本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及鉴定与改进水稻种子萌发耐涝性的方法。
背景技术：
水稻作为人类最重要的粮食作物之一，世界上近一半的人口以稻米为主食，其在亚洲、非洲及美洲的大部分地区都有广泛种植。水稻喜温多湿，属于一种半水生植物。水稻生长季节降雨集中，易引发水稻洪涝灾害。水稻受淹水胁迫后主要表现为叶片变黄，绿叶减少，光合受阻，根系缺氧，吸收能力下降，生育期延长，灌浆结实受影响等，最终导致减产甚至绝收。种子萌发长时间淹水可致使种子缺氧导致烂芽，发芽率降低，幼苗生长受阻。
淹水胁迫对水稻生长的影响是一个复杂过程，淹水胁迫主要是植物部分或全部植株浸没在水中，致使植物与外界环境的气体(例如o2、co2、乙烯等)交换和光线传输减少，限制植物生长。
水稻对淹水胁迫的响应存在基因型差异。通过现代分子和遗传学研究证实了水稻耐淹性状主要由第9号染色体上的sub1控制，序列分析表明sub1位点包含了3个编码隶属植物ap2/erf转录因子家族erf亚家族蛋白的基因——sub1a、sub1b、sub1c。其中，sub1b、sub1c存在于已检验的籼稻和粳稻品种，而sub1a仅存在少数籼稻品种中。sub1a基因通过调节乙烯和ga介导的反应，一方面能抑制细胞伸长和碳水化合物的降解，减慢能量消耗，为植物在淹水期间和淹没后的恢复和生长保存了能量，另一方面激活乙醇发酵相关基因表达，为细胞维持必要生命活动提供能量。
ca2+是植物中重要的第二信使，细胞中的钙信号经过钙传感蛋白，包括钙调素(cam)、钙调素类似蛋白(caml)、钙依赖而钙调素不依赖蛋白激酶(cdpk)以及钙调磷酸酶b类蛋白(cbl)/cbl相互作用蛋白(cipk),传递到下游组分(转录因子、nadph氧化酶基因等)，引起相关基因表达，使植物对胁迫作出响应。目前鉴定出水稻基因组中含有10个oscbls和30个oscipks，理论上较拟南芥有更多的cbl-cipk组合，可能解析更复杂的ca2+信号，表达分析可知水稻中绝大部分oscbls基因和20个oscipks基因与干旱、低温、aba等胁迫相关。然而，oscbls基因和oscipks基因对种子在淹水环境下的萌发功能仍未知，亦未见有相关披露。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于针对现有技术的不足，提供一种鉴定和改进水稻种子萌发耐涝性的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种鉴定水稻种子萌发耐涝性的方法，包括：鉴定稻谷品种的oscbl10基因的启动子序列是t-type还是i-type，如果鉴定结果是t-type，判断该稻谷品种是耐淹品种，如果鉴定结果是i-type，则判断该稻谷品种是不耐淹品种。
进一步地：
t-type启动子引物序列为：
fp:gaatgagtggcaccagttgag
rp:cgtgagtgggttcgatacgat
i-type启动子引物序列为：
fp:cccgtgatccttccatccgtag
fp:aatcccaacccaccacctaaca。
一种改进水稻种子萌发耐涝性的方法，通过调控oscbl10基因的表达量，来改进水稻种子萌发耐涝性。
进一步地：
通过转基因技术将oscbl10基因的i-type启动子置换成t-type启动子，来降低oscbl10基因的表达量。
通过提高oscipk15的含量来提高种子萌发耐淹性。
通过基因编辑技术对oscbl10基因的i-type启动子后的编码基因进行编辑，来降低oscbl10基因的表达量。
还包括：在调控oscbl10基因的表达量之前，鉴定稻谷品种的oscbl10基因的启动子序列是t-type还是i-type，如果鉴定结果是t-type，判断该稻谷品种是耐淹品种，如果鉴定结果是i-type，则判断该稻谷品种是不耐淹品种。
一种提高水稻种子对逆境的抗性的方法，包括：通过调控oscbl10基因的表达量，来提高水稻种子对逆境的抗性。
发明人研究发现了oscbl10基因参与耐水淹抗性，并且发现该耐水淹抗性差异是由于它的启动子区域的差异所造成的。发现oscbl基因的两种启动子类型t-type、i-type与水稻种子萌发耐涝性相关。oscbl10的耐受型启动子类型的发现对于在水稻种子在水淹缺氧条件下萌发生长及种子耐受性的鉴定具有重要意义。
利用本发明，可以改善植物的抗逆性(包括耐涝性)，可用于分子植物育种物，例如通过基因编辑技术改变oscbl10基因的表达，培育抗逆性新品种，以提高植物对逆境的抗性。尤其是，降低oscbl10的表达量可以创造出耐淹水稻品种，对于提高水稻种子对逆境的抗性中起到重要的作用。
附图说明
图1显示low88(耐淹型水稻品种)、up221(不耐淹旱稻品种)在空气及淹水环境下的种子萌发情况。其中，图1中a表示耐淹型(low88)和不耐淹型(up221)在空气和水淹处理下的萌发表型；图1中b表示耐淹型(low88)和不耐淹型(up221)在空气和水淹处理下萌发时的胚芽长度；图1中c表示耐淹型(low88)和不耐淹型(up221)在空气和水淹处理下萌发的存活率。
图2显示oscbl10基因的t-type、i-type型启动子的序列比对，序列的主要差异标记为d1、d2、d3。
图3显示水稻cbl基因家族参与淹水胁迫下的种子萌发情况；图3中a显示典型品种low88、up221种子萌发期间淹水条件下ca2+差异；图3中b显示钙离子相关蛋白对两个水稻品种在淹水萌发的影响；图3中c显示两水稻品种在空气(a)、淹水(f)处理下种子萌发时cbl基因的转录本丰度；图3中d显示两水稻品种在淹水萌发时oscbl10基因的转录本丰度；图3中e显示野生型(wt，nipponbar)和相应的oscbl10基因过表达系在淹水萌发时的表型；图3中f显示野生型和oscbl10基因过表达系在种子萌发期间淹水条件下ca2+差异。
图4显示耐淹品种(low88)和不耐淹品种(up221)下游信号的活化；图4中a显示两水稻品种在空气(a)、淹水(f)处理下种子萌发时cipk基因的转录本丰度；图4中b、c显示oscipk15基因和osamy3基因在淹水处理后的转录本丰度；图4中d显示两品种在淹水萌发处理后α-淀粉酶活性变化。
图5显示oscbl10过表达系的鉴定及其低氧萌发表型鉴定，图5中a显示利用基因半定量技术检测不同oscbl10过表达株系中oscbl10基因的表达量；图5中b显示三个oscbl10基因过表达株系的水淹萌发表型。oscbl10过表达系种子萌发对淹水及低氧环境萌较野生型敏感。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
在一种实施例中，一种鉴定水稻种子萌发耐涝性的方法，包括：鉴定稻谷品种的oscbl10基因的启动子序列是t-type还是i-type，如果鉴定结果是t-type，判断该稻谷品种是耐淹品种，如果鉴定结果是i-type，则判断该稻谷品种是不耐淹品种。
在另一种实施例中，一种改进水稻种子萌发耐涝性的方法，通过调控oscbl10基因的表达量，来改进水稻种子萌发耐涝性。
在一些实施例中，通过转基因技术将oscbl10基因的i-type启动子置换成t-type启动子，来降低oscbl10基因的表达量。
在一些实施例中，通过提高oscipk15的含量来提高种子萌发耐淹性。
在另一些实施例中，通过基因编辑技术对oscbl10基因的i-type启动子后的编码基因进行编辑，来降低oscbl10基因的表达量。
在一些实施例中，改进水稻种子萌发耐涝性的方法还包括：在调控oscbl10基因的表达量之前，鉴定稻谷品种的oscbl10基因的启动子序列是t-type还是i-type，如果鉴定结果是t-type，判断该稻谷品种是耐淹品种，如果鉴定结果是i-type，则判断该稻谷品种是不耐淹品种。
在另一种实施例中，一种提高水稻种子对逆境的抗性的方法，包括：通过调控oscbl10基因的表达量，来提高水稻种子对逆境的抗性。
发明人发现了oscbl10基因参与种子萌发耐水淹抗性，并且发现该耐水淹抗性差异是由于它的启动子区域的差异所造成的。发明人通过比较两种生态型(水稻、旱稻)水稻品种和种子萌发耐涝性关系，发现水稻品种low88和旱稻品种up221在淹水情况下，种子萌发、胚芽鞘生长及种子的成活率存在显著差异(如图1所示)。对淹水胁迫下两个品种ca2+动力学特征及空间特性比较发现，缺氧不耐受品种up221较缺氧耐受品种low88的表现出较高的钙离子信号。另外，试验发现cbl抑制剂环孢菌素a(cyclosporina)可以减轻对low88的胁迫并增加淹水对up221的胁迫作用，证明oscbls基因对淹水环境下的种子萌发具有重要作用。通过rt-pcr及基因过表达证实oscbl10基因与水稻种子萌发期间耐淹胁迫相关的重要基因。
本发明利用对水稻品种的oscbl10基因启动子类型的鉴定来鉴定苗期耐淹水稻品种是否耐淹。oscbl10基因启动子类型鉴定为t-type型的为耐淹水稻品种，鉴定为i-type型的为不耐淹水稻品种。
鉴定oscbl10基因的两种启动子类型，包括水稻种子萌发耐涝型(t-type)和不耐涝型(i-type)。发明人发现，启动子上序列上的差异会造成表达量的差异，导致耐淹性上出现差异。oscbl10基因t-type、i-type型启动子差异如图2，标记为d1、d2、d3。图2显示了两个类型启动子的序列比对，图中所有low88行为一个t-type启动子，而所有up221行是一个i-type启动子。d1，d2，d3三个区段的序列上的差异已经包括了这个启动子差异的90％左右。每个区段都由两个相反的箭头标识出来，其他不在这三个区段的差异很小，可忽略不计。
检测发现，oscbl10基因t-type型启动子仅存在于粳型水稻中，而i-type型启动子存在于粳型旱稻、籼型水稻及旱稻中。
oscbl10基因的两种类型启动子影响该基因的表达，并对oscipk15蛋白的积累和稳定性起负作用。oscipk15是促进种子萌发的一个基因，降低它的含量会导致种子萌发耐淹性降低。根据发明人的研究发现，如果oscbl10基因的i-type启动子置换为t-type启动子，则oscipk15的含量和稳定性都会提高。
每个基因的表达都是由启动子来调控的，t-type启动子的oscbl10基因表达量会低一些，而i-type启动子下的oscbl10基因表达会高一些。根据这个发现，可以通过调控oscbl10的基因表达量，例如，可以利用基因编辑技术降低oscbl10的表达量来创造耐淹品种，还可以利用过表达的技术来创造出不耐淹的品种。
为了降低oscbl10基因表达量，实际可以有以下方法：
一种就是利用公知的转基因技术将i-type启动子置换成t-type启动子，也就是说将原来的i-type启动子和它后面的oscbl10编码基因突变掉之后同时转基因进去一个t-type启动子带oscbl10编码基因进去。t-type水稻品种的oscbl10基因表达量相对低一些，是该品种自身具有的特性。
另外一种方法则是利用公知的基因编辑技术对该i-type启动子后的编码基因，也就是oscbl10基因，进行编辑，降低其表达量，同样可以达到降低oscbl10基因表达量的目的。根据本发明，可以人为地降低表达量，对oscbl10基因进行改造，改造基因编码序列，来实现基因的表达量变化。针对i-type的品种中oscbl10基因编码序列进行改造后，尽管它的启动子还是i-type的，但是该品种的oscbl0基因表达量下调了，故也能表现出耐淹的特点来。
图3中a-f显示水稻cbl基因家族参与淹水胁迫下的种子萌发情况；图3a显示典型品种low88、up221种子萌发期间淹水条件下ca2+差异；图3b显示钙离子相关蛋白对两个水稻品种在淹水萌发的影响；图3c显示两水稻品种在空气(a)、淹水(f)处理下种子萌发时cbl基因的转录本丰度；图3d显示两水稻品种在淹水萌发时oscbl10基因的转录本丰度；图3e显示野生型(wt，nipponbar)和相应的oscbl10基因过表达系在淹水萌发时的表型；图3f显示野生型和oscbl10基因过表达系在种子萌发期间淹水条件下ca2+差异。
图4显示耐淹品种(low88)和不耐淹品种(up221)下游信号的活化；图4中a显示两水稻品种在空气(a)、淹水(f)处理下种子萌发时cipk基因的转录本丰度；图4中b、c显示oscipk15基因和osamy3基因在淹水处理后的转录本丰度；图4中d显示两品种在淹水萌发处理后α-淀粉酶活性变化。
图5显示oscbl10过表达系的鉴定及其低氧萌发表型鉴定，图5中a显示利用基因半定量技术检测不同oscbl10过表达株系中oscbl10基因的表达量；图5中b显示三个oscbl10基因过表达株系的水淹萌发表型。oscbl10过表达系种子萌发对淹水及低氧环境萌较野生型敏感。
oscbl10基因过表达株系种子萌发时对淹水及缺氧环境更为敏感，降低该基因表达量则可提高种子萌发时的耐淹性。因此,可以通过调控oscbl10的表达量来达到调控种子萌发耐淹性。具体地，可以利用基因编辑技术来降低oscbl10的表达量。
不同水稻品种来源的oscbl10基因编码序列存在差异。可以利用粳稻来源的oscbl10基因序列作为构建过表达植株的目标基因，命名为oecbl10。该目标基因扩增引物如下：
fp:atggactcctcccgctcctcc
rp:ctggggaacgccgctgtagt
结果如图5中所显示，oscbl10过表达的几个植株的耐淹性都要低于对照(野生型)材料，oscbl10过表达系种子萌发对淹水及低氧较野生型敏感。
种子萌发耐淹及不耐淹品种oscbl10基因启动子类型鉴定
参试品种见表1所示，包括粳稻及籼稻品种。并对其oscbl10基因启动子序列进行鉴定。耐涝型(t-type)启动子引物序列：
fp:gaatgagtggcaccagttgag
rp:cgtgagtgggttcgatacgat
不耐涝型(i-type)启动子引物序列：
fp:cccgtgatccttccatccgtag
fp:aatcccaacccaccacctaaca
结果显示：4个耐淹品种(low88、low60、low11、lown)具有t-type型启动子，其它不耐淹品种(low6、low63、up221、up502、up1、up3)具有i-typ型启动子。
表1不同品种水稻苗期耐淹性状研究
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。