、mir-627。一种用于检测轻型脑外伤相关的mirna的探针组合，其特征在于该探针组合包括检测上述mirna的探针的组合。进一步，该探针组合还包括检测以下mirna的探针中的一种或多种：mir-302d、mir-518f、mir-627。所述的探针组合为：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4；进一步，该探针组合还包括以下mirna探针中的一种或多种：seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7。上述任一探针组合在制备检测轻型脑外伤的试剂或工具中的应用。一种用于检测轻型脑外伤的检测试剂盒，该试剂盒包含上述任意一项探针组合；所述试剂盒还可以包括taq酶、dntp、氯化镁和pcr缓冲液(pcr缓冲液为通用的10×pcr缓冲液，不含mg2+)。以下是对本发明的进一步描述：一种用于检测轻型脑外伤的mirna组合，其包括下列mirna：mir-103a、mir-219a、mir-422a和mir-520d。该mirna组合可以进一步包括以下mirna中的一种或多种：mir-302d、mir-518f、mir-627。上述mirna组合的筛选方法包括以下步骤(见图1)：(1)收集重型脑外伤患者混合血清或血浆，提取总rna；(2)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的taqman低密度芯片(tlda)(生产厂商为appliedbiosystems)总共检测了人类基因组中的754种mirna，与年龄、性别匹配的正常对照组比对后初筛出脑外伤表达显著升高的mirna；(3)用荧光定量pcr方法(taqman探针法)对轻型脑外伤标本进行逐个检测从tlda初筛出的表达差异显著的mirna；(4)进一步用定量pcr方法对大批量重型与轻型脑外伤标本进行逐个验证，筛选出稳定的表达差异显著的一组mirna。(tlda初筛的目的是筛选出重型脑外伤组和正常组之间有显著差异的mirna，更侧重于定性和趋势；复筛采用的是准确的荧光定量pcr，对单个样本中每个mirna的含量进行测定，则侧重于定量；荧光定量pcr是对tlda初筛的基础上进一步精确定量，两者是一致的，只是侧重点不同)。具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：(1)分别收集正常组、重型脑外伤疗效好组和疗效差组的混合血清或血浆，并提取总rna；(2)根据已知的人全部754个成熟mirna设计引物(根据已知的mirna设计引物为本领域技术人员公知的技术，可交由引物合成公司完成，相关引物的序列不再赘述)及荧光探针，对上述rna进行测序和检测，初筛出重型脑外伤疗效差组与正常对照组表达差异显著的一些mirna；(3)将抽提的rna逆转录为cdna，采用荧光定量pcr(taqman探针法)对初筛出的mirna再验证，挑选出稳定、特异表达的一组mirna。本发明使用的检测方法可以选自：rt-pcr方法、taqman低密度芯片(tlda)、real-timepcr方法中的一种或几种。例如，血清中mirna分子的检测方法包括以下步骤：(1)使用trizol试剂(invitrogen公司)提取血清总rna；(2)通过rna逆转录反应得到cdna；(3)根据人已知全部成熟体mirna设计引物进行pcr反应；(4)进行pcr产物的琼脂糖凝胶电泳；(5)eb染色后在紫外灯下观察结果。在所述步骤(5)之后还可以包括下列步骤：用taqman探针法检测并比较病人血清样本相对于正常血清中mirna的量的变化。本发明还提供了一种用于检测轻型脑外伤的mirna的探针组合，其包括下列mirna的taqman探针的组合：上述taqman探针组合可以进一步包括以下mirnataqman探针中的一种或多种：此外，本发明提供了上述探针组合在制备检测轻型脑外伤的试剂或工具中的用途。本发明还提供了一种用于检测轻型脑外伤的生物芯片，其包括下列taqman探针：上述生物芯片可以进一步包括以下探针中的一种或多种：在本发明的一个具体实施方案中，上述试剂盒包括taq酶、dntp、氯化镁、10×pcr缓冲液(不含mg2+)和包括正常血清中稳定存在且可检测到的全部mirnataqman探针(abi公司提供，专用于mirna荧光定量)。本发明所述轻型脑外伤包括各种由外伤所致的各种病理变化的脑外伤。具体而言，所述脑外伤可以是外伤性硬膜外血肿、硬膜下血肿、蛛网膜下腔出血、脑挫裂伤、弥漫性轴索损伤。轻型组入院时格拉斯哥评分(glasgowcomascale，gcs)>12分，重型组入院时≤8分。本发明所述的mirna组合及其对应的探针组合，以及含有所述探针组合的试剂盒可应用于轻型脑外伤的检测之中。本发明的有益效果：首先，血清相对其它组织较易获得，较ct或mri节约成本且耗时短，方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦；其次，血清中的mirna反映的是机体整体的病理、生理情况，其检测结果具有精确而详细的指导意义；第三，血清mirna检测能在分子水平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态，并为轻型脑外伤的治疗提供了潜在靶点。第四，本发明的试剂盒所包含的taqman探针同样是基于tlda、定量pcr技术筛选出的在轻型脑外伤与正常状态下表达差异显著的一组血清mirnataqman探针，这样可以增加检测的灵敏度和特异性，提高检测水平。综上所述，本发明提供的特异的mirna组合作为诊断轻型脑外伤的中间结果，有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行轻型脑外伤的早期诊断。检测血清中的mirna简单易行且效果优越。基于此制备的用于检测血清mirna的生物芯片和试剂盒投入实践使用，仅仅需要病人的血清通过最精简的taqman探针库来检测血清mirna水平能拓展轻型脑外伤的检测指标，提高检测的灵敏度，丰富检测脑外伤的手段，这些血清mirna有望成为早期诊断轻型脑外伤的重要标志分子，具有极重要的临床应用潜力和价值。附图说明图1为本发明的主要流程图。图2-8为筛选出的7种mirna(a-g)在轻型脑外伤与正常对照组中的roc曲线分析。轻型脑外伤67例，正常对照者66例。图9-15为筛选出的7种mirna(a-g)在脑外伤与正常对照组中的roc曲线分析。脑外伤132例(轻型67例，重型65例)，正常对照者66例。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1：脑外伤的特异mirna表达谱初筛(1)分别收集重型疗效差组、重型疗效好组以及正常者血清标本15例、15例和15例，三组标本分别混合；(2)分别提取三组混合血清rna，具体方案为：利用trizol试剂(invitrogen公司)提取总rna，得到的上清液使用酚氯仿三步法进一步去除蛋白等杂质提纯rna；(3)对三组混合血清总rna进行taqman低密度芯片分析(tlda)。具体方案为：tlda的实质是384孔荧光定量pcr技术，每个孔中加入特定基因定量检测的pcr扩增引物、荧光探针，可同时检测一个样本中384个基因的表达情况，由于每个芯片卡设有8个加样孔，因此每个芯片也可用于引物和探针的特异性，检测到的信号强度与dna分子数成正比，所得结果灵敏度比普通芯片高，并且实验条件易于优化，特别适合mirna的检测。将3μl总rna加入反应管中，放入pcr仪中设定程序进行逆转录反应。将所得的cdna置于冰上，将所得cdna进行预扩增。预扩增后加入0.1mtris-edta缓冲液(ph＝8.0)，然后进行tlda上样，最后上机反应。若mirna在三组中的ct值均小于30，同时与正常血清的tlda结果相比，转归好组与转归差组mirna均升高，且转归差组mirna含量是正常组的5倍以上时视为显著变化，否则视为不变化。结果发现在754种mirna中，共有12种在患者血清中显著升高。(详见表1)表1tlda初筛出的在重型脑外伤血清中表达上调的mirna实施例2：血清中mirna的实时荧光定量pcr实验(taqman探针法)采用定量pcr方法对批量标本逐个验证，从tlda方法初筛出的mirna中筛选出表达差异显著mirna。首先将提取的血清总rna反转录成cdna。针对每一种mirna,设计一个含相同茎环结构的基因特异性反向引物，利用mirna特异性反向引物进行逆转录，得到含共同茎环结构但属于特定mirna的cdna(abi公司产品)。仪器使用的是abiprism7300荧光定量pcr仪。由于常用的血清内源性参考基因的不稳定性，现在一些研究发现外源性参考基因能很好地控制rna的提取以及纯化过程中存在的差异，我们探索发现在rna提取过程中加入外源性植物mirnamir2911(5’-ggccgggggacgggcuggga-3’，seqidno.8)可以很好的控制样本提取纯化过程中的差异。因此血清中mirna的含量采用相对定量的方法进行计算。用样本中待测mirna的ct值减去相应样本中参考基因ct值得到△ct值。每种待测mirna相对于参考基因的含量用2-δct表示。实施例3：定量pcr方法对初筛出的血清mirna复筛用taqman定量pcr方法对一组受试者标本进行逐个检测，从tlda初筛出的12种mirna中筛选出重型脑外伤疗效差组与对照组之间表达差异显著的mirna(具体步骤参见实施例2)。该组重型脑外伤患者24例，轻型脑外伤患者24例，以在军区南京总医院常规体检正常者24例作对照(病人详细临床信息见表2)。结果发现，初筛出的12种mirna中有7种mirna在患者组中表达量显著高于对照组(含量表示方法为均值±标准差；轻型组变化倍数为2.97～9.08倍，p<0.0001)，这7种mirna是mir-103a、mir-219a、mir-422a、mir-520d、mir-302d、mir-518f和mir-627(见表3)。表2受试者的临床信息表3定量pcr方法复筛出的mirna实施例4：定量pcr方法对复筛出的血清mirna的临床验证将复筛出的7种mirna进一步用定量pcr方法在大批量临床标本中进行验证，筛选出稳定的、表达差异显著的mirna。临床研究的受试者脑外伤患者132例，其中重型组65例，轻型组67例。以年龄、性别匹配的正常人66例作对照(两组的详细临床信息见表4)。验证结果证实，复筛出的7种mirna在大批量患者标本中表达量显著高于对照(含量表示方法为均值±标准差；是对照组的2.55～5.26倍，p<0.001)(结果见表5及图9－15)。表4受试者基本临床信息表5定量pcr方法对复筛出的mirna用大批量标本验证结果实施例5：筛选出的mirna临床价值评估将复筛组和验证组血清标本综合起来，根据每份标本血清mirna的表达量绘制roc曲线和计算曲线下面积(auc)评估筛选出的mirna对轻型脑外伤诊断的准确性(图2-8)。结果发现这7种mirna的auc在0.780～0.904之间(见表6)。进说明mirna组合对轻型脑外伤诊断的敏感性较高。表6筛选出的mirna的auc实施例6：用于检测血清mirna的试剂盒用于检测轻型脑外伤的血清mirna试剂盒的制作工艺和操作流程是基于tlda技术和定量pcr技术，将有下述taqman探针组合：seqidno：1～4或seqidno：1～4以及seqidno：5～7中一种或多种分别收集到pcr试剂盒(rt-pcr或real-timepcr)中制备特定taqman探针组合的轻型脑外伤检测试剂盒。所述试剂盒的具体组成(检测每种mirna)如下：所制备试剂盒的具体操作流程如下：(1)收集受试者的血清样本，提取rna后逆转录制备cdna样品；(2)按照上述配方加样，各种mirna分别测定，在测定时，使用各自mirna特定的taqman探针。(3)进行pcr反应，条件为95℃5min，95℃15s，60℃1min(60℃1min这一阶段包含了退火和延伸两个步骤，该程序是abi公司推荐的程序)，40个循环。该试剂盒包括本发明所提供的血清mirna探针，taq酶以及dntp等试剂。所述试剂盒的价值在于以特定的taqman探针组合检测血清mirna表达量，可提高轻型脑外伤检测的灵敏度、准确性，有助于该病的早期发现。因此该试剂盒投入实践使用可以把疾病的诊断和治疗推上一个新高度。参考文献：1.mcnairnd.traumaticbraininjury[j].thenursingclinicsofnorthamerica,1999,34(3):637-6592.anderssoneh,bjorklundr,emanuelsoni,etal.epidemiologyoftraumaticbraininjury:apopulationbasedstudyinwesternsweden[j].actaneurologicascandinavica,2003,107(4):256-2593.张小年,张皓.创伤性颅脑损伤国内研究进展[j].中国康复理论与实践,2008,14(2):101-1044.oliveirara,araujos,falcaoal,etal.glasgowoutcomescaleathospitaldischargeasaprognosticindexinpatientswithseveretraumaticbraininjury[j].arquivosdeneuro-psiquiatria,2012,70(8):604-6085.giacoppos,bramantip,barresim,etal.predictivebiomarkersofrecoveryintraumaticbraininjury[j].neurocriticalcare,2012,16(3):470-4776.papal,lewislm,falkjl,etal.elevatedlevelsofserumglialfibrillaryacidicproteinbreakdownproductsinmildandmoderatetraumaticbraininjuryareassociatedwithintracraniallesionsandneurosurgicalintervention[j].annalsofemergencymedicine,2012,59(6):471-4837.goyala,faillamd,niyonkuruc,etal.s100basaprognosticbiomarkerinoutcomepredictionforpatientswithseveretraumaticbraininjury[j].journalofneurotrauma,2013,30(11):946-9578.mitchellps,parkinrk,krohem,etal.circulatingmicrornasasstableblood-basedmarkersforcancerdetection[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2008,105(30):10513-105189.chenx,bay,mal,etal.characterizationofmicrornasinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases[j].cellresearch,2008,18(10):997-100610.jonesci,zabolotskayamv,kingaj,etal.identificationofcirculatingmicrornasasdiagnosticbiomarkersforuseinmultiplemyeloma[j].britishjournalofcancer,2012,107(12):1987-199611.liul,sunt,liuz,etal.traumaticbraininjurydysregulatesmicrornastomodulatecellsignalinginrathippocampus[j].plosone,2014,9(8):e10394812.miaow,baoth,hanjh,etal.voluntaryexercisepriortotraumaticbraininjuryaltersmirnaexpressionintheinjuredmousecerebralcortex[j].brazilianjournalofmedicalandbiologicalresearch＝revistabrasileiradepesquisasmedicasebiologicas/sociedadebrasileiradebiofisica...[etal.],2015,48(5):433-43913.wangwx,visavadiyanp,pandyajd,etal.mitochondria-associatedmicrornasinrathippocampusfollowingtraumaticbraininjury[j].experimentalneurology,2015,265(84-9314.sabirzhanovb,stoicaba,zhaoz,etal.mir-711upregulationinducesneuronalcelldeathaftertraumaticbraininjury[j].celldeathanddifferentiation,2016,23(4):654-66815.balakathiresann,bhomiam,chandranr,etal.micrornalet-7iisapromisingserumbiomarkerforblast-inducedtraumaticbraininjury[j].journalofneurotrauma,2012,29(7):1379-138716.redelljb,moorean,wardnh,3rd,etal.humantraumaticbraininjuryaltersplasmamicrornalevels[j].journalofneurotrauma,2010,27(12):2147-215617.yangt,songj,bux,etal.elevatedserummir-93,mir-191,andmir-499arenoninvasivebiomarkersforthepresenceandprogressionoftraumaticbraininjury[j].journalofneurochemistry,2016,137(1):122-129。<110>中国人民解放军南京军区南京总医院<120>一种用于检测轻型脑外伤的微小核糖核酸组合及其应用<160>8<210>1<211>23<212>rna<213>人工序列<220><223>mir-103a的探针序列<400>1agcagcauuguacagggcuauga23<210>2<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>mir-219a的探针序列<400>2ugauuguccaaacgcaauucu21<210>3<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>mir-422a的探针序列<400>3acuggacuuagggucagaaggc22<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>mir-520d的探针序列<400>4aaagugcuucucuuugguggg21<210>5<211>23<212>rna<213>人工序列<220><223>mir-302d的核苷酸序列<400>5uaagugcuuccauguuugagugu23<210>6<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>mir-518f的探针序列<400>6gaaagcgcuucucuuuagagg21<210>7<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>mir-627的探针序列<400>7gugagucucuaagaaaagagga22<210>8<211>20<212>rna<213>人工序列<220><223>mir2911的序列<400>8ggccgggggacgggcuggga20当前第1页12当前第1页12