本发明涉及生物技术领域，尤其是一种c57bl/6j小鼠及由此来源的神经元肿瘤细胞系htt基因的crispr/cas9-grna打靶序列对、质粒及其应用。
背景技术：
亨廷顿病(huntington’sdisease，hd)是一种罕见的家族性常染色体显性遗传病，具有神经退行性。典型临床表现为不自主舞蹈样动作，进行性认知功能障碍或导致痴呆及精神症状，神经影像学检测表现为尾状核和大脑皮质萎缩。hd的发病机制可分为两种：一种是根据已知的病理生理学变化提出的(hd致病基因未发现之前)，包括兴奋性毒素损伤(excitotoxinlesions)、能量代谢受损(impairedenergymetabolism)和氧化应激(oxidativestress)等；另外一种是在发现了hd致病基因it15后，依据对基因及其表达产物huntingtin(htt)的研究提出的。hd的病因是由于亨廷顿基因htt(huntingtin)上的三核苷酸cag重复序列异常扩增，导致编码的htt构象变化而错误表达，产生神经毒性继而影响不同的分子通路，导致神经功能异常和退化。
目前，hd仍是一种无法治愈的神经系统变性疾病，临床上主要通过药物对症治疗以直接缓解患者病症，改善患者的生活质量，但是这些方法并不能延缓病程进展。基因治疗是对因治疗，直接在基因水平上消除病因，能有效延缓或治愈疾病。现有技术中，已经能通过基因检测确诊hd，但是其基因治疗尚处于临床前研究阶段，所以，进一步开发hd基因治疗的相关技术仍是一大热点与难点。
成簇规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，即crispr)最早被发现于细菌免疫系统。crispr包括两个部分：一个向导rna(grna)和一个非特异性crispr结合核酸内切酶(crispr-associatedendonumclease即cas9)。向导rna是一个短的合成rna，由一段结合cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列(靶位点)组成，其中靶向序列决定了用于修饰的基因靶标。因此我们只需改变grna上的靶向序列即可改变cas9的基因靶标。现有研究已经证明crispr/cas9可以高效进行细胞、动物、植物、酵母的靶向基因敲除和定点编辑。但是其在htt中的应用较为少见。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种htt的crispr/cas9-grna打靶序列对，该序列对在体外以及细胞内对htt具有剪切活性，为htt的编辑以及hd的基因治疗的研究提供进一步地依据。
本发明的第二目的在于，提供一种含有上述打靶序列对的打靶质粒，该打靶质粒将上述打靶序列对转染进细胞发挥基因编辑活性。
本发明的第三目的在提供上述打靶序列对以及打靶质粒在制作htt基因突变模型中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种htt的crispr/cas9-grna打靶序列对，其包括l序列和r序列，所述l序列的碱基序列如seqidno.1所示，所述r序列的碱基序列对如seqidno.2或seqidno.3所示。
本发明的一种htt的crispr/cas9-grna打靶质粒，其包括载体质粒和上述的htt的crispr/cas9-grna打靶序列对，所述htt的crispr/cas9-grna打靶序列对构建至所述载体质粒中。
本发明的一种htt的crispr/cas9-grna打靶质粒，所述载体质粒为适用于哺乳动物和/或哺乳动物细胞的载体质粒。
本发明的一种htt的crispr/cas9-grna打靶质粒，所述载体质粒具有荧光标记和抗性筛选标记。
本发明的一种htt的crispr/cas9-grna打靶质粒，所述载体质粒为vk001-06。
需要说明的是，本发明中使用的vk001-06和vk001-07质粒是已经商业化的哺乳动物/细胞-cas9(d10a)/grna表达载体，购自于北京唯尚立德生物科技有限公司，其中，vk001-06带有绿色荧光和抗性筛选标记，vk001-07带有红色荧光和抗性筛选标记。
上述htt的crispr/cas9-grna打靶序列对在制作htt基因突变模型中的应用。
上述的htt的crispr/cas9-grna打靶质粒在制作htt基因突变模型中的应用。
本发明的htt的crispr/cas9-grna打靶质粒在制作htt基因突变模型中的应用，所述htt基因突变模型为细胞模型。
本发明的htt的crispr/cas9-grna打靶质粒在制作htt基因突变模型中的应用，其包括如下步骤：
步骤一：htt的crispr/cas9-grna打靶质粒与脑靶向肽rdp共孵育得到靶向质粒；
步骤二：靶向质粒进行第一次细胞转染；
步骤三：第一次细胞转染后24h后，用靶向质粒补转染，补转染48h后终止转染。
本发明的htt的crispr/cas9-grna打靶质粒在制作htt基因突变模型中的应用，步骤一中，htt的crispr/cas9-grna打靶质粒与脑靶向肽rdp的质量比为1:6，室温共孵育15min。
其中，脑靶向肽rdp由授权公告号为cn102174110b的中国专利公开，其氨基酸序列为：mgksvrtwneiipskgclrvggrchphvngggrrrrrrrrr，其由狂犬病毒糖蛋白第330-357位肽段(序列的下划线部分)的羧基端通过连接肽与九聚精氨酸连接而得，可以快速、特异地携带生物活性大分子穿越血脑屏障，实现脑靶向给药。本发明中借用其脑靶向作用提高打靶质粒对神经细胞的转染率。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明根据htt基因设计出一系列crispr/cas9-grna打靶序列，经过体外活性检测后，筛选出体外酶切活性合格的4条l序列(htt-l1、htt-l2、htt-l4、htt-l6)和2条r序列(htt-r2、htt-r6)，并用4条l序列和2条r序列两两组成l-r序列对，并将其构建到合适的载体构成打靶质粒，最终成功构建分别以vk001-06和vk001-07为载体质粒的六种打靶质粒，该六种打靶质粒在脑靶向肽rdp的辅助下转染细胞，进行细胞内活性检测，成功筛选出两种打靶质粒(htt2号：htt-l2@htt-r2；htt3号：htt-l2@htt-r6)，该两种打靶质粒对cath-α细胞的htt基因具有切割(编辑)活性，其中htt2号质粒转染细胞后其靶点dna长度比正常细胞(normal)减少约80bp，htt3号质粒转染细胞后其靶点dna长度比正常细胞(normal)减少约120bp。测序结果进一步证明此两种质粒对cath-α细胞的htt基因良好的切割活性，并且测定出htt2号的活性位点在172-258bp处，htt3号质粒的活性位点在172-282bp处。本发明的打靶序列和打靶质粒为制备htt基因突变模型、hd细胞模型、hd转基因动物(尤其是c57bl/6j)模型以及hd的基因治疗提供了可靠的基础，促进了hd的模型建造及基因治疗的发展；为hd治疗药物，治疗方法的筛选奠定了实验基础。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是本发明实施例1中搭桥pcr的过程示意图；
图2是本发明实施例1中第一次体外酶切效率的凝胶电泳分析图，其中，a为l1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，b为r1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图；
图3是本发明实施例1中第二次体外酶切效率的凝胶电泳分析图，其中，a为l1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，b为r1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图；
图4是本发明实施例2中构建的打靶质粒的线性图谱，其中，a为以vk001-06为载体构建的打靶质粒的线性图谱，b为以vk001-07为载体构建的打靶质粒的线性图谱；
图5是本发明实施例3中打靶质粒的细胞内酶切活性的凝胶电泳分析图，其中，a为htt2号打靶质粒的结果图，b为htt3号打靶质粒的结果图；
图6是本发明实施例3中htt2号打靶质粒的细胞内酶切活性的dna测序图；
图7是本发明实施例3中htt3号打靶质粒的细胞内酶切活性的dna测序图.
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
本实施例提供htt的crispr/cas9-grna打靶序列(以下简称grna)的体外活性测定。其中，发明人设计了如下多个打靶序列：
htt-l1：ccctggaaaagctgatgaagg
htt-l2：aagccgtcatggcaaccctgg
htt-l3：tcgggcaggaagccgtcatgg
htt-l4：gggtctgtcccatcgggcagg
htt-l5：ttcagggtctgtcccatcggg
htt-l6：gtaggctccaagtcttcaggg
htt-r1：gggttgaggcggaggcggcgg
htt-r2：agggggttgaggcggaggcgg
htt-r3：ctgagggggttgaggcggagg
htt-r4：cggctgagggggttgaggcgg
htt-r5：cggcggctgagggggttgagg
htt-r6：ccctgaggcggcggctgaggg
上述序列中，每个序列的最后三位“ngg(n为a/t/c/g中的任意碱基)”为pam序列。
1.grna的体外转录
使用t7-grna-fpg和grna-rp引物对(引物对序列如表1所示)，以标准grna片段为模板进行聚合酶链式反应(pcr)，pcr反应体系如表2所示，pcr反应程序如表3所示。反应完成后，采用1.3％琼脂糖凝胶电泳检测pcr反应结果，然后采用ep101-01纯化柱(北京全式金生物技术(transgenbiotech)有限公司)，根据其说明书提供的方法纯化pcr产物，然后测定浓度后保存备用。
同时，准备标准品的pcr产物。标准品为vk007-10-vk007-22试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司)中的grna1(g1)和标准grna2(g2)，其中，grna1(g1)引物对分别为试剂盒中提供的g1-fp和本发明提供的grna-rp，标准grna2(g2)引物对分别为试剂盒提供的g2-fp和本发明提供的grna-rp，以标准grna片段为模板做pcr，pcr反应体系参考表2所示的pcr反应体系。反应完成后，采用ep101-01纯化柱(北京全式金生物技术(transgenbiotech)有限公司)，根据其说明书提供的方法纯化pcr产物(注意使用depch2o洗脱dna)，然后测定浓度后保存备用。
表1引物对序列
表2pcr反应体系
表3pcr反应程序
2.crispr/cas9-grna体外酶切反应
首先，将grna打靶序列(包括pam序列)通过搭桥pcr的方式构建到pcr产物中。如图1所示。图1中，f1和r4为引物对，g分别为配对的grna打靶序列及其反义链。搭桥pcr产物的序列为：nnnnnnnnn(270bp)mmmmmmmmmmm(grna靶位点位置，含有pam序列)nnnnnnnnnnn(450bp)。酶切之前搭桥pcr产物片段大小为740bp，酶切之后目的条带大小应分别为280bp+460bp左右。
然后，按照表4所示的体系顺次加样，根据vk007-10-vk007-22试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司)说明书提供的方法进行酶切反应，标准grna1(g1)和标准grna2(g2)为阳性对照，其中grna1不含有pam序列，具有不完全的cas9蛋白酶活性，grna2具有pam序列，具有完全的cas9蛋白酶活性。
表4体外酶切反应体系
反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。实验重复两次，两次实验结果分别如图2和图3所示，图2为第一次实验结果图，图3为第二次实验结果图。图2和图3中，a为l1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，b为r1-6号打靶序列的体外酶切效率凝胶电泳分析图，nc-1和nc-2为阴性对照，标准1和标准2分别为标准grna1(g1)和标准grna2，l1-6和r1-6为相应的grna经搭桥pcr后的产物。
标准grna1(g1)和标准grna2(g2)经由ssaluciferase进行活性检测，二者的ssa活性分别为：
标准grna1(g1)＝3，标准grna2(g2)＝10。
据此，本发明对样品grna的酶切活性采用如下标准：
若样品grna的酶切效率<标准grna1(g1)，表明样品grna靶点活性比较差，标记为活性不合格；
若标准grna1(g1)≤样品grna的酶切效率≤40％-50％，标记为活性合格；
若标准40％-50％≤样品grna的酶切效率≤grna2(g2)，标记为活性良好；
若样品grna的酶切效率≥标准grna2(g2)，标记为活性高。
样品grna的酶切效率由酶切条带的灰度换算而来。具体地，若nc-1和nc-2均只在750kb左右出现条带，则表明实验可信，然后以其为阴性对照，即酶切效率为零，以标准grna1在750kb条带的灰度值所代表的酶切效率为30％，grna2在750kb条带的灰度值所代表的酶切效率为100％，换算l1-6和r1-6的酶切效率。两次实验结果经换算，得到的grna的体外酶切效率分别如表5和表6所示。
表5第一次实验测得的grna体外酶切效率
表6第一次实验测得的grna体外酶切效率
由表5以及表6可知，两次实验结果基本一致，其实验数据可信度高。其中，htt-l1、htt-l2、htt-l4、htt-l6、htt-r2、htt-r6等六个序列经两次实验测定的活性差异小，并且与标准品对照，其体外酶切活性合格。
实施例2
本实施例提供htt的crispr/cas9-grna打靶质粒及其构建方法，该打靶质粒由一对打靶序列对构建到载体质粒而得到。该打靶序列对由l序列和r序列构成，其中，l序列选自实施例1中的htt-l1、htt-l2、htt-l4、htt-l6中的任一序列；r序列为实施例1中的htt-r2或htt-r6。载体质粒为适用于哺乳动物和/或哺乳动物细胞的载体质粒，优选地，载体质粒还具有荧光标记和抗性基因。
本实施例中采用vk001-06和vk001-07质粒，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，并采用该公司相应的crispr/cas9快速构建试剂盒catvk001-06/07构建打靶质粒。以vk001-06和vk001-07为载体构建的打靶质粒的线性图谱分别如图4所示，图4中，a为以vk001-06为载体构建的打靶质粒的线性图谱，b为以vk001-07为载体构建的打靶质粒的线性图谱。本实施例中最终构建成功6个打靶质粒，分别标记为htt1-6号。
其中，htt1-3号以vk001-06为载体质粒，根据crispr/cas9快速构建试剂盒catvk001-06说明书提供的方法构建而成：
htt1号：htt-l1@htt-r6
htt2号：htt-l2@htt-r2
htt3号：htt-l2@htt-r6。
htt4-6号以vk001-07为载体质粒，根据crispr/cas9快速构建试剂盒catvk001-07说明书提供的方法构建而成：
htt4号htt-l4@htt-r2
htt5号htt-l6@htt-r2
htt6号htt-l6@htt-r6。
实施例3
本实施例提供实施例2中构建的打靶质粒的活性检测，为本发明的打靶序列对以及打靶质粒的应用提供实验依据。
1.打靶质粒的提取
取htt1号，htt2号，htt3号，htt4号，htt5号，htt6号菌种，分别在含有amp+(80μg/ml)的lb筛选平板培养基上，37℃下划线培养24h。分别挑出单菌落，接种于含有amp+(80μg/ml)的lb液体培养基3ml，恒温空气摇床37℃，培养16h后，按照sanprep无内毒素质粒dna小量提取试剂盒(sangonbiotechb518161)说明书提取htt1号，htt2号，htt3号，htt4号，htt5号，htt6号的无内毒素质粒。微量核酸定量仪测定质粒的浓度，保存于-20℃。
2.细胞的复苏、接种和质粒转染及dna提取
从液氮罐取出冻存的cath-α细胞，快速37℃水浴溶解，1000g、离心5min，去除冻存培养基、取1mldmem完全培养基将细胞轻轻吹打混匀、接种于25cm2培养瓶中、37℃5％co2培养箱培养，待细胞满度>90％、1mltrypsin-edtasolution孵育30sec、加入5mldmem完全培养基、轻轻吹打细胞使其分离，分别取2.5*104个细胞接种到7个90cm2平皿，37℃5％co2培养箱培养12h后，取3ughtt1-htt6质粒分别按照rdp(μg):质粒(μg)＝6:1的比例复合得到靶向质粒然后转染细胞。靶向质粒在需室下温孵育10-15min。并在转染24h后进行补转染一次，补转染48h后终止转染，更换新鲜培养基继续培养12h后，按照细胞基因组提取试剂盒(dp304，天根生化科技有限公司)分别提取其dna备用。
3.基因组测序鉴定
将提取得到的dna进行pcr反应，其中，扩增长度为379bp，引物对序列和pcr程序分别如表7和表8所示。
表7引物对序列
表8pcr反应程序
pcr反应结束后，将pcr产物进行凝胶回收并进行t载体克隆，然后进行单菌落pcr并进行结果测序。
凝胶电泳结果如图5所示，其中a为htt2号的结果图，b为htt3号的结果图。由a可知，htt2号质粒转染细胞后其靶点dna长度比正常细胞(normal)减少约80bp。由b可知，htt3号质粒转染细胞后其靶点dna长度比正常细胞(normal)减少约120bp。
dna测序结果如图6和图7所示，其中图6为htt2号的结果图，图7为htt3号的结果图。由图6可知，htt2号质粒的切割位点分别为：htt-l2在82-102bp处；htt-r2在195-215bp处。从图6中可以看出，与正常细胞(normal)dna测序结果对比，所有的单克隆测序结果显示在172-258bp处出现碱基丢失，而此区间正是htt2号质粒上游靶点(htt-l2)和下游靶点(htt-r2)区域，且在171bp之前和282bp之后的所有碱基均与normal相同。说明htt2号质粒在cath-α细胞中的正确靶点敲除了大约87bp。说明htt2号质粒对cath-α细胞有有效的胞内dna编辑活性。由图7可知，htt3号质粒的切割位点分别为：htt-l2在82-102bp处；htt-r6在212-232bp处。从图7中可以看出，与正常细胞(normal)dna测序结果对比，所有的单克隆测序结果显示在172-282bp处出现碱基丢失，而此区间正是htt3号质粒上游靶点(htt-l2)和下游靶点(htt-r6)区域，且在171bp之前和282bp之后的所有碱基均与normal相同。说明htt2号质粒在cath-α细胞中的正确靶点敲除了大约111bp。说明htt3号质粒对cath-α细胞有有效的胞内dna编辑活性。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
sequencelisting
<110>西南大学
<120>htt的crispr/cas9-grna打靶序列对、质粒及其应用
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
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<212>dna
<213>人工序列
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