本发明涉及天然药物及药物化学领域，具体涉及延命草素型二萜的14-oh拼合氮芥衍生物。具体涉及这些在延命草素型二萜的14-oh拼合dna烷化剂氮芥类化合物的衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
1958年，takshashi等首次从蓝萼香茶菜(rabdosiajaponica)中得到enmein，1966年natsume等用x射线衍射法确定了enmein的立体结构，从那时起，一系列的延命草素型二萜类化合物被分离出来。延命草素(enmein)是从唇形科香茶菜属(rabdosia)植物中分离出的一种贝壳杉烷二萜类(ent-kauranediterpenoid)天然有机化合物，其具有抗细胞增殖、抑制癌细胞dna、rna和蛋白质的合成、诱导细胞调亡、抗突变以及β-受体阻断等作用。30年来随着对延命草素型二萜研究的深入，国内外学者发现它们对食管癌、胃癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌和白血病均具有一定治疗作用，其药理活性研究倍受关注。
氮芥类药物，也称为dna烷化剂，属于细胞毒类药物，其作用机制是在体内能形成缺电子的高度活泼中间体或其他具有活泼的亲电性基团的化合物，进而与生物大分子发生共价不可逆结合，使dna分子丧失活性或发生断裂。这类药物在临床上被广泛使用，但它的毒副作用比较大，对细胞作用缺乏特异性，而且随着近年来肿瘤耐药的发生，治疗效果并不理想，因此，对氮芥类药物进行化学修饰，改善其疗效有着很重要的价值。
本发明以延命草素型二萜为先导化合物，利用拼合原理，选择活性较好的芳香氮芥化合物，将其通过连接基团连接到其分子结构的14-oh上，设计并合成了通式为i的延命草素型二萜拼合氮芥类衍生物。
技术实现要素：
发明要解决的技术问题是寻找抗肿瘤活性好、具有一定选择性的延命草素型二萜拼合氮芥衍生物，并进一步提供一种包含该衍生物的药物组合物，所述的延命草素型二萜拼合氮芥衍生物或其组合物具有抗肿瘤作用。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供通式i或ⅱ所示的延命草素型二萜拼合氮芥衍生物及其药学上可接受的盐：
其中，n为0-12的整数。
优选地，n为0-6的整数。
更优选地，n为0或3。
本发明通式i或ⅱ的衍生物可用下列方法制备得到：
冬凌草甲素1在水中与高碘酸钠反应，得延命草素型衍生物2，再加入丙酮中，与琼斯试剂反应，得到氧化延命草素型衍生物3。
延命草素型衍生物2或氧化延命草素型衍生物3分别与不同侧链长度的芳香氮芥4或5在edci/dmap条件下室温反应得到目标化合物6-9。
本发明还提供了一种药物组合物，包含通式i或ⅱ所示的延命草素型二萜拼合氮芥衍生物及其药学上可接受的盐。
本发明所述的通式i或ⅱ所示的延命草素型二萜拼合氮芥衍生物及其药学上可接受的盐或其药物组合物可以与药学上可接受的载体制备临床上可接受的制剂，所述的制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂等。
本发明的延命草素型二萜拼合氮芥衍生物，是以延命草素型母核为先导化合物，利用拼合原理，选择活性较好的氮芥衍生物，将其通过连接基团连接到其分子结构的14-oh上，设计并合成了通式为i或ⅱ的延命草素型二萜拼合氮芥衍生物。拼合后的化合物及其组合物和制剂具有较好的药学活性。
具体实施方式
实施例1
取延命草素型母核2(55mg,0.15mmol)，溶于二氯甲烷(5ml)中，依次加入苯丁酸氮芥(92mg,0.30mmol)、edci(89mg,0.46mmol)、dmap(8mg,0.07mmol)，室温搅拌反应，tcl监测反应进程，24h后终止反应。将反应液倾入20ml冰水混合物中,二氯甲烷萃取(30ml×3)，饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，回收二氯甲烷，得到粗产物6，经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝200:1)，分离，得棕色油状，收率19％。hr-ms(esi,m+h)m/zcalcdforc34h43cl2no7:648.2458,found:648.2489.1hnmr(cdcl3,400mhz),δ(ppm):7.04,6.62(each2h,d,j＝8.4hz,ar-h),6.20(1h,s,14-ch),5.72(1h,s,6-ch),5.55(1h,s,17-ch2),5.33(1h,s,17-ch2),4.57(1h,dd,j＝11.5,5.8hz,1-ch),4.05,3.93(each1h,d,j＝9.4hz,20-ch2),3.69,3.61(each4h,t,j＝6.0hz,13',14'-ch2,15',16'-ch2),3.12(1h,d,j＝9.3hz,13-ch),2.52(2h,m,4'-ch2),2.27(2h,m,2'-ch2),1.84(2h,m,3'-ch2),1.02(3h,s,18-ch3),0.95(3h,s,19-ch3).13cnmr(cdcl3,100mhz),δ(ppm):197.55,171.81,166.42,147.62,144.10,129.79,129.68,120.56,112.79,112.66,101.40,75.65,75.07,73.36,53.93,53.80,53.25,49.59,47.89,40.52,40.40,40.29,36.97,33.97,33.93,33.84,32.87,31.39,29.99,26.40,26.21,23.12,22.93,19.83。
实施例2
参照实施例1的合成方法制备得化合物7。白色粉末，收率11％。hr-ms(esi,m+h)m/z:calcdforc31h37cl2no7:628.1947,found:628.1968.1hnmr(cdcl3,400mhz),δ(ppm):7.87,6.62(each2h,d,ja＝jb＝8.8hz,ar-h),6.24(1h,s,14-ch),5.85(1h,s,6-ch),5.56(1h,s,17-ch2),5.36(1h,s,17-ch2),4.57(1h,dd,j＝11.5,5.8hz,1-ch),4.01,4.11(each1h,d,j＝9.4hz,20-ch2),3.64,3.79(each4h,t,j＝7.0hz,8',9'-ch2,10',11'-ch2),3.32(1h,d,j＝9.4hz,13-ch),1.05(3h,s,18-ch3),0.98(3h,s,19-ch3).13cnmr(cdcl3,100mhz),δ(ppm):198.49,166.56,165.56,150.10,147.94,132.35(×2),120.13,117.64,110.91(×2),101.77,77.22,76.84,76.09,74.61,73.97,60.13,53.84,53.32,50.17,48.53,41.00,40.08,37.10,32.90,31.03,29.64,23.29,23.05,19.79。
实施例3
参照实施例1的合成方法制备得化合物8。黄色油状，产率25.6％。hr-ms(esi,m+h)m/z:calcdforc34h41cl2no7:646.2351,found:646.2333.1hnmr(cdcl3,400mhz),δ(ppm)8.12(1h,dd,j＝7.8,1.0hz,ar-h),7.60(1h,d,j＝7.8hz,ar-h),7.47(1h,m,ar-h),7.42(1h,d,j＝8.2hz,ar-h),7.29(1h,m,ar-h),7.22(1h,m,ar-h),7.19(1h,m,ar-h),7.16(1h,m,ar-h),7.07(2h,d,j＝8.5hz,ar-h),6.64(2h,d,j＝8.5hz,ar-h),5.99(1h,s,nch),3.99-4.90(6h,m,-ch2),3.69(4h,m,nch2ch2cl),3.61(4h,m,nch2ch2cl),2.45-3.18(8h,m,-ch2),2.40(3h,s,nch3),1.74-2.31(8h,m,-ch2)；13cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm)173.62,164.72,151.07,144.25,137.40,132.97,131.05,129.85(×2),129.04,128.67,125.84,124.23,124.19,123.16,122.72,119.71,119.09,113.22,112.53(×2),109.93,68.00,67.69,67.44,61.52,53.85(×2),40.72,40.53(×2),39.44,36.44,34.15,33.76,30.34,29.12,26.90,20.52.
实施例4
参照实施例1的合成方法制备得化合物9。白色粉末，收率20％。hr-ms(esi,m+h)m/z:calcdforc31h35cl2no7:626.1793,found:626.1851.1h(cdcl3,400mhz)δ7.83,6.61(each2h,d,j＝8.92hz,ar-h),6.27(1h,s,14-ch),5.83(1h,s,17-ch2),5.61(1h,s,17-ch2),4.62(1h,dd,j＝11.6,5.7hz,1-ch),4.37,4.09(each1h,d,j＝10.2hz,20-ch2),3.78,3.62(each4h,t,j＝7.0hz,8',9'-ch2,10',11'-ch2),3.33(1h,d,j＝9.5hz,13-ch),1.22(3h,s,18-ch3),1.07(3h,s,19-ch3).13cnmr(cdcl3,100mhz),δ(ppm):197.53,175.28,165.59,165.52,150.24,147.17,132.34(×2),121.22,117.28,110.93(×2),77.20,76.74,74.46,73.27,71.43,59.43,53.29,50.80,47.73,45.97,40.62,40.03,36.44,33.06,32.27,29.41,23.64,23.13,19.20。
药理试验
实验设备与试剂
仪器超净工作台(苏净集团安泰公司)
恒温培养箱(thermoelectroncorporation)
酶标仪(bio-rad公司)
倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)
试剂细胞培养基rpmi-1640、dmem(高糖)(gibco公司)
胎牛血清(杭州四季清有限公司)
cck-8(biosharp公司产品)
台盼蓝(solarbio公司产品)
dmso(sigma公司)
细胞株人肝癌细胞株bel-7402和hepg-2、人前列腺癌细胞
pc-3、人肝癌耐药细胞株bel-7402/5-fu、人早幼粒白
血病细胞hl-60、人正常肝细胞l-02
实验方法
细胞抑制活性实验方法
细胞在37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中常规培养。培养液为含10％热灭活胎牛血清，青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的rpmi1640细胞培养基。48h更换培养液，细胞贴壁后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。实验用细胞均处于对数生长期，台盼蓝拒染法表明细胞活力>95％。
取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，加入消化液(0.125％胰蛋白酶+0.01％edta)消化，计数2～4×104cell/ml，制成细胞悬液接种于96孔板上，100μl/孔，置恒温co2培养箱中培养24小时。换液，加入受试药物，100μl/孔，培养72小时。将cck-8加入96孔板中，50μl/孔，培养箱中孵育4小时。吸去上清液，加dmso，200μl/孔，平板摇床上震荡10分钟。受试物考察3个浓度(0.25μm，0.5μm，1μm)，用酶联免疫监测仪在波长为450nm处测定每孔的吸光度，分别计算各浓度下的细胞抑制率。
抑制率计算方法：
药敏孔相对od值＝药敏孔绝对od值﹣空白对照孔绝对od值
实验结果
表1实施例对4种人类癌细胞株和1种人类正常细胞抗增殖活性的ic50值(μm)
药理试验证明，本发明的目标衍生物具有更好的抗肿瘤细胞增殖活性，并且对肿瘤细胞和正常细胞具有一定的选择性，可以用于进一步制备抗肿瘤药物。