本发明涉及辅助疾病检测领域，具体地涉及一种检测试剂盒。
背景技术：
头颈部肿瘤是指自颅底到锁骨上，颈椎以前这样一个解剖范围的肿瘤，以恶性肿瘤为主。颈部肿瘤在综合性医院属于普通外科，比较常见的就是甲状腺肿瘤；耳鼻喉科肿瘤常见的有喉癌、副鼻窦癌等；口腔颌面部肿瘤常见的为各种口腔癌，如舌癌、牙龈癌、颊癌等。因此，头颈部所发生的肿瘤，其原发部位和病理类型之多，居全身肿瘤之首。
头颈部恶性肿瘤因其发病部位很多，因此其发病率在不同的国家、地区以及人种间都不相同。在美国华人中，男性发病率较高的是鼻咽癌，其次是甲状腺癌、口腔癌；女性发病率较高的是甲状腺癌，其次是鼻咽癌和涎腺肿瘤。在日本，男性发病率较高的是喉癌，其次是口腔癌；女性发病率较高的是甲状腺癌，其次是口腔癌。在我国，北京男性头颈部肿瘤发病率以喉癌占首位，其次为鼻咽癌和口腔癌；女性头颈部肿瘤发病率以甲状腺癌占首位，其次为口腔癌。而上海市统计资料显示，男性头颈部肿瘤发病率首位是鼻咽癌，其次为喉癌。女性头颈部肿瘤发病率首位是甲状腺癌，其次是鼻咽癌，头颈部肿瘤因其解剖复杂，组织病理类型繁多，一般常见鳞状上皮细胞癌，其次为各类腺癌、肉瘤少见。
癌症细胞的早期发现对于癌症的治疗及预防有十分重要的作用，本发明提供一种通过血清检测即可预测癌症的试剂盒，具有取样方便、检测方法简易、检测结果特异性高等特点，适用于日常体检、临床治疗等多种场景。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供提供一种检测试剂盒。
本发明是以如下技术方案实现的：
本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒可用于定量检测hsa-mirna-21，hsa-mirna-27a，hsa-mirna-25a，hsa-mirna-93，hsa-mirna-34a，hsa-mirna-223a，hsa-mirna-181a，hsa-mirna-121，hsa-mirna-97，hsa-mir-107、hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c、hsa-mir-30d、hsa-mir-7、hsa-mir-181a、hsa-mir-181b、hsa-mir-203、hsa-mir-210的表达量。
进一步地，所述试剂盒包括试剂盒本体，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量pcr试剂瓶；外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量pcr试剂瓶内装有实时荧光定量pcr试剂；所述外源性参照可采用u6序列，其工作浓度为5nmol，其作用在于监测从mirna提取到后续实时荧光定量pcr全过程的反应效率；所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μl的mmlv酶、10mmoldntp混合液、5×rt缓冲液、40单位/μl的rna酶抑制剂、10mmol的mgcl2、1μmol的特异的mirna的逆转录引物、mirna标准品，所述mirna标准品是指人工合成的mirna，浓度为100nmol，所述试剂盒包括下述mirna，所述mirna的cut-off值为hsa-mirna-97，cut-off值50%、hsa-mir-107，cut-off值30%、hsa-mir-192，cut-off值45%、hsa-mir-196a，cut-off值20%、hsa-mir-197，cut-off值65%、hsa-mir-148a，cut-off值20%、hsa-mir-30c，cut-off值40%、hsa-mir-30d，cut-off值50%，检测过程中上述mirna达到上述cut-off值时，即可判定阳性；所述实时荧光定量pcr试剂包括以下组份：10×taq缓冲液、10mmol的mgcl2、5单位/μl的taq聚合酶、10mmoldntp混合液、100ml无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和荧光探针，用于牙龈癌预测的mirna试剂盒的制备工艺和操作流程是基于定量pcr技术的，试剂盒包括常用的taq酶等，本试剂盒的价值在于能够提供精简的探针库以便检测血清样本中mirna的变化趋势，探针库包括实施例2中筛选出的mirna的反向互补序列，所述引物包括：
hsa-mirna-97-f：ttaagagacccctaactttaa(seqidno.1)
hsa-mirna-97-r：gaaagagagcctttggcga(seqidno.2)
hsa-mir-107-f：tcttttaaaacttgacatcgcg(seqidno.3)
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hsa-mir-30c-r：cctctaaatcctaaagttgggt(seqidno.14)。
进一步地，所述试剂盒用于检测hsa-mirna-97，hsa-mir-107、hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c的表达水平，当hsa-mirna-97，hsa-mir-107、hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c均达到cut-off值时，可以认为该样品来源有高罹患牙龈癌风险，需进行进一步排查，所述mirna的cut-off值为hsa-mirna-97，cut-off值50%、hsa-mir-107，cut-off值30%、hsa-mir-192，cut-off值45%、hsa-mir-196a，cut-off值20%、hsa-mir-197，cut-off值65%、hsa-mir-148a，cut-off值20%、hsa-mir-30c，cut-off值40%。
进一步地，所述试剂盒可用于辅助诊断甲状腺癌、口腔癌、喉癌、腭癌、牙龈癌、舌癌、唇癌，诊断样本为血清样本。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种检测试剂盒，mirna是细胞的基因调控系统中的重要组成，mirna作为癌症标记物是一种非侵入性取样，可以在无创条件下通过单独的mirna或mirna组合物的表达谱来辅助诊断被试者是否罹患癌症，提高诊断的准确率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：牙龈癌相关mirna的筛选
头颈癌样品来自南京医科大学收集的283个样本，样本类型为血清，血清以新鲜采集分离为好，采血6小时内分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用无rna酶的无菌微量离心管中。
获得了如下样本：甲状腺癌82例、口腔癌23例、喉癌31例、腭癌25例、牙龈癌59例、舌癌33例、唇癌30例。来自正常样品的rna由6个样品来源的rna混合（各来自6个正常的牙龈组织）组成，血清样本于2℃-8℃可稳定保存7天。
使用rna提取试剂盒（qiagenmirneasyminikit试剂盒）提取样品总rna，遵守厂商说明进行操作。然后在mirna微阵列芯片上进行rna标记和杂交。具体步骤如下：用5μg生物素标记来自各样品的rna，该芯片包含323个探针，包含245个人和小鼠mirna基因。使用perkin-elmerscanarrayxl5k对链霉素-alexa647缀合物进行基于生物素结合的杂交信号进行检测；用quantarray软件(perkinelmer)定量扫描图像，微阵列数据的统计学和生物信息学分析使用软件silicongenetics对原始数据进行标准化和分析。
将表达数据以中位数集中，用anova(方差分析)进行统计比较。使用pam软件(predictionanalysisofmicroarrays,获得自http://www.stat.stanford.edu/tibs/pam/index.html)(tibshirani,r.,等人proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:6567-6572(2002))和supportvectormachine(furey,t.s.,等人bioinformatics16:906-914(2000))软件确定用于预测牙龈癌的mirna，两种算法都用交叉验证和test-set检测。
根据微阵列分析获得与癌症进程有一定相关性的mirna共计156种，筛选出在牙龈癌中上调表达的mirna，具体地，如下所述hsa-mirna-21，hsa-mirna-27a，hsa-mirna-25a，hsa-mirna-93，hsa-mirna-34a，hsa-mirna-223a，hsa-mirna-181a，hsa-mirna-121，hsa-mirna-97，hsa-mir-107，hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c、hsa-mir-30d、hsa-mir-7、hsa-mir-181a、hsa-mir-181b、hsa-mir-203、hsa-mir-210。
实施例2：牙龈癌相关mirna的验证
1、牙龈癌样品来源如实施例1中所示，取trizolreagent(invitrogen，carlsbad，ca)提取各样品血清总rna，提取步骤如下：
步骤101、取6-8ml的血清，加入等体积的trizolreagent；
步骤102、相分离室温放置12min，然后按0.3ml氯仿/1.5mltrizolreagent的体积比加入氯仿，剧烈震荡25s，室温静置10min，于12000g，4℃离心10min；
步骤103、将水相转移到新的50ml离心管，苯酚/氯仿除去蛋白相二次；
步骤104、将水相转移到新的离心管中，按0.6ml异丙醇/1mltrizolreagent体积加入异丙醇，-20℃保存50min，于12000g，4℃离心60min；
步骤105、用2mltrizol重悬沉淀，将悬液转移到新的1.5ml的离心管中；
步骤106、重复2，4步(第四步离心改为15min)；
步骤107、rna洗涤去掉上清，加入75％乙醇，于12000g，4℃离心5min；
步骤108、测量获得的rna浓度，通常能得到浓度为8μgrna/100ml血清的血清总rna。
2、针对上述rna样品进行solexa测序，具体步骤如下：
步骤201、总rna进行page电泳回收16-29ntrna分子；
步骤202、将adaptorprime酶联在小rna分子的3’与5’端；
步骤203、进行rt-pcr反应后并进行测序；
步骤204、常规方法进行数据分析与处理。
3、real-timepcr方法具体操作步骤如下：
步骤301、取血清总rna，通过rna逆转录反应得到cdna样品；或者取血清样本，以血清样本作为缓冲液进行逆转录反应来制备cdna样品；
步骤302、用hsa-mirna-21，hsa-mirna-27a，hsa-mirna-25a，hsa-mirna-93，hsa-mirna-34a，hsa-mirna-223a，hsa-mirna-181a，hsa-mirna-121，hsa-mirna-97，hsa-mir-107、hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c、hsa-mir-30d、hsa-mir-7、hsa-mir-181a、hsa-mir-181b、hsa-mir-203、hsa-mir-210设计引物；
步骤303、加入荧光探针进行pcr反应；
步骤304、检测并比较正常人或牙龈癌患者样本中微小核糖核酸的量的变化，检测结果表明牙龈癌患者的血清中hsa-mirna-21，hsa-mirna-27a，hsa-mirna-25a，hsa-mirna-93，hsa-mirna-34a，hsa-mirna-223a，hsa-mirna-181a，hsa-mirna-121，hsa-mirna-97，hsa-mir-107、hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c、hsa-mir-30d、hsa-mir-7、hsa-mir-181a、hsa-mir-181b、hsa-mir-203、hsa-mir-210等mirna均有不同程度的过表达，从中筛选出7中显著过表达的mirna作为生物标志物进行癌症预测。
实施例3：用于辅助诊断牙龈癌的试剂盒的制备
本发明提供一种试剂盒，包括试剂盒本体，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量pcr试剂瓶；外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量pcr试剂瓶内装有实时荧光定量pcr试剂。
所述外源性参照可采用u6序列（rnu6-1rna,u6smallnuclear1[homosapiens]geneid:26827），其工作浓度为5nmol，其作用在于监测从mirna提取到后续实时荧光定量pcr全过程的反应效率；
茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μl的mmlv酶、10mmoldntp混合液、5×rt缓冲液（5×rt缓冲液由250mmoltris-hcl，375mmolkcl，15mmolmgcl2，50mmoldtt组成）、40单位/μl的rna酶抑制剂、10mmol的mgcl2、1μmol的特异的mirna的逆转录引物、mirna标准品（这里的mirna标准品是指人工合成的mirna，浓度为100nmol，本试剂盒包括下述mirna，所述mirna的cut-off值为hsa-mirna-97，cut-off值50%、hsa-mir-107，cut-off值30%、hsa-mir-192，cut-off值45%、hsa-mir-196a，cut-off值20%、hsa-mir-197，cut-off值65%、hsa-mir-148a，cut-off值20%、hsa-mir-30c，cut-off值40%、hsa-mir-30d，cut-off值50%），检测过程中上述mirna达到上述cut-off值时，即可判定阳性；
实时荧光定量pcr试剂包括以下组份：10×taq缓冲液(10×taq缓冲液包括100mmoltris-hcl，500mmolkcl）、10mmol的mgcl2、5单位/μl的taq聚合酶、10mmoldntp混合液、100ml无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和荧光探针。用于牙龈癌预测的mirna试剂盒的制备工艺和操作流程是基于定量pcr技术的，试剂盒包括常用的taq酶等，本试剂盒的价值在于能够提供精简的探针库以便检测血清样本中mirna的变化趋势，探针库包括实施例2中筛选出的mirna的反向互补序列。
所述引物包括：
hsa-mirna-97-f：ttaagagacccctaactttaa(seqidno.1)
hsa-mirna-97-r：gaaagagagcctttggcga(seqidno.2)
hsa-mir-107-f：tcttttaaaacttgacatcgcg(seqidno.3)
hsa-mir-107-r：ccgtaacactttaatggyacc(seqidno.4)
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hsa-mir-192-r：ttccatctttctattagctctctcaa(seqidno.6)
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本试剂盒用于检测hsa-mirna-97，hsa-mir-107、hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c的表达水平，当hsa-mirna-97，hsa-mir-107、hsa-mir-192、hsa-mir-196a、hsa-mir-197、hsa-mir-148a、hsa-mir-30c均达到cut-off值时，所述mirna的cut-off值为hsa-mirna-97，cut-off值50%、hsa-mir-107，cut-off值30%、hsa-mir-192，cut-off值45%、hsa-mir-196a，cut-off值20%、hsa-mir-197，cut-off值65%、hsa-mir-148a，cut-off值20%、hsa-mir-30c，cut-off值40%，可以认为该样品来源有高罹患牙龈癌风险，需进行进一步排查。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
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