本发明涉及生物医药技术领域，是一种高纯度大蒜辣素及其制备方法。
背景技术：
大蒜（alliumsativuml.）及其制剂已列入美国、欧盟药典，大蒜辣素（allicin，二丙烯基硫代亚磺酸酯，cas:539-86-6）是其主要有效成分，具有广泛的生物活性。当大蒜组织被破碎，其中的非蛋白质氨基酸-蒜氨酸（alliin，s-烯丙基半胱氨酸亚砜，cas:556-27-4）被蒜酶催化随即反应生成大蒜辣素。作为硫代亚磺酸酯，大蒜辣素执行其生物活性的基础主要是以活性含硫化合物（rss）的形式参与谷胱甘肽和具有生物学功能蛋白质的氧化还原反应。其不仅可以剂量依赖性的抑制杀灭细菌、真菌（效果堪比广谱抗真菌药氟康唑）和病毒，包括抗药性菌株抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa），还可以抑制哺乳动物细胞（包括癌细胞）的增殖甚至诱导其死亡；大蒜辣素还可以通过调控多种靶标蛋白活性或代谢产生内源性递质等方式来抑制：胆固醇合成、血小板凝聚、血管平滑肌细胞的增殖和转移及炎症反应，对当今死亡率最高的心脑血管疾病表现出显著的治疗及保健作用。
目前主要有以下三种方式来获得大蒜辣素：化学合成法、体外生物合成法、天然提取分离纯化法。这三种方法均可获得一定量的大蒜辣素，但普遍存在操作复杂、毒性物质残留、重现性差等问题，关键是纯度及产量极低。另外，大蒜辣素化学性质活跃，极易被氧化降解，且对热敏感，因此目前国内外尚无高纯度大蒜辣素产品推出。
技术实现要素：
本发明提供了一种高纯度大蒜辣素及其制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有大蒜辣素制备方法中，存在的工艺操作复杂、作为天然药物毒副作用大、生物体内毒性物质残留以及大蒜辣素稳定性和纯度不高的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种高纯度大蒜辣素，按照下述步骤得到：第一步，蒜氨酸和蒜酶按质量比为1:0.1至2的比例，在温度为0℃至10℃、与空气隔绝的环境下，体外生物合成1mg/ml至10mg/ml的大蒜辣素水溶液；第二步，按大蒜辣素水溶液与水溶性有机溶剂的体积比为1:0.5至2的比例，向大蒜辣素水溶液中加入水溶性有机溶剂，在温度为15℃至40℃条件下，孵育5min至20min后，进行高速离心5min至30min，得到大蒜辣素水溶性有机溶剂层，将大蒜辣素水溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机溶液；第三步，向大蒜辣素有机溶液中加入脂溶性有机溶剂进行萃取，收集大蒜辣素脂溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机浓缩液；第四步，对大蒜辣素有机浓缩液进行分子蒸馏、收集，即得到高纯度大蒜辣素。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述蒜氨酸纯度≥50%，蒜酶活力≥1000u/g。
上述水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇中的一种；或/和，脂溶性有机溶剂为丙酮、乙醚中的一种。
上述减压、旋蒸、浓缩的条件是温度为10℃至50℃、压力为0bar至0.05bar、转速为50rpm至150rpm；或/和，高速离心时的温度为4℃至15℃，离心转速为3000rpm至12000rpm。
上述分子蒸馏的条件：进样速度为0.5ml/min至5ml/min，刮板速度为5rpm/min至50rpm/min，外接循环温度为10℃至-30℃，真空度为1torr至100torr。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种高纯度大蒜辣素的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，蒜氨酸和蒜酶按质量比为1:0.1至2的比例，在温度为0℃至10℃、与空气隔绝的环境下，体外生物合成1mg/ml至10mg/ml的大蒜辣素水溶液；第二步，按大蒜辣素水溶液与水溶性有机溶剂的体积比为1:0.5至2的比例，向大蒜辣素水溶液中加入水溶性有机溶剂，在温度为15℃至40℃条件下，孵育5min至20min后，进行高速离心5min至30min，得到大蒜辣素水溶性有机溶剂层，将大蒜辣素水溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机溶液；第三步，向大蒜辣素有机溶液中加入脂溶性有机溶剂进行萃取，收集大蒜辣素脂溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机浓缩液；第四步，对大蒜辣素有机浓缩液进行分子蒸馏、收集，即得到高纯度大蒜辣素。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述蒜氨酸纯度≥50%，蒜酶活力≥1000u/g。
上述水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇中的一种；或/和，脂溶性有机溶剂为丙酮、乙醚中的一种。
上述减压、旋蒸、浓缩的条件是温度为10℃至50℃、压力为0bar至0.05bar、转速为50rpm至150rpm；或/和，高速离心时的温度为4℃至15℃，离心转速为3000rpm至12000rpm。
上述分子蒸馏的条件：进样速度为0.5ml/min至5ml/min，刮板速度为5rpm/min至50rpm/min，外接循环温度为10℃至-30℃，真空度为1torr至100torr。
本发明制备工艺简单，原料由天然提取得到，所得的高纯度大蒜辣素作为天然药物，其毒副作用小，在生物体内无残留，得到高纯度大蒜辣素的纯度≥95.0%，其稳定性和纯度有很大的提高，实现了产品的安全性、高效性以及质量的可控性。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该高纯度大蒜辣素，按照下述步骤得到：第一步，蒜氨酸和蒜酶按质量比为1:0.1至2的比例，在温度为0℃至10℃、与空气隔绝的环境下，体外生物合成1mg/ml至10mg/ml的大蒜辣素水溶液；第二步，按大蒜辣素水溶液与水溶性有机溶剂的体积比为1:0.5至2的比例，向大蒜辣素水溶液中加入水溶性有机溶剂，在温度为15℃至40℃条件下，孵育5min至20min后，进行高速离心5min至30min，得到大蒜辣素水溶性有机溶剂层，将大蒜辣素水溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机溶液；第三步，向大蒜辣素有机溶液中加入脂溶性有机溶剂进行萃取，收集大蒜辣素脂溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机浓缩液；第四步，对大蒜辣素有机浓缩液进行分子蒸馏、收集，即得到高纯度大蒜辣素。
体外生物合成为现有公知技术的体外生物合成法。
实施例2：该高纯度大蒜辣素，按照下述步骤得到：第一步，蒜氨酸和蒜酶按质量比为1:0.1或2的比例，在温度为0℃或10℃、与空气隔绝的环境下，体外生物合成1mg/ml或10mg/ml的大蒜辣素水溶液；第二步，按大蒜辣素水溶液与水溶性有机溶剂的体积比为1:0.5或2的比例，向大蒜辣素水溶液中加入水溶性有机溶剂，在温度为15℃或40℃条件下，孵育5min或20min后，进行高速离心5min或30min，得到大蒜辣素水溶性有机溶剂层，将大蒜辣素水溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机溶液；第三步，向大蒜辣素有机溶液中加入脂溶性有机溶剂进行萃取，收集大蒜辣素脂溶性有机溶剂层，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机浓缩液；第四步，对大蒜辣素有机浓缩液进行分子蒸馏、收集，即得到高纯度大蒜辣素。
实施例3：作为上述实施例的进一步优化，蒜氨酸纯度≥50%，蒜酶活力≥1000u/g。
实施例4：作为上述实施例的进一步优化，水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇中的一种；或/和，脂溶性有机溶剂为丙酮、乙醚中的一种。
实施例5：作为上述实施例的进一步优化，减压、旋蒸、浓缩的条件是温度为10℃至50℃、压力为0bar至0.05bar、转速为50rpm至150rpm；或/和，高速离心时的温度为4℃至15℃，离心转速为3000rpm至12000rpm。
实施例6：作为上述实施例的进一步优化，分子蒸馏的条件：进样速度为0.5ml/min至5ml/min，刮板速度为5rpm/min至50rpm/min，外接循环温度为10℃至-30℃，真空度为1torr至100torr。
实施例7：该高纯度大蒜辣素，按照下述步骤得到：第一步，蒜氨酸和蒜酶按质量比为1:1.2的比例，在温度为0℃至10℃、与空气隔绝的环境下，体外生物合成4mg/ml的大蒜辣素水溶液，其中，蒜氨酸纯度为52.4%，蒜酶活力为1200u/g；第二步，向大蒜辣素水溶液中，按照大蒜辣素水溶液与乙醇溶液的体积比为1:0.8的比例，加入体积百分数为95%的乙醇溶液，在温度为20℃条件下，孵育5min后，进行高速离心5min，得到大蒜辣素乙醇溶剂层，将大蒜辣素乙醇溶剂层在温度为40℃、压力为0.02bar、转速为50rpm的条件下，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机溶液，其中，高速离心时温度为10℃，离心转速为5000rpm；第三步，向大蒜辣素有机溶液中，按照大蒜辣素水溶液与丙酮溶液的体积比为1:0.3的比例，加入丙酮溶液进行萃取，收集大蒜辣素丙酮溶液层，在温度为40℃、压力为0.02bar、转速为50rpm的条件下进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机浓缩液；第四步，对大蒜辣素有机浓缩液进行分子蒸馏，根据对应分子量收集所蒸馏的重组分，即为高纯度大蒜辣素，其中，分子蒸馏的条件：进样速度为0.5ml/min，刮板速度为12rpm/min，外接循环温度为10℃，真空度为20torr。所得大蒜辣素溶液的纯度为95.5%。
实施例8：该高纯度大蒜辣素，按照下述步骤得到：第一步，蒜氨酸和蒜酶按质量比为1:1的比例，在温度为0℃至10℃、与空气隔绝的环境下，体外生物合成5.5mg/ml的大蒜辣素水溶液，其中，蒜氨酸纯度为64.3%，蒜酶活力为5000u/g；第二步，向大蒜辣素水溶液中，按照大蒜辣素水溶液与甲醇溶液的体积比为1:1的比例，加入甲醇溶液，在温度为20℃条件下，孵育15min后，进行高速离心20min，得到大蒜辣素甲醇溶剂层，将大蒜辣素甲醇溶剂层在温度为30℃、压力为0.01bar、转速为80rpm的条件下，进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机溶液，其中，高速离心时温度为8℃，离心转速为11000rpm；第三步，向大蒜辣素有机溶液中，按照大蒜辣素水溶液与乙醚溶液的体积比为1:1的比例，加入丙酮溶液进行萃取，收集大蒜辣素丙酮溶液层，在温度为30℃、压力为0.01bar、转速为80rpm的条件下进行减压、旋蒸、浓缩，得到大蒜辣素有机浓缩液；第四步，对大蒜辣素有机浓缩液进行分子蒸馏，根据对应分子量收集所蒸馏的重组分，即为高纯度大蒜辣素，其中，分子蒸馏的条件：进样速度为1.2ml/min，刮板速度为15rpm/min，外接循环温度为5℃，真空度为30torr。所得大蒜辣素溶液的纯度为95.1%。
本发明上述实施例7、实施例8得到的大蒜辣素溶液的性能测定和分析
四谱分析包括紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振波谱。
紫外光谱测定方法：取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素液体（大蒜辣素）适量，加适量50%至95%乙醇为溶剂制成5ug/ml至10ug/ml溶液，按《中国药典》（2015版）第四部通则0401紫外-可见分光光度法200nm-至400nm波长范围内测定。取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素在200-250nm波长范围呈现末端吸收。
红外光谱测定方法：按《中国药典》（2015版）第四部通则0402红外分光光度法，取取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素溶液于红外光谱仪扫描得红外吸收光谱。
质谱测定方法：按《中国药典》（2015版）第四部通则0431质谱法中“5.电喷雾离子化（esi）”采集取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素的质谱信息测定大蒜辣素分子量。测得取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素分子量为162.78，符合文献报道值162.23。
核磁共振波谱测定方法：按《中国药典》（2015版）第四部通则0441核磁共振波普法，取取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素溶液适量溶于dmso中共测试用，分别测定其1h-nmr、13c-nmr谱。取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素分子结构与文献报道相符。
实施例7、实施例8得到的大蒜辣素溶液经过四谱分析，可以看出大蒜辣素的稳定性较强。
根据实施例7、实施例8得到的大蒜辣素溶液的纯度测定采用高效液相色谱法：参照《欧洲药典》6.0收载的“galicpowder”中大蒜辣素的含量测定方法，以羟苯丁酯为内标物，采用c18柱（4*250mm，5um），甲醇-1%甲酸（60:40）为流动相，检测器uv2487，检测波长254nm，流速0.8ml/min，进样量20ul，柱温25℃。测得取实施例7、实施例8所得的大蒜辣素的纯度≥95.0%。
综上所述，本发明制备工艺简单，原料由天然提取得到，所得的高纯度大蒜辣素作为天然药物，其毒副作用小，在生物体内无残留；本发明高纯度大蒜辣素稳定性和纯度有很大的提高，纯度≥95.0%，实现了产品的安全性、高效性以及质量的可控性。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。