一种钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于荧光探针材料及其制备领域，特别涉及一种钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

钙离子作为细胞内中的一种重要的信息传递物质，在许多的生理功能中发挥着重要的作用，如肌肉的兴奋收缩、神经递质释放、物质代谢、神经冲动传导等。钙离子作为细胞内的第二信使具有重要的生物学功能，而钙离子的信使功能是通过细胞内游离的钙离子浓度的分布的变化来实现的。精确的测定细胞内游离钙离子浓度是现阶段医学及生物学研究的一项重要内容。而近年来发展起来的钙离子荧光探针测定细胞中游离钙离子浓度具有灵敏度高、反应速度快及细胞功能干扰小等优点，已经获得广泛应用。

锌离子作为生物体细胞内含量最丰富的过渡金属离子之一，它们在许多生理疾病过程，如金属酶的调控，基因的表达，神经信号传导，dna结合和识别和细胞凋亡等方面起着非常重要的作用。此外，锌离子也是作为一种主要的环境污染金属类离子，而且过量存在可能会导致土壤中微生物系统的破坏。同时，它也是农产品和食品中常见的污染物。因此，锌离子存在超标时，会导致环境污染，食物中锌离子污染，还有食物中锌离子过剩。锌对人体的免疫功能起着调节作用，能够维持人的正常生理机能，促进儿童的正常发育和溃疡的愈合。常用于营养不良、厌食、生长缓慢的儿童，还用于治疗皮疹、脱发、胃炎等。锌离子摄入过多时，会导致口渴、干咳、头疼、高热、寒战等。

目前检测钙离子的方法目前有很多：钙离子有机显色剂法、钙离子荧光指示剂法、钙离子荧光指示剂法、钙离子传感器法和核磁共振法。锌离子检测的主要的方法：原子吸收光谱法、中子活化分析法、原子发射光谱法、x射线荧光光谱法、溶出伏安法、双硫腙比色法、涂层压电传感器发和等离子体感应光谱法等。由于上述方法的劣势(专业性强，步骤复杂，耗时，仪器贵重)，荧光化学传感器离子检测拥有众多的优点，它有望取代传统的方法，如测试速度快，设备简单，“裸眼”可视检测，价格低廉，分子结构易于修饰优化，灵敏度高等优点。近年来有许多关于小分子荧光探针法检测汞离子的报道(sensorsandactuatorsb,2017,241,230-238)，但是由于重金属离子固有的荧光猝灭性质，使得发展高灵敏度的荧光探针具有一定的挑战性。罗丹明b类荧光染料是一种很好的生物荧光物质，具有良好的光物理性质，其吸收和发射都在长波处(>550nm)，荧光量子产率高，摩尔消光系数大，背景干扰小等优点，因此在发展荧光探针方面具有重要应用前景。

中国专利cn201410271217.6“一种络合锌离子的功能性活性染料及其制备方法与应用”，对锌离子具有较好的选择性，其它常用离子都无明显的干扰，中国专利cn201210405680.6“一种zn²⁺比率荧光探针化合物和制备方法及应用”的锌离子以2-(4’-氨基-2’-羟基苯基)苯并恶唑为原料，合成具有良好的水溶性，可作为zn²⁺比率荧光识别探针的化合物。中国专利cn102702084“一种单\双光子钙离子荧光探针化合物及制备与应用”，该荧光探针有着良好的水溶性，可广泛用于检测动植物、土壤、人体细胞或水体中的钙含量。上述探针虽对金属离子具有较好的选择性和灵敏性，但其只能实现单通道的检测，对单一的金属离子的检测，不能实现同时对zn²⁺和ca²⁺离子的检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针在不同激发光波长，对ca²⁺和zn²⁺的检测有很好的选择性，在环境检测方面具有较好的使用效果。

本发明的钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针，该探针分子，在不同溶剂体系中，有效实现对钙离子和锌离子有很好的选择性检测，在环境和生物检测方面具有较好的使用效果。

本发明的一种钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针，其结构式为：

本发明的一种钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针的制备方法，包括：

(1)将罗丹明b溶于溶剂中，滴加过量水合肼，78～80℃回流反应12～15h，旋转蒸发除去溶剂及未反应的水合肼，得到粗罗丹明b酰肼，在无水溶剂条件下重结晶，抽滤，干燥，得到罗丹明b酰肼；

(2)将对氨基苯甲酸甲酯溶于溶剂中，滴加过量水合肼，78～80℃回流反应2～5h，旋转蒸发除尽溶剂及未反应水合肼，得粗产物对氨基苯甲酰肼，然后进行重结晶，得到的产物溶于溶剂中，滴加过量的水杨醛，78～80℃回流4～6h，冷却，过滤，重结晶，干燥，得到水杨醛-4-氨基苯甲酰肼腙；

(3)将三聚氯氰溶于无水溶剂中，加入缚酸剂，在冰水浴(0-5℃)，氮气保护下，逐滴滴加步骤(1)中罗丹明b酰肼的thf溶液(约30-60min滴加完毕)，然后搅拌6～9h，旋转蒸发除去溶剂，使用tcl板进行跟踪反应，使用洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚进行柱层析分离，浓缩，得到浅粉红色的一缩产物rsh(4-((4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)-n'-(2-羟基亚苄基)苯甲酰肼)；

(4)将步骤(3)中的rsh溶于无水溶剂，加入缚酸剂，氮气保护下，逐滴滴加步骤(2)中水杨醛-4-氨基苯甲酰肼腙，在45～55℃回流反应10～12h，冷却，过滤，旋转蒸发除去溶剂，使用tcl板进行跟踪反应，使用洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚进行柱层析分离，浓缩，得到浅粉红色的rsht(4-((4-((3',6'-双(二乙氨基-3-氧代螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-2-基)氨基)-6-氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)-n'-(2-羟基亚苄基)苯甲酰肼；

(5)将步骤(4)中rsht溶于无水溶剂，然后加入缚酸剂，n2保护下逐滴滴加水合肼，75～80℃回流10～12h，冷却，过滤，旋转蒸发除去溶剂，纯化(使用tcl板进行跟踪反应，然后加入一定量的良溶剂使其溶解，然后滴加到剧烈搅拌的不良溶剂中使其沉淀出来，重复三次)，得到灰白色的粉末rsht-nh2(4-((4-((3',6'-双(二乙氨基)-3-氧代螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-2-基)氨基)-6-肼基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基)-n'-(2-羟基亚苄基)苯甲酰肼)，即钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针。

所述步骤(1)中稀盐酸的浓度为4.0～5.0wt％，调节体系ph至9～10。

所述步骤(1)和步骤(2)中溶剂均为无水溶剂，优选无水乙醇。

所述步骤(1)和步骤(2)中水合肼的规格为98～99wt％。

所述步骤(1)和步骤(2)中重结晶为用乙醇重结晶。

所述步骤(2)中水杨醛的质量百分比浓度为97～98％。

所述步骤(3)中的三聚氯氰的质量百分比浓度为98～99％。

所述步骤(3)中三聚氯氰、缚酸剂和荧光素酰肼的摩尔比为1～1.5：2～2.5：1～1.5。

所述步骤(3)中罗丹明b酰肼的thf溶液的质量浓度为3～4wt％。

所述步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中缚酸剂为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠或碳酸钾；溶剂为四氢呋喃、甲苯或1,4-二氧六环。

所述步骤(3)和(4)中的洗脱剂的体积比分别为1：4～1：8和1：2～1：4。

所述步骤(4)中rsh、缚酸剂和水杨醛-4-氨基苯甲酰肼腙的摩尔比为1～1.5∶2～2.5∶1～1.5。

所述步骤(5)rsht、缚酸剂和水合肼的摩尔比为1～1.5∶2～2.5∶1～1.5。

所述荧光探针应用于(能够实现)同时检测污水中的ca²⁺和zn²⁺。

本发明中荧光素类荧光探针涉及的制备路线如下：

本发明提供的上述的一种钙离子和锌离子罗丹明类荧光探针及其制备与应用，所述的罗丹明类的荧光探针，能够实现同时检测污水中的ca²⁺和zn²⁺。

本发明含有罗丹明b内酰胺基团和酰胺基团，酰胺基团中间含有碳氮双键和苯环上的酚羟基，其中的一些基团对锌离子和钙离子具有识别作用。其机理在于：由于c＝n双键的异构化，加入离子后，分子的刚性改变和共轭性改变对于锌在荧光增强的同时颜色红移，颜色改变有利于提高探针的灵敏性。内酰胺基团羰基o、c＝n及三聚氯氰基团中的c＝n均可提供孤对电子参与钙离子和锌离子的配位。配位后探针整体共轭性和刚性增强，有利于实现高灵敏度的荧光探针。

本发明所述的荧光探针rsht-nh2自身的荧光很弱，溶于dmf溶液后与钙离子或者锌离子混合后，产生强烈的荧光，在钙离子和锌离子存在的条件下，分别在370nm和380nm的紫外光激发下，分别产生的470nm和450nm处的荧光信号显著增强，通过记录荧光强度即可检测钙离子或锌离子的浓度。所述的荧光探针的荧光强度分别与钙离子或者锌离子浓度成良好的线性关系，定量检测钙离子或者锌离子浓度的线性范围分别为0.5～10μm和0.3～10μm，荧光探针分子rsht-nh2与zn²⁺、ca²⁺之间的络合常数分别为1.05×10⁵、2.19×10⁴。通过线性拟合得出rsht-nh2对两种金属离子的最低检测限分别为13.9nm和15.5nm；当荧光探针rsht-nh2溶于乙腈溶剂中，在钙离子存在的条件下，经过377nm紫外光激发，447nm处的荧光信号显著增强，通过记录荧光强度即可检测钙离子的浓度。所述的荧光探针的荧光强度与钙离子浓度成良好的线性关系，定量检测钙离子浓度的线性范围为0.01～10μm，通过线性拟合得出rsht-nh2在乙腈溶剂中的最低检出限为10.0nm，通过在不同溶剂条件下的选择性，能够定量检测溶液中锌离子和钙离子的浓度。

有益效果

(1)本发明的荧光探针对钙离子和锌离子有很好的选择性和灵敏度，在环境检测方面具有较好的使用效果；

(2)本发明的反应条件比较简单，设备要求简单易于操作，合成的荧光探针对铝离子和锌离子具有较好的选择性和灵敏度，在溶液中加入钙离子和锌离子前后颜色区别大，可进行现场实时定性及半定量的目视荧光法检测；

(3)本发明所设计的罗丹明类的荧光探针可实现双通道的检测，在不同的溶剂中在不同发射波长下对钙离子和锌离子进行检测。

附图说明

图1为实施例2中在dmf溶液中荧光探针加入锌离子(a)和钙离子(b)前后的紫外变化图谱；横坐标为紫外吸收波长(nm)，纵坐标为吸光度；

图2为实施例2中在dmf溶液中荧光探针加入锌离子(a)或者钙离子(b)前后的荧光变化图谱；横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度，图中插图锌离子(a)或者钙离子(b)与探针络合前后发生的溶液荧光变化；

图3为实施例2中在乙腈(ch3cn)溶液中荧光探针加入钙离子后的荧光变化图谱；横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度；

图4(a)为实施例2中在dmf溶液中荧光探针(浓度为10μm)对锌离子或者钙离子的荧光光谱响应图；横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度；图中插图为zn²⁺浓度增加与荧光强度的趋势图(激发波长在370nm)；图4(b)为在dmf溶液中荧光探针(浓度为10μm)对钙离子的荧光光谱响应图；横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度；图中插图为ca²⁺浓度增加与荧光强度的趋势图(激发波长在380nm)；

图5为实施例2中在乙腈溶液中荧光探针(浓度为10μm)对钙离子的荧光光谱响应图；横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度；图中插图为ca²⁺浓度增加与荧光强度的趋势图(激发波长在377nm)；

图6(a)和图6(b)为实施例2中荧光探针(浓度为10μm)在dmf溶液中对不同的金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；在图6中，横坐标为不同的金属离子，纵坐标为荧光强度；

图7为实施例2中荧光探针(浓度为10μm)在乙腈(ch3cn)溶液中对不同的金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；在图7中，横坐标为不同的金属离子，纵坐标为荧光强度；

图8为实施例2中dmf溶剂中荧光探针(浓度10μm)与锌离子(a)图或钙离子(b)图络合比的job-plot曲线；横坐标为c[zn²⁺]/c[zn²⁺+probe]和c[ca²⁺]/c[ca²⁺+probe]，纵坐标为荧光f-f0，其中f、f0分别是在470nm和450nm的荧光发射强度；

图9为实施例2中乙腈(ch3cn)溶剂中荧光探针(浓度10μm)与钙离子络合比的job-plot曲线；横坐标为c[ca²⁺]/c[ca²⁺+probe]，纵坐标为荧光强度，发射波长为446nm。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例的钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针，其结构式为：

其制备方法，步骤为：

步骤1：将罗丹明b溶解于无水乙醇中，滴加过量的水合肼(98wt％)，78℃加热回流反应5h，旋转蒸发除尽溶剂及未反应水合肼，得粗罗丹明b酰肼。粗产物溶于稀盐酸溶液(浓度为4.0～5.0wt％)，调节体系ph(9～10)至产物完全析出，抽滤，干燥得罗丹明b酰肼产物；

步骤2：将对氨基苯甲酸甲酯溶于无水乙醇中，滴加过量水合肼(98wt％)，78℃加热回流反应3h，旋转蒸发除尽溶剂及未反应水合肼，得粗产物对氨基苯甲酰肼，之后进行多次乙醇重结晶。然后产物溶于无水乙醇溶剂，滴加稍过量的水杨醛，加热回流6h，冷却体系，过滤，产物多次乙醇重结晶，干燥，得水杨醛-4-氨基苯甲酰肼腙；

步骤3：三聚氯氰溶于50ml四氢呋喃，加入缚酸剂碳酸钾(0.996g,7mmol)，冰水浴氮气保护下控制体系温度在0-5℃，逐滴的加入使用thf溶解的罗丹明b酰肼溶液(1.6g,3.5mmol)，30min滴加完毕，搅拌9h，过滤，旋转蒸发除尽溶剂，使用tcl板进行跟踪反应，使用洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚进行柱层析分离，浓缩，得到浅粉红色的一缩产物rsh；其中，洗脱剂的体积比为(v乙酸乙酯：v石油醚＝1：3)。¹hnmr(400mhz,dmso,298k,δ/ppm):1.16(t,12h,j＝7.0hz,nch2ch3),3.33(q,8h,j＝7.0hz,nch2ch3),6.31-6.29(m,4h,arh),6.66-6.63(m,2h,arh),7.20(d,1h,j＝8hz,arh),7.61-7.53(m,2h,arh),8.01(d,1h,j＝8.0hz,arh)。

步骤4：一缩产物溶于无水溶剂20ml四氢呋喃，然后加入缚酸剂(0.276g,2mmol)，n2保护下逐滴滴加水杨醛-4-氨基苯甲酰肼腙(0.3,1mmol)，控制温度50℃左右，回流12h，冷却，过滤，旋转蒸发，使用tcl板进行跟踪反应，使用洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚进行柱层析分离，浓缩，得到浅粉红色的二缩产物rsht；其中，所述洗脱剂的体积比为(v乙酸乙酯：v石油醚＝1：5)。¹hnmr(400mhz,dmso,298k,δ/ppm):1.23-1.07(m,12h,nch2ch3),4.28-2.24(m,8h,nch2ch3),7.02-6.99(m,6h,arh),7.43-7.38(m,4h,arh),6.97-6.95(m,4h,arh),7.72-7.68(m,4h,arh),9.01(s,1h),11.06(s,1h),11.16(s,1h)。

步骤5：二缩产物溶于无水溶剂20ml四氢呋喃，然后加入缚酸剂(0.276g,2mmol)，n2保护下逐滴滴加水合肼(0.07g,2mmol))，控制温度80℃左右，回流12h，冷却，过滤，旋转蒸发，使用tcl板进行跟踪反应，然后加入一定量的良溶剂使其溶解，然后滴加到剧烈搅拌的不良溶剂中使其沉淀出来，重复三次，得到灰白色的粉末，rsht-nh2。ftir(kbr):v＝3440cm^-1(nh2)；2920cm^-1(ch2)；1705cm^-1,1615cm^-1(c＝o)；1615cm^-1,1510cm^-1(ar-h)；1510cm^-1,1100cm^-1(c-n)；1405cm^-1(o-h)；802cm^-1(c-h).¹hnmr(400mhz,dmso,298k,δ/ppm):6.56(d,1h),6.75-6.95(s,4h),7.35(s,1h),7.39-7.45(m,1h),7.50-7.62(s,2h),7.70-7.75(m,4h),7.91-7.95(s,2h),8.90(s,1h),11.50(s,2h)。

实施例2

利用实施例1中的钙离子和锌离子双通道罗丹明类荧光探针进行测试：

如图1所示，在dmf溶液中探针分子rsht-nh2本身在360～400nm处没有紫外吸收峰，探针与锌离子络合之后，在370nm处出现新的紫外吸收峰(图1(a)所示)；在dmf溶液中探针分子rsht-nh2本身在360～400nm处没有紫外吸收峰，探针与钙离子络合之后，在380nm处出现新的紫外吸收峰。

在图2中可以发现，在dmf溶液中荧光探针与锌离子和钙离子络合后荧光激发波长分别为370nm、380nm，荧光发射波长分别为470nm、450nm，而且溶液的前后颜色发生了很大的变化(rsht-nh2-ca²⁺络合发生浅绿色的荧光，rsht-nh2-zn²⁺络合发生浅蓝色的荧光)，如图2中。

在图3中可以发现，在乙腈溶液中荧光探针与钙离子络合后荧光激发波长为377nm，荧光发射波长为448nm。

图4(a)为在dmf溶液中荧光探针(浓度为10μm)对锌离子或者钙离子的荧光光谱响应图。在图4(a)中，横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度；图中插图为zn²⁺浓度增加与荧光强度的趋势图(激发波长在370nm)。图4(b)为在dmf溶液中荧光探针(浓度为10μm)对钙离子的荧光光谱响应图。在图4(b)中，横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度；图中插图为ca²⁺浓度增加与荧光强度的趋势图(激发波长在380nm)。

如图5所示，在乙腈溶剂中做ca²⁺对rsht-nh2溶液的荧光滴定实验，实验方法同图4的实验步骤(激发波长在377nm，发射波长在446nm)。

图6(a)图和(b)图分别为做zn²⁺和ca²⁺对rsht-nh2溶液的荧光干扰实验，对常见金属离子cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi³⁺、mn²⁺、ni²⁺、na⁺进行了荧光滴定。将荧光探针rsht-nh2溶于在dmf溶剂中，配成10μm荧光探针溶液，分别将cdcl2、al2(so4)3、cuso4、cocl2、sncl2、fecl3、zn(no3)2、bacl2、mgso4、pb(no3)2、bi(no3)3、mn(no3)2、ni(no3)2、nacl溶于dmf溶剂中，配成100μm的cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi³⁺、mn²⁺、ni²⁺、na⁺金属离子溶液，进行选择干扰性检测，具体步骤为：分别将1ml10μm荧光探针溶液加入1ml10μmzn²⁺和ca²⁺的溶液，最后在加入1ml100μm的cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、fe³⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi³⁺、mn²⁺、ni²⁺、na⁺离子溶液混合，在激发波长为370nm(或者380nm)的条件下，检测发射波长为470nm(或者450nm)的荧光强度；将1ml10μm荧光探针溶液与0.5ml10μm二价锌离子或者钙离子溶液混合后，再分别与0.5ml100μm的金属离子cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、fe³⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi³⁺、mn²⁺、ni²⁺、na⁺离子溶液混合，在激发波长370nm(或者380nm)的条件下，检测发射波长为470nm(或者450nm)的荧光强度；图6中实心柱为荧光探针rsht-nh2的浓度为10^-5m，分别对金属离子(10^-4m)：cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、fe³⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi³⁺、mn²⁺、ni²⁺、na⁺进行了测试其他金属离子加入的荧光强度，空心柱为在rsht-nh2-zn²⁺和rsht-nh2-ca²⁺(10^-5m)体系中分别加入金属离子(10^-5m)cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、fe³⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi³⁺、mn²⁺、ni²⁺、na⁺进行了测试荧光干扰的荧光强度，实心柱为rsht-nh2体系分别加入金属离子(10^-4m)cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、fe³⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi³⁺、mn²⁺、ni²⁺、na⁺进行了测试荧光干扰的荧光强度。在干扰测试中，其它离子的加入对rsht-nh2-zn²⁺和rsht-nh2-ca²⁺络合体系的荧光强度的影响也不是很大，说明rsht-nh2与zn²⁺和ca²⁺能够形成稳定的络合物，除磁性离子co²⁺、fe³⁺、ni²⁺有一定的干扰；

图7在乙腈溶剂中探针分子rsht-nh2(10μm)在存在其他离子(离子浓度为(10^-4m))时，除ca²⁺外，在rsht-nh2溶液中加入其它金属离子后荧光强度无明显变化,实验方法同图6的实验步骤。在干扰测试中，在乙腈溶剂中其它离子的加入对rsht-nh2-ca²⁺络合体系的荧光强度的影响也不是很大，说明rsht-nh2与ca²⁺能够形成稳定的络合物，除mg²⁺离子和带磁性的金属离子fe³⁺和co²⁺离子具有一定的干扰；

如图8所示，在dmf溶剂中固定荧光探针和zn²⁺或ca²⁺的浓度总和为50μm，通过改变二者的浓度比(荧光探针和锌离子和钙离子物质量的比依次为10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10)分别得到470nm和450nm处的荧光强度与该浓度下荧光探针自身荧光强度的差值，对离子占总浓度的比例作图8。通过此图可知当zn²⁺或ca²⁺所占比例为0.5时纵坐标可以达到最高值，可以确定荧光探针与zn²⁺或ca²⁺之间主要以1:1形式结合形成稳定的复合物。

如图9所示，在乙腈溶剂中固定荧光探针ca²⁺的浓度总和为50μm，通过改变二者的浓度比(荧光探针和锌离子和钙离子物质量的比依次为10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10)得到446nm处的荧光强度与该浓度下荧光探针自身荧光强度的差值，对离子占总浓度的比例作图9。通过此图可知当ca²⁺所占比例为0.5时纵坐标可以达到最高值，可以确定荧光探针与ca²⁺之间主要以1:1形式结合形成稳定的复合物。