本发明涉及一种从灵芝中分离出的具有逆转肿瘤多药耐药作用的新化合物。本发明还涉及该化合物的制备方法。本发明还涉及以该化合物在制备治肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类生命的重大疾病，已成为人类死亡的主要原因，目前我国每年癌症患者发病人数约250万，因癌症死亡的人数约180万，且其发病率、致死率呈逐年上升趋势，化疗是肿瘤的主要疗法，但肿瘤细胞产生的多药耐药(mdr)常使化疗难以取得良好效果，据美国癌症协会估计，90%以上肿瘤患者的死亡在不同程度上受到耐药影响，研究显示耐药细胞出现得越早，疗效越差，肿瘤进展越快。肿瘤细胞的耐药性包括原发性耐药(intrinsicresistance)和获得性耐药(acquiredresistance)。多数肿瘤细胞的耐药性属于获得性耐药，是在化学治疗过程中逐渐产生的，例如乳腺癌的耐药性常常是由化疗药物诱导产生的。肿瘤细胞一旦产生耐药性，化疗药物就无法杀死癌细胞，致使在肿瘤治疗后期，疗效越来越差，副作用越来越大，这是导致恶性肿瘤最终无药可用的最重要原因之一。在没有新一代更有效化疗药物出现的前提下，提高现有化疗药物的敏感性、逆转化疗药物的耐药作用，是提高化疗效果的重要策略。许多mdr逆转剂已经被直接用于解决肿瘤多药耐药性的问题。由于植物所含的天然化合物具有来源广泛、价格低廉、毒性低等优点，最近，中药及其有效的成分逆转多药耐药引起了人们的注意。
中药灵芝是多孔菌科灵芝属真菌植物赤芝[ganodermalucidum(leyss.exfr.)karst]或紫芝[ganodermajaponicum(fr.)lloyd]的干燥子实体。性温、味甘，具有补中益气、滋补强壮、扶正固本的功效，临床上常用于肿瘤的治疗或辅助治疗。灵芝多糖和灵芝三萜类成分是灵芝抗肿瘤作用的主要物质基础。近年来许多细胞实验都已证实，灵芝三萜对人类多种肿瘤细胞都有抑制作用。目前，已经有150多种灵芝三萜类成分被分离鉴定，我们在针对灵芝抗肿瘤作用的有效成分研究中，分离鉴定了一个新的三萜类化合物，命名为ethyl7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate，即灵芝酸a乙酯（ethylganoderatea）。药理学实验表明，该化合物具有逆转肿瘤多药耐药作用。针对该化合物经过试验，确定了合理的制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从灵芝中分离出的具有逆转肿瘤多药耐药作用的新化合物（ethyl7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate）。
本发明的另一个目的在于提供制备该化合物方法。
本发明的再一目的在于提供该化合物在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。
根据本发明的一方面，提供具有下列化学结构式（ⅰ）的化合物：
（ⅰ）。
本发明上述的化合物的制备方法，包括以下步骤：
a）将灵芝用醇或醇溶液提取1次或2次以上，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；
b）将醇提取物加水，以石油醚脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以ph8-12碱性水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品。
c）将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（ⅰ）化合物；
上述步骤c）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，获得二氯甲烷-丙酮的体积比为19:1的洗脱物；2）取此部位的洗脱物经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水的体积比为70:30的洗脱部位得到纯的式（ⅰ）化合物。
上述ph8-12碱性水溶液优选采用饱和nahco3水溶液。
本发明上述结构式（ⅰ）的化合物在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。
所述的肿瘤为人口腔癌耐药细胞株kbv200。
含有治疗有效量的上述的结构式（ⅰ）的化合物或其衍生物的药物组合物。
上述的结构式（ⅰ）的化合物和/或其衍生物的含量大于50%已上，尤其90%以上。
治疗有效量的上述的结构式（ⅰ）的化合物或其衍生物的药物组合物在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。
具体地说，本发明上述化合物（ⅰ）的制备方法，本发明的化合物可以人工合成，但优选的是从天然植物中分离提取，以获得天然存在的、低毒性的天然化合物。在本发明的一个优选实施方案中，从中国传统中药灵芝中分离纯化了本发明的化合物，其制备步骤包括：
a）将灵芝用醇或醇溶液提取1次或2次以上，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；
b）将醇提取物加水，以石油醚脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以ph8-12碱性水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品。
c）将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（ⅰ）化合物；
上述步骤c）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用二氯甲烷-丙酮梯度洗脱，获得二氯甲烷-丙酮的体积比为19:1的洗脱物；2）取此部位的洗脱物经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水的体积比为70:30的洗脱部位得到纯的式（ⅰ）化合物。
根据本发明的再一方面，提供含有本发明化合物的药物组合物，可以通过将本发明化合物添加药学上可接受的载体或附形剂或可选的其他成分而制成适于临床使用的药物组合物。
根据本发明的再一方面，提供本发明化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，具有逆转肿瘤多药耐药的作用。
所述的肿瘤优选为人口腔癌耐药细胞株kbv200。
实验表明在含有结构式（ⅰ）的化合物和/或其衍生物的药物组合物中，其中结构式（ⅰ）的化合物和/或其衍生物的含量大于50%以上，尤其90%以上，治疗效果最佳。
本发明的有益效果是：逆转肿瘤多药耐药的作用，本发明的ethyl7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate在20μm低毒剂量下能增强阿霉素对人口腔癌耐药细胞株kbv200的敏感性，逆转倍数为10.86倍。实验结果表明，本发明的化合物具有逆转肿瘤多药耐药作用，由上可知，本发明的式（ⅰ）化合物ethyl7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate制备方法简便，工艺条件温和，式（ⅰ）化合物为白色晶体，实验证明采用本发明工艺步骤，获得的产品纯度可达98%。本发明的化合物能作为肿瘤多药耐药的逆转剂，对人口腔癌具有较好的效果。
附图说明
图1为本发明式（ⅰ）化合物逆转肿瘤多药耐药的作用图。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例的描述，详细说明但不限制本发明。
实施例
实施例1式（ⅰ）化合物的制备
材料来源灵芝（ganodermalucidum(leys.exfr.)karst）购自中国福建仙芝楼生物科技有限公司，该灵芝的标本样本保藏在福建医科大学药学院。
提取和分离将干的和粉碎的灵芝用无水乙醇回流提取3次，每次2h，提取液用2号滤纸过滤，用旋转蒸发器去除乙醇。醇提浸膏加适量水后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液再用饱和碳酸氢钠水溶液萃取，取出乙酸乙酯相减压浓缩蒸干得粗品，将粗品在硅胶上进行柱层析，用体积比19:1的二氯甲烷-丙酮洗脱，取二氯甲烷-丙酮（体积比19：1）洗脱物经制备型高效液相色谱（沃特世pre-150b制备型高效液相色谱仪）分离，采用体积比70:30的甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比70:30）洗脱部位得到纯的式（ⅰ）化合物。式（ⅰ）化合物为白色晶体，经测试纯度达98%。
实施例2式（ⅰ）化合物化学结构测定
结构测定在cdcl3溶液中用bruker核磁共振波谱仪记录nmr光谱，用agilent6210飞行时间质谱仪测定质谱。
式（ⅰ）化合物的理化性质本发明式（ⅰ）化合物为白色晶体，liebermann-burchard反应阳性；1h-nmr（cdcl3，500mhz）：δ1.46(1h，m，h-1)，δ2.85(1h，m，h-1’)，δ2.50(1h，m，h-2)，δ2.45(1h，m，h-2’)，δ1.67(1h，m，h-5)，δ2.06(1h，m，h-6)，δ1.69(1h，m，h-6’)，δ4.62(1h，dd，j=8.5，13.0hz，h-7)，δ2.77(1h，d，j=16.5hz，h-12)，δ2.50(1h，d，j=16.5hz，h-12’)，δ4.80(1h，dd，j=8.5hz，11.0hz，h-15)，δ1.42(1h，m，h-16)，δ2.66(1h，m，h-16’)，δ1.83(1h，m，h-17)，δ1.01(3h，s，h-18)，δ1.28(3h，s，h-19)，δ2.03(1h，m，h-20)，δ0.89(3h，d，j=8.0hz，h-21)，δ2.17(1h，dd，j=16，9.5hz，h-22)，δ2.42(1h，dd，j=16，9.5hz，h-22’)，δ2.58(1h，m，h-24)，δ2.74(1h，m，h-24’)，δ2.66(1h，m，h-25)，δ1.16(3h，d，j=8.5hz，h-27)，δ1.14(3h，s，h-28)，δ1.11(3h，s，h-29)，δ1.27(3h，s，h-30)，δ4.12(2h，q，j=8.5hz，h-31)，δ1.25(3h，t，j=8.5hz，h-32)；13c-nmr（cdcl3，125mhz）：δ35.6(c-1),34.3(c-2)，216.7(c-3)，46.7(c-4)，48.2(c-5)，29.3(c-6)，67.7(c-7)，161.6(c-8)，139.5(c-9)，37.7(c-10)，199.7(c-11)，52.1(c-12)，46.4(c-13)，54.1(c-14)，71.2(c-15)，36.6(c-16)，48.1(c-17)，17.6(c-18)，19.6(c-19)，32.6(c-20)，20.4(c-21)，49.4(c-22)，209.2(c-23)，46.3(c-24)，34.7(c-25)，175.6(c-26)，17.3(c-27)，27.2(c-28)，20.9(c-29)，19.3(c-30)，60.3(c-31)，14.5(c-32)；esi-ms：m/z543.3[m-h]-。
从hmbc谱图及hsqc谱图数据，并结合上述理化数据，确证式（ⅰ）化合物的结构式如下：
实施例3式（ⅰ）化合物抗癌作用的生物学实验及分析
1、材料和方法
细胞系和试剂用人口腔癌细胞kb及其耐药株kbv200肿瘤细胞。将这些细胞在含10%小牛血清的rpmi1640培养液中培养，置37℃，5%饱和湿度的co2培养箱中培养。
逆转mdr的作用取对数生长期的kb、kbv200细胞以适宜初始浓度分别进行种板；180µl/孔，3500个细胞/孔；培养24h后，敏感株kb细胞或耐药株细胞kbv200阴性对照组培养体系中不加药物，空白对照组不加细胞加180µl培养液和20µl药液，给药组加入20µl不同浓度的阿霉素。耐药株细胞kbv200先加入10µl的待测药物20μm；阳性药物维拉帕米作用浓度为20μm，作用1h，1h后给药组加入10µl不同浓度的阿霉素，对照组加入10µl培养基。将96孔板置于37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养72h；72h后每孔加入20µl5mg/ml的mtt，培养4h后弃去培养液，每孔加入l50µldmso，震荡孵育10-20min，酶标仪570nm波长测定od值；实验重复3次，取平均值。使用统计学分析软件prism6.0拟合出细胞生存率曲线，并计算出未加入或加入待测药物时细胞对阿霉素的ic50。逆转倍数=无待测药物时细胞对阿霉素的ic50值/在待测药物存在时细胞对阿霉素的ic50值。
2、结果
逆转mdr的作用结果作用72h，上述的式（ⅰ）化合物[ethyl7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate]能增强阿霉素对人口腔癌耐药株kbv200的敏感性，在20μm浓度下，逆转倍数为10.86（见图1）。实验结果表明，本发明的化合物具有逆转肿瘤多药耐药作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。