本发明涉及生物检测领域，特别是一种检测人b-raf基因v600e突变的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
b-raf基因是一种癌基因，它编码丝/苏氨酸特异性激酶，是ras/raf/mek/erk/mapk信号通路最为关键的激活因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如结直肠癌、甲状腺癌、黑色素瘤和肺癌等均存在不同比例的b-raf突变。其中80-90％的突变为v600e(1799t>a)突变，进而导致t598和s601两个位点的磷酸化，使蛋白异常表达，从而影响肿瘤的进展。研究表明，b-raf基因突变的患者接受egfr-tki药物治疗的有效率低，而且b-rafv600e突变可导致部分kras基因野生型患者对egfr-tki药物治疗不敏感。
目前，关于b-raf基因突变检测的方法很多，已报道的方法包括测序法、arms-pcr法、snapshot法、数字pcr、荧光pcr-hrm法以及荧光pcr-探针法等。其中，测序法准确直接，但其灵敏度低；arms-pcr法操作简单，但容易污染；snapshot法和数字pcr方法灵敏度高，但需要昂贵的设备，不易于大范围推广；荧光pcr法是目前最常见的方法，结果准确、灵敏度高、不易污染、易于推广。
但目前基于荧光pcr平台检测b-raf基因v600e突变的方法仍有一些不足。比如hrm法的灵敏度不高，而且不易区分该位点的其它突变；探针法一般是基于arms-pcr的方法，灵敏度高于hrm法，但容易出现将野生型样本识别成突变型的情况。
因此，如何更好的区分突变样本和野生样本，是荧光pcr探针法的技术改进重点。目前常见的衍生方法和产品有：(1)在arms引物倒数第3个碱基引入一个额外的突变；(2)引入竞争性的blocker寡核苷酸序列，比如pna和lna技术，“锁住”部分野生型样本。但上述两种方法，在提高产品检测突变能力的同时，降低了pcr扩增的效率。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种检测人b-raf基因v600e突变的试剂盒及其检测方法。
实现上述目的本发明的技术方案为，一种检测人b-raf基因v600e突变的试剂盒及其检测方法，包括包括b-raf基因v600e突变检测混合液，所述b-raf基因v600e突变检测混合液包括b-raf基因v600e突变检测特异性引物对、b-raf基因特异性探针、竞争性抑制寡核苷酸序列、热稳定性dna聚合酶、热稳定性限制性内切酶、反应缓冲液和反应增强剂。
所述b-raf基因v600e突变检测特异性引物对的上游引物的核苷酸序列为：cacagtaaaaataggtgattttggtctagcttcgga，且其3’端第3位核苷酸引入脱氧鸟嘌呤突变，第5位核苷酸引入脱氧胸腺嘧啶突变，所述b-raf基因v600e突变检测特异性引物对的下游引物的核苷酸序列为：tccattttgtggatggtaagaattgaggctattt。
所述b-raf基因特异性探针的核苷酸序列为：catcgagatttctctgtagc，且序列两端修饰有荧光基团。
所述竞争性抑制寡核苷酸序列为：gctacagtgaaaictcgatg，该序列与b-raf基因特异性探针的核苷酸序列为反向互补，且序列突变位点下游第4位核苷酸进行脱氧次黄嘌呤修饰，序列3’端为封闭修饰基团。
所述b-raf基因特异性探针的5’端和3’端的荧光基团分别为fam和bhq-mgb。
所述竞争性抑制寡核苷酸序列的3’端的封闭修饰基团为bhq-mgb。
所述热稳定性dna聚合酶为taqdna聚合酶，所述热稳定性限制性内切酶为tspri。
所述反应缓冲液包括75mmtris-hcl(ph8.8)、10mmkcl、20mm(nh4)2so4、2.5mmmg-acetate、200μmdntps。
所述反应增强剂包括20nm单链结合蛋白(ssb)、22nmanti-taqmab、0.1％tritonx-100、100μg/mlbsa和1mmdtt。
在每次pcr反应中，样本应与阳性质控品与阴性对照(ntc：自备超纯水)共同进行分析，具体步骤包括如下：
步骤一，使用紫外分光光度计检测待测样品的基因组dna浓度，必要时对dna样本进行浓度调整，确保每个反应上样量大于10ng；
步骤二，从冰箱中取出试剂盒，室温下待各组分溶解后，涡旋器上混匀10秒，然后快速离心10秒；
步骤三，按每人份反应加入6μl反应液a和12μl反应液b的比例将两种反应混合液混合均匀，建议每次多算一人份的量混合；
步骤四，将待检的dna样品、阳性质控品及纯化水(ntc)依次取2μl加入pcr反应管中，然后小心盖上pcr反应管；
步骤五，离心pcr反应管备用；
步骤六，将pcr反应管放入实时pcr仪器；
步骤七，打开设置窗口，按照下面的扩增程序步骤进行设置：
第一阶段：95℃2min1个循环；
第二阶段：95℃15s60℃1min40个循环；
信号收集：第二阶段60℃时收集fam和vic信号,执行实时pcr，保存文件。
利用本发明的技术方案制作的一种检测人b-raf基因v600e突变的试剂盒及其检测方法，b-raf基因v600e位点突变的试剂盒可用于体外定性检测结直肠癌、甲状腺癌、黑色素瘤和肺癌等患者石蜡包埋病例组织中。联合采用arms-pcr荧光探针技术、竞争性抑制blocker技术、寡核苷酸修饰技术和tspri限制性酶切技术，可以更好的区分突变样本和野生样本，实现比同类技术或产品更好的检测灵敏性和特异性，实现快速、方便、灵敏、经济检测b-raf基因v600e位点突变，适合推广应用和产业化。
附图说明
图1是本发明所述b-raf基因突变检测原理图；
图2是本发明所述b-raf基因突变检测试剂盒上游引物引入额外双突变体系前后比较效果图；
图3是本发明所述b-raf基因突变检测试剂盒blocker引入mgb修饰和脱氧次黄嘌呤修饰前后比较效果图；
图4是本发明所述b-raf基因突变检测试剂盒是否将b-raf基因特异性探针和blocker设计成互补序列的比较效果图；
图5是本发明所述b-raf基因突变检测试剂盒对arms-pcr和限制性酶切同管双体系优化前后比较效果图；
图6是本发明所述本发明所述b-raf基因突变检测试剂盒检测为野生样本扩增图；
图7是本发明所述本发明所述b-raf基因突变检测试剂盒检测为突变样本扩增图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行具体描述，
参见附图1，本发明的用于检测b-raf基因突变的试剂盒，首次联合采用arms-pcr的荧光pcr探针技术、竞争性抑制blocker技术、寡核苷酸修饰技术和tspri限制性酶切技术，此步设计的优势在于：可以最大程度的满足检测的灵敏性和高效性。
参见附图2，本发明的用于检测b-raf基因突变的试剂盒，首次在arms-pcr上游引物第3位和第5位引入双碱基突变机制。在arms-pcr上游引物中3’端引入单碱基突变，是arms-pcr的常规手段；在第3位引入额外的突变，是arms-pcr技术的一种改进，但第3位引入突变会导致pcr扩增效率的下降。本发明在第3个位点外，进行了不同位置、不同碱的突变的比较筛选，最终确定在上游引物的3’端第3位碱基和第5位碱基引入突变，且第3位引入弱突变(将腺嘌呤突变成鸟嘌呤)、第5位引入强突变(将腺嘌呤突变成胸腺嘧啶)时效果最优。此步设计的优势在于：可以更好的区分野生型和突变型的dna，同时不影响pcr的正常扩增效率。
参见附图3，本发明的用于检测b-raf基因突变的试剂盒，首次在竞争性抑制blocker中，引入mgb修饰和脱氧次黄嘌呤修饰。在arms-pcr的基础上，在野生型位点引入寡核苷酸序列组成的blocker，对野生型模板的扩增进行竞争性的抑制阻断，是arms-pcr技术的一种改进。但blocker对于突变模板来说，也仅有一个核苷酸的差异，因此同样会对突变型模板的扩增造成抑制阻断。因此，本发明在blocker中引入了mgb修饰，且突变位点下游第4位核苷酸进行脱氧次黄嘌呤修饰，效果最优。此步设计的优势在于：1)mgb是dna小沟结合物，起到稳定dna双链的作用，因此同样tm值的寡核苷酸序列中，mgb修饰的blocker更短，比起更长的blocker，一个碱基改变所导致的野生型和突变型模板的结合力差异更大，因此野生型和突变型模板的区分效果更好；2)在blocker突变位点下游第4位核苷酸进行脱氧次黄嘌呤修饰，降低了blocker与突变型模板的结合力，同样可以起到更好区分野生型和突变型模板的效果，参见附图3。
参见附图4，本发明的用于检测b-raf基因突变的试剂盒，首次将b-raf基因特异性探针和blocker设计成互补序列，探针对应v600e位点的核苷酸为突变型。此步设计的优势在于：1)探针区域覆盖v600e位点，与野生型模板结合不充分，使得野生型模板的非特异性扩增不能产生荧光信号；2)探针与blocker互补，由于探针浓度高于模板浓度，blocker在体系中与寡核苷酸链结合的优先顺序为：野生型模板>突变型探针≥突变型模板，因此可以降低blocker对突变型模板的抑制阻断，参见附图4。
参见附图5，本发明的用于检测b-raf基因突变的试剂盒，首次对arms-pcr和限制性酶切同管双体系进行了优化。热稳定性限制性内切酶tspri可以特异性切割b-raf基因v600e野生型双链dna模板，因此可以用于b-raf基因v600e突变的检测。但如果先进行酶切处理后再扩增则使得操作过程繁琐，而同时进行则反应条件不一致。因此本发明为了将酶切过程和pcr过程置于同一管中同时进行，系统的优化了两种反应体系所需的成分和比例；同时引入了包含单链结合蛋白(ssb)、anti-taqmab、tritonx-100、bsa、dtt和海藻糖的反应增强剂，此步设计的优势在于：1)在arms-pcr反应的同时，热稳定性限制性内切酶tspri特异切割野生型模板，可以更好的避免对野生型模板的非特异性扩增；2)特殊优化的反应液体系和增强剂系统，除了使arms-pcr更加灵敏、高效之外，同时保证了tspri酶切体系的有效。
该试剂盒组成为包括：pcr反应液a、pcr反应液b和阳性质控品，如表1所示。不同批号试剂盒成分不可相互混用。试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分，推荐使用商业化的试剂盒来提取人类基因组dna(如qiaampdnaffpetissuekit)。
表1试剂盒主要组成成分
该试剂盒的具体检测步骤如下：
在每次pcr反应中，样本应与阳性质控品与阴性对照(ntc：自备超纯水)共同进行分析。
在每次pcr反应中，样本应与阳性质控品与阴性对照(ntc：自备超纯水)共同进行分析，具体步骤包括如下：
步骤一，使用紫外分光光度计检测待测样品的基因组dna浓度，必要时对dna样本进行浓度调整，确保每个反应上样量大于10ng；
步骤二，从冰箱中取出试剂盒，室温下待各组分溶解后，涡旋器上混匀10秒，然后快速离心10秒；
步骤三，按每人份反应加入6μl反应液a和12μl反应液b的比例将两种反应混合液混合均匀，建议每次多算一人份的量混合；
步骤四，将待检的dna样品、阳性质控品及纯化水(ntc)依次取2μl加入pcr反应管中，然后小心盖上pcr反应管；
步骤五，离心pcr反应管备用；
步骤六，将pcr反应管放入实时pcr仪器；
步骤七，打开设置窗口，按照下面的扩增程序步骤进行设置：
第一阶段：95℃2min1个循环；
第二阶段：95℃15s60℃1min40个循环；
信号收集：第二阶段60℃时收集fam和vic信号,执行实时pcr，保存文件。
试剂盒检测的结果判定方法如下：
1.阈值设定：确认未选择校正荧光参照，用户可根据实际情况调节阈值，令fam和vic信号阈值相等。建议阈值设定可参照阳性质控品，确保阈值在阳性质控品pcr扩增曲线的指数增长期，且令阳性质控品fam和vic信号的ct值在26～27左右。
2.阳性指控分析：所有阳性质控的ct值≤32.0，说明实验体系正常，可以继续分析。若在pcr扩增曲线的指数增长期内，无合适的阈值使得阳性质控的ct值≤32.0，说明实验体系异常，不应继续分析。
3.阴性指控分析：阴性对照信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析。
4.内标信号分析：若内标vic信号的ct值≤32.0，可以继续分析；若ct值>32.0,则说明样本dna含有pcr抑制剂或dna加入数量不够，不适合实验需要。
5.样本ct的计算，根据每个位点的ct值及有无s型扩增曲线，判定对应位点突变情况，具体结果判定见表2，参见附图6和附图7，其结论可以有效的检测实际临床样本。
表2结果判定
说明：△ct值＝样本ct值-内标ct值
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。