本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种卵孢菌素发酵制备方法。技术背景卵孢菌素(oosporein)又名卵孢素，是一种二联苯醌类化合物，化学式为c14h10o8，其化学结构见图1.，是由土壤真菌、虫生真菌、担子菌等真菌产生的具有生理活性的次级代谢产物，因1944年kogl.f等人在染色卵孢霉(oosporacolorans)中首次分离得到而得名。1955年，g.lloyd等人从金色毛壳菌(chaetomiumaureum)的发酵液中分离得到了卵孢菌素；1959年，p.v.divekar等人发现一株真菌菌株产红色物质，经鉴定红色物质为卵孢菌素，该真菌为支顶孢属(acremoniumsp.)，同时也对卵孢菌素的乙酰化和甲酰化反应进行了研究；1962年，vininglckwj等人首次从球孢白僵菌(beauveriabassiana)中分离得到卵孢菌素；1974年，richardj.等人从发霉的花生中分离了一株可以产卵孢菌素的三边毛壳菌(chaetomiumtrilaterale)，2000年，hermannstrasser等人从金龟子中分离一株可以产卵孢菌素的布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)，研究了布氏白僵菌在深层发酵和大麦籽粒两种培养模式下卵孢菌素的产量，以及测定卵孢菌素在金龟子幼虫和指示植物体内的分布情况；2003年，abendsteind等人分离到一株生产卵孢菌素的角毛壳菌(chaetomiumcupreum)；2004年，astridmichelitsch等人建立了准确测定布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)发酵上清液中卵孢菌素含量的示差脉冲极谱法，检测极限是54ng/ml；2005年，christophseger等人建立了一种快速测定发酵液中卵孢菌素含量的高效液相色谱法，该法的检测极限为6.0±2.3μg/l，比视差脉冲极谱法花费时间更短，检测下限更低；2012年，ganghe等人从银耳菌(tremellafuciformis)的发酵液中分离出了卵孢菌素，确定了卵孢菌素的两个环基本上在一个平面上，且两个环的二面角角度为67.89°。1966年，sohairh.等人用c-14标记底物的方法研究了球孢白僵菌(beauveriabassiana)中卵孢菌素的形成过程。结果表明乙酸及丙二酸均参与卵孢菌素的合成过程。2015年，pengfeng等人研究了关于卵孢菌素在球孢白僵菌(beauveriabassiana)中生物合成途径。确定卵孢菌素在真菌中的合成是通过一条包括七个基因在内的聚酮酶合成途径完成的。卵孢菌素在生物系统中具有很高的生物活性，包括抗细菌、抗真菌，抗氧化和抗病毒等活性，但对动植物的影响较小。卵孢菌素不仅对格兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)具有抗性，同样对格兰氏阴性菌(白色念珠菌)也有抗性；rameshaalurappa等人首次证明卵孢菌素有抗氧化活性，50％dpph的清除能力需要卵孢菌素0.194mm，同vc的清除能力接近(0.189mm)。toshinorinagaoka等人发现卵孢菌素对致病疫霉有较高的抗性，对番茄早疫菌和尖孢镰刀菌也有抗性；对辣椒炭疽病菌(colletotrichumcapsici)、西瓜枯萎菌(fusariumoxysporumf.sp.niveum)、致病疫霉(phytophthorainfestans)等植物病原菌具有较强的抑制作用。brain.j等人证明卵孢菌素对孢疹病毒ⅰ型聚合酶具有抑制活性；maobi-zeng等人研究表明卵孢菌素具有一定的抗肿瘤活性。上述研究表明，卵孢菌素在农药和医药的研究开发方面有较好的前景。但卵孢菌素的生产技术却一直是个难题。2000年，hermannstrasser等人采用球孢白僵菌液体发酵生产卵孢菌素，产量达到270mg/l，所用培养基成分未知。2004年，astridmichelitsch等人利用白僵菌属进行液体发酵，发酵液中的卵孢菌素含量采用示差脉冲极谱法测定为524.9mg/l。前期，本实验室利用角毛壳菌进行发酵，采用高效液相色谱法测定发酵液中的卵孢菌素平均含量为788.8mg/l，是目前文献报道的最高液体发酵产量。但上述发酵研究中卵孢菌素的产量还较低，其生产成本很高，远远达不到工业化生产的要求。本实验室长期从事毛壳菌(chaetomiumsp.)及其代谢产物的研究工作。从土壤中分离得到一株角毛壳菌(chaetomiumcupreum)，其发酵代谢产物为卵孢菌素；我们对该角毛壳菌(c.cupreum)进行遗传改良，获得了卵孢菌素高产菌株，并研究获得了该菌株优化的发酵生产工艺条件，通过该发酵生产工艺，可以获得较高产量的卵孢菌素，降低生产成本，从而完成了本发明。技术实现要素：本发明的目的：本发明的目的之一，是提供一种用于生产卵孢菌素(oosporein)的新菌株；本发明的目的之二，是提供一种“批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产卵孢菌素；本发明的目的之三，是提供用于生产卵孢菌素的培养基；更具体地说，本发明提供一种卵孢菌素发酵制备方法，包含以下步骤：将能够产生卵孢菌素的白僵菌属(beauveriasp.)菌，如球孢白僵菌(beauveriabassiana)，布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)等，支顶孢属(acremoniumsp.)菌等，毛壳菌属(chaetomiumsp.)菌，如金色毛壳菌(chaetomiumaureum)，螺卷毛壳菌(chaetomiumspirile)，半裸毛壳菌(chaetomiumseminudum)，巴西毛壳(chaetomium.brasiliense)，暗色毛壳(chaetomium.atrobrunneum)，角毛壳菌(chaetomiumcupreum)，三边毛壳菌(chaetomiumtrilaterale)，球毛壳菌(chaetomiumglobosum)等，及其遗传改良菌株，在一级液体培养基(例如,下文所述的培养基a)中培养，作为种子液；将种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基b)中培养；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液c)的补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集卵孢菌素，并进行分离提取和纯化。本发明的具体实施方案是，采用已知的能够产生卵孢菌素的白僵菌属(beauveriasp.)菌，如球孢白僵菌(beauveriabassiana)，布氏白僵菌(beauveriabrongniartii)，支顶孢属(acremoniumsp.)菌,毛壳菌属(chaetomiumsp.)菌，如金色毛壳菌(chaetomiumaureum)，螺卷毛壳菌(chaetomiumspirile)，半裸毛壳菌(chaetomiumseminudum)，巴西毛壳(chaetomium.brasiliense)，暗色毛壳(chaetomium.atrobrunneum)，三边毛壳菌(chaetomiumtrilaterale)，球毛壳菌(chaetomiumglobosum)，角毛壳菌(chaetomiumcupreum)，及其遗传改良菌株,如角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch-1，角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch21-2-20〔发表于《产抗生素角毛壳菌ch21的诱变育种》，中国抗生素杂志2011年12月第36卷第12期〕等，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基，例如下文所述的培养基a、b。在第二级发酵中，接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在23℃－30℃发酵培养6－48小时后，选用合适的补料液,例如下文所述的补料液c，进行流加补料发酵培养。第二级液体培养流加补料(例如补料液c)的方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率,如0.01—10.0l/h，(匀速或非匀速)将适合的补料液(例如补料液c)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止发酵(下罐)前大约5-48小时。所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合的补料液(例如补料液c)流加入第二级发酵罐中。间歇时间为每1-24小时补料2-10次，优选为间隔1-3小时补料1次。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。发酵条件：温度23℃—30℃，ph：3-8发酵时间：3-10天发酵结束后，发酵液采用薄膜浓缩技术过滤除去菌丝等固体物得到滤液，在滤液中加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用酸性水洗涤萃取液3次，40℃减压浓缩乙酸乙酯相，得到卵孢菌素粗品；粗品用甲醇溶解，10000r/min离心去除杂质后加入纯水，使得甲醇体积分数比例为20％；室温放置直到析出红色晶体，收集红色晶体，得到卵孢菌素产品。采用本发明工艺，在第二级发酵时，通过流加补料液发酵，可以为菌体持续提供合成卵孢菌素需要的碳源、氮源，维持发酵工艺需求的较好的碳氮比，提高发酵体系中细胞浓度和产物合成效率，从而提高卵孢菌素的产量。在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高卵孢菌素的产量。在优选的本发明方法中，本发明特别提供一株角毛壳菌(chaetomiumcupreum)的遗传改良菌株角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch-1用于生产卵孢菌素；其已于2015年02月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.10567),地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明发酵所采用的培养基a、b及补料液c的具体组成质量百分比如下：培养基b：补料液c：成分一般范围优选范围蔗糖/糖蜜0.1％-5.0％0.5％-3.0％葡萄糖0.1％-10.0％0.5％-5.0％淀粉0.1％-5.0％0.3％-3.0％花生粉或花生粉水解液0.1％-6.0％0.5％-3.0％大豆蛋白0.1％-6.0％0.5％-3.0％过氧化氢0.01％-3.0％0.05％-1.0％生物素0.01％-3.0％0.05％-1.0％磷酸氢二钾0.01％-3.0％0.05％-0.5％本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为:将活化后的角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch-1菌种/孢子液接种于培养基a中,装于三角瓶内23℃-30℃摇瓶培养20-50小时后，以3％-25％的接种量接种于已加有灭菌培养基b的发酵罐中进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23℃-30℃，发酵培养6-48小时后，开始补料液c的流加补料。补料液c流加补料方式有两种，一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，连续流加方式是优选的。采用连续流加方式时，以0.01—10.0l/h的速度连续(匀速或非匀速)流加补料液c，直至停止发酵(下罐)前约5-48小时。采用间歇式流加方式时，间歇时间可为每1-24小时补料2-10次，优选为大约间隔1-3小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％—1.5％，优选0.05％—0.3％。发酵条件：温度23℃-30℃，ph：3-8发酵时间：3-10天发酵结束后，发酵液采用薄膜浓缩技术过滤除去菌丝等固体物得到滤液，在滤液中加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用酸性水洗涤萃取液3次，40℃减压浓缩乙酸乙酯相，得到卵孢菌素粗品；粗品用甲醇溶解，10000r/min离心去除杂质后加入纯水，使得甲醇体积分数比例为20％；室温放置直到析出红色晶体，收集红色晶体，得到卵孢菌素产品。本发明的全工艺流程见附图1。采用本发明工艺，菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产卵孢菌素；采用高效液相色谱法检测卵孢菌素(二联苯醌类)含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长290nm；进样量5μl；流动相为a水(0.1％乙酸，0.9％甲酸)，b乙腈(0.1％乙酸，0.9％甲酸)；流速：0.5ml/min)〕，其产量可达2.0g/l。本发明具有以下优点：1.本发明采用遗传改良菌株角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch-1，其底物转化率和产物合成速率较高，卵孢菌素的产量可达2.0g/l。2.采用本发明发酵培养基及液体培养基流加补料发酵工艺，可以维持菌株生长和合成产物需求的较好的碳氮比，保证菌株实现较高的卵孢菌素的产量。3.提取工艺流程简单，回收率高，操作方便。附图说明附图1卵孢菌素在真菌中的生物合成途径。附图2为本发明卵孢菌素的发酵生产工艺流程图。附图3为卵孢菌素(oosporein)化学结构。具体实施例实施例1用1000ml三角瓶10个，每瓶装300ml培养基a(葡萄糖3.5％，蛋白胨1.0％，可溶性淀粉3.0％，花生饼粉1.0％，玉米粉2.2％，大豆饼粉0.2％，土豆浸出汁1.5％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch-1孢子液，于25℃摇瓶培养42小时。将培养好的菌种液按10％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中，(培养基b：淀粉3.0％，甘油1.0％，乳糖1.0％，蔗糖2.5％，硫酸铵0.05％，葡萄糖3.0％，蛋白胨1.5％，黄豆粉水解液1.0％，花生饼粉2.5％，大豆蛋白2.0％，发酵豆粕1.0％，玉米粉1.5％，酵母粉0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸铁0.01％，硫酸镁0.01％，氯化钠0.1％),进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23℃-28℃，发酵培养40小时后，开始进行以0.7l/h的速度连续流加补料液c的流加补料(补料液c：蔗糖0.8％，葡萄糖2.0％，淀粉0.3％，花生粉1.0％，大豆蛋白1.5％，过氧化氢0.05％，生物素0.05％，磷酸氢二钾0.1％),直至停止发酵(下罐)前约20小时；发酵ph3-8,发酵周期10天。发酵结束后，发酵液采用薄膜浓缩技术过滤除去菌丝等固体物得到滤液，在滤液中加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用酸性水洗涤萃取液3次，40℃减压浓缩乙酸乙酯相，得到卵孢菌素粗品；粗品用甲醇溶解，10000r/min离心去除杂质后加入纯水，使得甲醇体积分数比例为20％；室温放置直到析出红色晶体，收集红色晶体，得到卵孢菌素产品。采用高效液相色谱法检测卵孢菌素(二联苯醌类)含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长290nm；进样量5μl；流动相为a水(0.1％乙酸，0.9％甲酸)，b乙腈(0.1％乙酸，0.9％甲酸)；流速：0.5ml/min)〕，卵孢菌素产量可达2.0g/l。实施例2用1000ml三角瓶10个，每瓶装300ml培养基a(葡萄糖2.5％，蛋白胨1.5％，可溶性淀粉3.0％，花生饼粉1.5％，玉米粉2.2％，大豆饼粉0.2％，土豆浸出汁1.5％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch-1孢子液，于25℃摇瓶培养42小时。将培养好的菌种液按10％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中，(培养基b：淀粉3.0％，甘油1.0％，乳糖2.0％，蔗糖2.5％，硫酸铵0.05％，葡萄糖4.0％，蛋白胨1.5％，黄豆粉水解液2.0％，花生饼粉2.5％，大豆蛋白2.0％，发酵豆粕1.0％，玉米粉2.5％，酵母粉0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸铁0.01％，硫酸镁0.01％，氯化钠0.1％),进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23℃-28℃，发酵培养40小时后，采用间歇式流加方式流加补料液c的流加补料(补料液c：蔗糖1.5％，葡萄糖2.0％，淀粉0.5％，花生粉1.5％，大豆蛋白1.5％，过氧化氢0.05％，生物素0.05％，磷酸氢二钾0.1％),采用间歇式流加方式，间歇时间为每10小时补料5次，每次补料量为发酵液总体积的0.05％；直至停止发酵(下罐)前约25小时停止补料；发酵ph3-8,发酵周期10天。发酵结束后，发酵液采用薄膜浓缩技术过滤除去菌丝等固体物得到滤液，在滤液中加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用酸性水洗涤萃取液3次，40℃减压浓缩乙酸乙酯相，得到卵孢菌素粗品；粗品用甲醇溶解，10000r/min离心去除杂质后加入纯水，使得甲醇体积分数比例为20％；室温放置直到析出红色晶体，收集红色晶体，得到卵孢菌素产品。采用高效液相色谱法检测卵孢菌素(二联苯醌类)含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长290nm；进样量5μl；流动相为a水(0.1％乙酸，0.9％甲酸)，b乙腈(0.1％乙酸，0.9％甲酸)；流速：0.5ml/min)〕，卵孢菌素产量可达1.8g/l。实施例3用1000ml三角瓶10个，每瓶装300ml培养基a(葡萄糖3.5％，蛋白胨1.0％，可溶性淀粉3.0％，花生饼粉1.0％，玉米粉2.2％，大豆饼粉0.2％，土豆浸出汁1.5％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的角毛壳菌(chaetomiumcupreum)ch21-2-20孢子液，于25℃摇瓶培养42小时。将培养好的菌种液按10％的接种量接种于内装50l灭菌培养基b的100l发酵罐中，(培养基b：淀粉3.0％，甘油1.5％，乳糖2.5％，蔗糖2.5％，硫酸铵0.05％，葡萄糖3.5％，蛋白胨1.5％，黄豆粉水解液2.5％，花生饼粉3.5％，大豆蛋白3.5％，发酵豆粕1.0％，玉米粉1.5％，酵母粉0.1％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸铁0.01％，硫酸镁0.01％，氯化钠0.2％),进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23℃-28℃，发酵培养45小时后，开始进行以0.8l/h的速度连续流加补料液c的流加补料(补料液c：蔗糖1.5％，葡萄糖3.5％，淀粉0.5％，花生粉1.5％，大豆蛋白2.5％，过氧化氢0.05％，生物素0.05％，磷酸氢二钾0.2％),直至停止发酵(下罐)前约22小时；发酵ph3-8,发酵周期10天。发酵结束后，发酵液采用薄膜浓缩技术过滤除去菌丝等固体物得到滤液，在滤液中加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用酸性水洗涤萃取液3次，40℃减压浓缩乙酸乙酯相，得到卵孢菌素粗品；粗品用甲醇溶解，10000r/min离心去除杂质后加入纯水，使得甲醇体积分数比例为20％；室温放置直到析出红色晶体，收集红色晶体，得到卵孢菌素产品。采用高效液相色谱法检测卵孢菌素(二联苯醌类)含量〔检测条件：色谱柱为agilentzorbaxecilpsec185um250×4.6mm；检测器为紫外vwd检测器；检测波长290nm；进样量5μl；流动相为a水(0.1％乙酸，0.9％甲酸)，b乙腈(0.1％乙酸，0.9％甲酸)；流速：0.5ml/min)〕，卵孢菌素产量可达1.2g/l。实施例4卵孢菌素防治蔬菜真菌病害：用5％的卵孢菌素水溶液，作田间喷施，防治植物真菌病,发病率比对照药剂处理分别降低41.6％，58.5％，40％，29.6％，54.5％，46.7％，如下表。实施例5卵孢菌素对部分细菌的抑菌效果，略高于对照药剂，如下表。当前第1页12