本发明属于氘代试剂制备领域，具体涉及一种合成甘氨酸(2,2-d2)以及由甘氨酸(2,2-d2)合成一种α-氘代氨基酸模块(马尿酸-l-薄荷酯)的方法，尤其涉及一种直接以廉价的甘氨酸、氘水或氘氧化钠等为原料合成甘氨酸(2,2-d2)的方法，以及以甘氨酸(2,2-d2)为原料进一步合成一种α-氘代氨基酸模块(马尿酸-l-薄荷酯)的方法。
背景技术：
甘氨酸(2,2-d2)是一种重要的稳定同位素标记氨基酸，在生物医药、多肽研究、蛋白质代谢等生物及化学等方面具有广泛的应用。甘氨酸(2,2-d2)可用于合成多种稳定同位素标记多肽化合物，也是新生儿筛查诊断试剂盒中所使用氨基酸的合成前体，并且以甘氨酸(2,2-d2)为原料可以合成一系列的其他氘代氨基酸。同时，以甘氨酸(2,2-d2)为原料也可以合成一种重要的手性氨基酸模块，即马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)，通过马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)与卤代支链的接合，即可合成所有l-构型的α-氘代氨基酸，如l-丙氨酸(2-d)、l-丙氨酸(2,3,3,3-d4)、l-谷氨酸(2-d)等，具有很重要的应用前景。
目前合成甘氨酸(2,2-d2)主要有以下几种方法：
1、采用氢交换合成甘氨酸(2,2-d2)；
本方法主要是通过甘氨酸进行氘交换得到，其中使用氘代乙酸作为氘源，水杨醛作为催化剂进行氘交换，但是该方法具有氘源成本过高，另外后处理较为麻烦，且氘的交换利用率不高；另一种方法由是采用ru络合物作催化剂，但该方法不仅催化剂价格昂贵且不易获得，而且反应时间长，反应温度也高，使得交换效率低下。
2、用化学合成方法合成甘氨酸(2,2-d2)；
本方法采用乙酰氨基丙二酸二乙酯为原料，在地克珠利的催化下与氘水进行氘交换，然后再用氘代盐酸脱羧得到甘氨酸(2,2-d2)，此方法要用到比较昂贵的地克珠利为催化剂，同时采用氘代盐酸回流脱羧，对反应设备要求非常严格，同时会产生一定量的乙酸，对后续后处理会产生不利影响。
综上可知，目前合成甘氨酸(2,2-d2)的方法成本较高，或对设备要求严格，或反应条件苛刻，均不利于大量制备。
技术实现要素：
针对上述缺点，本发明的目的在于提供一种氘代甘氨酸、马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)及其中间体的合成方法，该合成方法所用的原料和试剂价廉易得，操作简单，并且得到的氘代试剂的纯度和氘丰度较高。
一种马尿酸(2,2-d2)的制备方法，包括：
(1)在吡哆醛或其盐的作用下，甘氨酸与碱金属氘氧化物的氘水溶液中进行反应，得到的氘代反应液；
所述的碱金属氘氧化物为氘氧化钠、氘氧化钾或氘氧化锂；
(2)步骤(1)得到的氘代反应液经过减压蒸馏回收部分氘水，然后加入水和苯甲酰氯进行酰胺化反应，反应结束后经过后处理得到所述的马尿酸(2,2-d2)。
本发明直接采用甘氨酸为原料，以价廉易得的氘水为氘源，以吡哆醛为催化剂，在强碱性条件下进行氢-氘交换反应，一步直接合成甘氨酸(2,2-d2)，同时在碱性的条件下，直接加入苯甲酰氯，使甘氨酸(2,2-d2)形成马尿酸(2,2-d2)，可直接通过调节ph值从反应液中结晶析出来。得到的马尿酸(2,2-d2)具有较高的纯度和氘丰度，可以直接用盐酸水解形成甘氨酸(2,2-d2)，也可进一步与l-薄荷醇反应生成用途更广的α-氘代氨基酸模块马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)。
本发明中，为了提高纯化效率和节省反应成本，反应过程中可以采用金属锂、金属钠或金属钾在低温下与氘水反应形成碱液进行反应，用氢氧化锂醇溶液、碳酸锂水溶液、三乙胺醇溶液等调节溶液ph值，可以降低合成成本，后续纯化过程中调节pd值后，可加入1～50倍体积的无水甲醇或无水乙醇助甘氨酸(2,2-d2)析出，极大地提高了甘氨酸(2,2-d2)的产率和纯度。作为优选，步骤(1)中，所述的碱金属氘氧化物可以采用碱金属与氘水反应得到。
作为优选，步骤(1)中，所述的碱金属氘氧化物的氘水溶液的质量百分比浓度为1～40％；
吡哆醛或其盐与甘氨酸的质量比为0.01％-10％；
反应温度为回流温度，反应时间为1-10小时。
所述的吡哆醛的盐优选为盐酸盐。
作为优选，步骤(2)中，所加入的水与甘氨酸的用量比为0-10ml：1g；
所加入的苯甲酰氯与甘氨酸的摩尔比为0.5-5：1；
反应温度为0～50℃，反应时间为1-20小时。
作为优选，步骤(2)中，所述的后处理过程如下：
将反应液用稀盐酸调节ph值为1～3，冷却析出固体，过滤，洗涤，得到的粗品用水进行重结晶得到所述的马尿酸(2,2-d2)纯品。
另外，亦可先将马尿酸(2,2-d2)溶于稀碱溶液中，然后再缓慢地加入稀酸，并搅拌均匀，使马尿酸(2,2-d2)慢慢析出，亦可得到马尿酸(2,2-d2)纯品。
本发明还提供了一种甘氨酸(2,2-d2)的合成方法，包括以下步骤：
(i)按照上述的方法合成马尿酸(2,2-d2)；
(ii)在酸性条件下，将步骤(i)得到的马尿酸(2,2-d2)进行水解反应，得到甘氨酸(2,2-d2)的盐；
(iii)步骤(ii)得到的甘氨酸(2,2-d2)的盐与碱发生中和反应，反应结束后经过后处理得到所述的甘氨酸(2,2-d2)。
作为优选，步骤(ii)中，所述的酸为硫酸或者盐酸；
水解反应的温度为25℃～回流状态下，反应时间为0.5～10小时。
作为优选，步骤(iii)中，所述的碱为氢氧化锂、碳酸锂或三乙胺；
所述的中和反应在醇溶剂中进行，反应ph值为5.0～7.0。
本发明还提供了一种马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)的合成方法，包括以下步骤：
(a)按照权利要求1～5任一项所述的方法合成马尿酸(2,2-d2)；
(b)在对甲苯磺酸的作用中，步骤(1)得到的马尿酸(2,2-d2)与l-薄荷醇在甲苯中发生酯化反应，反应结束后经过后处理得到所述的马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)。
作为优选，步骤(b)中，所述的马尿酸(2,2-d2)、对甲苯磺酸和l-薄荷醇的摩尔比为1：0.01％～10％：0.5～2.0；
反应温度为回流温度，反应时间为0.5～20小时。
本发明合成甘氨酸(2,2-d2)及马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)的方法，具体步骤如下：
(1)将甘氨酸(或甘氨酸盐)溶于1-40％氘氧化钠(或氘氧化钾、氘氧化锂氘水溶液，也可使用金属钠、金属钾、金属锂与冷的氘水反应后的溶液，其有效碱浓度为1-40％)中，待溶解完成后，加入0.01％-10％的吡哆醛磷酸盐(或盐酸盐，或在碱性条件下能形成吡哆醛的其他化合物)，升温回流反应1-10小时。
(2)反应完成后，减压蒸馏回收部分氘水，然后加入0-10倍体积的水，加入0.5-5当量的苯甲酰氯，0～50℃下搅拌1-20小时，得到马尿酸(2,2-d2)。反应结束后，用稀盐酸调节ph值为1～3，冷却析出大量固体，过液，用冷水洗涤固体，得到马尿酸(2,2-d2)粗品，进一步的纯化可使用水进行重结晶。
(3.1)形成甘氨酸(2,2-d2)：将马尿酸(2,2-d2)纯品置于10～35％的盐酸(或硫酸)溶液中，25℃～回流状态下反应0.5～10小时，旋干溶剂，得到甘氨酸(2,2-d2)盐酸盐。将盐酸盐溶于少量水中，微孔滤膜过滤，滤液用氢氧化锂、或碳酸锂、或三乙胺的醇溶液调节ph值为5.0～7.0，加入1～50倍体积的无水醇溶液，静置冷藏过夜，析出固体，抽滤，用无水醇溶液洗涤，干燥，得到产品甘氨酸(2,2-d2)。
(3.2)形成马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)：将马尿酸(2,2-d2)纯品溶于甲苯中，加入0.01％～10％的对甲苯磺酸，0.5～2.0当量的l-薄荷酯，回流状态下反应0.5～20小时，分水器分水，冷却后旋干甲苯，用石油醚:乙酸乙酯(100:1～1:10)的混合液进行重结晶，得到马尿酸-l-薄荷酯(2,2-d2)纯品，或柱层析亦可纯化。
本发明的具体的合成路线如下：
同现有技术相比，本发明所具有的优点为：
(1)本发明直接使用价廉易得甘氨酸(或甘氨酸盐)为起始原料，氘氧化钠(或氘氧化锂、氘氧化钾)氘水溶液或金属钠(或金属锂、金属钾)+氘水一步氢-氘交换合成了甘氨酸(2,2-d2)，步骤简单，易于操作，原料易得且廉价；
(2)、本发明直接采用氢交换的底物碱作为碱，直接与苯甲酰氯合成马尿酸，充分利用了氢交换过程中的氘氧化钠等碱，降低了合成成本，同时也使得标记产物可以与混合液完全分离；
(3)本发明避免了使用氘代盐酸等挥发性酸，对设备腐蚀明显降低；
(4)本发明后处理简单实用，方便放大制备，降低合成成本。
(5)本发明的产品提纯方便，产率高。
具体实施方式
实施例1
在单口瓶中依次加入1.0g甘氨酸、100mg吡哆醛盐酸盐后，氩气保护下油泵置换三次，然后在氩气氛下加入10％(质量百分比)氘氧化钠氘水溶液10ml，回流反应2小时。反应结束后，冷却，(可用针式过滤器过滤)，真空旋出约50％左右的氘水回收，冷却后加入10ml蒸馏水，加入2.2ml苯甲酰氯，室温搅拌过夜，然后加入粗冰，用浓盐酸调节反应液ph值为2～3，冷却，析出大量固体，过滤，滤饼用冰水洗涤。滤饼再用热水进行重结晶，析出白色晶体，过滤干燥，得到2.2g马尿酸(2,2-d2)纯品，产率91.2％，产品纯度>99％(hplc)，lc-ms和1hnmr确定氘丰度>98％。
取上述纯化的马尿酸(2,2-d2)1.0g、863mgl-薄荷醇、30mg对甲苯磺酸水合物溶解在10ml甲苯中，在氩气保护下，升温回流2.5小时，用分水器分离反应产生的水，tlc监控反应结束后，旋干甲苯，柱层析(pe:ea＝100:1→10:1)得到纯品1.65g，产率为93.6％，产品熔点108～109℃，产品纯度>99％(hplc)，lc-ms和1hnmr确定氘丰度>98％。
实施例2
在三口瓶中依次加入1.0g甘氨酸、100mg吡哆醛盐酸盐、420mg金属锂后，氩气保护下油泵置换三次，然后在氩气氛下缓缓加入10ml氘水，冰水浴下反应，待金属锂与氘水反应完全后，升温回流反应2.5小时。反应结束后，冷却，(可用针式过滤器过滤)，真空旋出约50％左右的氘水回收，冷却后加入10ml蒸馏水，加入2.2ml苯甲酰氯，室温搅拌过夜，然后加入粗冰，用浓盐酸调节反应液ph值为2～3，冷却，析出大量固体，过滤，滤饼用冰水洗涤。滤饼再用热水进行重结晶，析出白色晶体，过滤干燥，得到2.0g马尿酸(2,2-d2)纯品，产率82.9％，产品纯度>99％(hplc)，lc-ms和1hnmr确定氘丰度>98％。
将上述纯化的1.0g马尿酸(2,2-d2)溶于5ml20％盐酸溶液中，50℃保温2小时，然后减压旋干溶剂，得到甘氨酸盐酸盐(2,2-d2)粗品。将甘氨酸盐酸盐粗品溶于1ml水中，先用微孔滤膜过滤除去少量固体，然后用5％氢氧化锂乙醇溶液调节溶液ph值至5.5～6.5，然后缓缓加入50ml无水乙醇后，静置冷藏结晶，析出大量白色固体。过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，干燥，得到产品约320mg，产率77.0％，产品纯度>98％，lc-ms和1hnmr确定氘丰度>98％。