一种兰州百合pr1基因定量检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】一种兰州百合病程相关蛋白PR1基因定量检测的试剂盒及其检测方法，试剂盒主要包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂、荧光定量PCR反应试剂以及阳性对照品和阴性对照品；特异性引物由兰州百合PR1基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成；阳性对照品为兰州百合PR1基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品；阴性对照品为DEPC水；本发明针对兰州百合PR1基因提供了一种快速、敏感、特异的定量检测试剂盒和检测方法，为兰州百合PR1基因的表达及检测诊断提供了技术支持。
【专利说明】
-种兰州百合PR1基因定量检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种兰州百合病程相关蛋白PR1基因定量检测的试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不 断积累，严重影响了产量和品质；其中百合斑驳病毒(LMoV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合隐 症病毒化SV)是最常见的S种病毒，感染率高达70%;病毒病造成百合种源严重退化，已是制 约百合产业发展的重要因素，如何对病毒实现有效防治是百合产业健康发展急需解决的关 键问题；目前，百合病毒防治技术非常落后，病毒防治主要采用杀灭传播介体晒虫的方法， 尽管能一定程度阻止病毒传播，然而已侵染的病毒仍会在百合上复制增殖;百合作为世界 著名的球根花弁，至今还未开发出有效的百合病毒抑制剂，关于病毒抑制剂抗百合病毒作 用机制的研究鲜有报道，使得现阶段对百合病毒病的防治非常盲目。
[0003] 通常病毒抑制剂抗植物病毒的作用方式有:抑制病毒侵染、抑制病毒增殖或诱导 寄主产生抗性;诱导抗性作为一种有效的抗病手段，已在许多病害体系中得到应用，已有研 究发现，某些病毒抑制剂可W诱导寄主产生抗病毒物质，提高寄主对病毒的抵抗力;江山等 ( 1996)发现病毒抑制剂可W诱导寄主产生病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs);PRs是植物体内的一类蛋白质，受病原体或其他外界因子的胁迫而诱导表 达，在植物抵御疾病、响应外界压力W及适应不良环境方面发挥着重要作用;根据病程相关 蛋白家族成员的氨基酸组成、结构及生物学功能等特点，将其分为17类，即PR1~PR17,其中 PR1被证实具有抗病毒扩散、限制真菌入侵和保护植物抵御逆境胁迫等功能;如在PRla转基 因烟草研究中发现，PR1基因 W组成型高效表达，导致烟草增加了对巧巾卵菌侵染的耐受 性;也有研究发现转辣椒PR1蛋白基因的烟草，表现出对重金属胁迫的抗性增强，同时也对 卵菌病原物W及细菌性病原物等多种病原菌的抗性增强；目前已经从多种植物中发现了 PR1蛋白，例如葡萄、烟草、番茄等;通常，PRs蛋白在健康植株中表现微弱，当被不同的诱导 因子诱导时迅速产生并积累，其与植物诱导抗性之间有密切的关联；因而研究病毒抑制剂 对PRs蛋白的诱导能力，是了解抗病毒制剂对植物是否具有诱导抗性作用的一个重要内容。
[0004] 在我们对百合抗病毒技术的开发研究中，初步筛选了2种适用于大田的百合病毒 抑制剂，其对兰州百合主要病毒CMV的复制均有较好的抑制作用；同时，从病毒感染的兰州 百合植株中也检测到了 PR1基因的表达;为了进一步明确病毒抑制剂对PR1基因表达的影 响，本研究建立了一种兰州百合病程相关蛋白PR1基因定量检测的试剂盒及检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种兰州百合PR1基因定量检测的试剂盒及检测方法。
[0006] 技术方案如下： 一种兰州百合PR1基因定量检测的试剂盒，主要包括特异性引物、第一链cDNAs合成试 剂W及巧光定量PCR反应试剂，特异性引物由兰州百合PR1基因和内参18S rRNA基因的特异 性引物组成，特异性引物的序列如下： 兰州百合PR1 基因上游引物Pl:5'- GCCACTACACGCAGGTTGTG -3' 兰州百合PR1 基因下游引物P2:5' -GCCTCTCGCCGACGTAATTC -3' 内参 18S rRNA基因上游引物P3:5'- GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3' 内参 18S rRNA基因下游引物P4:5' -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3' 其中，扩增兰州百合PR1基因的片段长度为126bp，扩增内参18S rRNA基因片段长度为 mbp。
[0007] 本发明的关键在于扩增引物的设计。
[0008] 为达到定量检测的要求，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照 品为兰州百合PR1基因标准品W及内参18S rRNA基因标准品，阴性对照品为DEPC水；阳性对 照品序列如下： 兰州百合PR1基因标准品： 邑CC曰Ct曰C曰C邑C曰邑邑tt邑t邑t邑邑C邑邑曰邑C曰CCC邑CC邑曰etc邑邑Ct邑C邑C曰曰邑邑邑t邑邑ttt邑t邑曰C邑邑C邑邑C邑曰 tgtgttc曰tg曰曰ctgc曰曰ct曰eg曰cccgccgggg曰曰tt曰cgtcggcg曰g曰ggc; 内参18S rRNA基因标准品： gggg曰曰曰ett曰CC曰ggtcc曰g曰C曰t曰gt曰曰gg曰ttg曰C曰g曰ctg曰g曰gctctttcttg曰ttet曰tgggtggtg 邑t邑cat邑邑CC邑ttetta邑tt邑邑t邑邑a邑C邑attt邑tet邑。
[0009] 可将上述阳性对照品序列构建到质粒载体中，测定质粒浓度后换算为拷贝数，然 后用双蒸水将阳性质粒进行10倍梯度稀释，W10倍系列稀释的质粒溶液作为模板进行巧光 定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得待测样 品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即可获得待测样品起始cDNAs的精确拷贝数，再经过内参 校正后最终获得待测样品PR1基因的标准拷贝数。
[0010] 本发明还设及W上所述的检测兰州百合PR1基因表达的试剂盒的检测方法，其包 括的步骤如下： 步骤① W兰州百合叶片、茎杆或种球为待测样品，提取总RNA，进行反转录RT反应合成 cDNAs； 步骤②巧光定量PCR: W待测样品cDNAs作为模板，用检测PR1基因表达的上下游引物、 检测内参基因18S rRNA表达的上下游引物分别进行巧光定量PCR扩增；WDEPC水为阴性对 照于相同条件下进行PCR扩增； 步骤③数据采集与分析:上述步骤②反应结束后，利用计算机分析软件自动获得扩增 曲线和溶解曲线，W阔值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阔值线，若待测样品巧光 增长曲线超过阔值线，并呈良好的对数增长，且溶解曲线形成单一的溶解峰，则判断为阳 性。
[0011] 定量检测时，所述检测方法同时W10倍系列稀释的兰州百合PR1基因和18S rRNA 基因标准品的质粒溶液进行巧光定量PCR检测，分别根据拷贝数的对数值与各标准品Ct值 的关系绘制得到标准曲线，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照相应标准曲线获得待测样品 cDNAs中PR1基因和18S rRNA基因的起始模板拷贝数，按照W下公式得到经过内参归一化校 正后的待测样品PR1基因的标准拷贝数：
其中，所述标准品序列如下： 兰州百合PR1基因标准品： 邑CC曰Ct曰C曰C邑C曰邑邑tt邑t邑t邑邑C邑邑曰邑C曰CCC邑CC邑曰etc邑邑Ct邑C邑C曰曰邑邑邑t邑邑ttt邑t邑曰C邑邑C邑邑C邑曰 tgtgttc曰tg曰曰ctgc曰曰ct曰eg曰cccgccgggg曰曰tt曰cgtcggcg曰g曰ggc; 内参18S rRNA基因标准品： gggg曰曰曰ett曰CC曰ggtcc曰g曰C曰t曰gt曰曰gg曰ttg曰C曰g曰ctg曰g曰gctctttcttg曰ttet曰tgggtggtg 邑t邑cat邑邑CC邑ttetta邑tt邑邑t邑邑a邑C邑attt邑tet邑。
[001 ^ 优选的，所述步骤①中反转录RT程序为:待测样品总RNA与PR1基因下游引物P2和 18S rRNA基因下游引物P4混合后，70°C变性lOmin，迅速置冰上急冷2min;再加入反转录RT 缓冲液、dNTP混合物和反转录酶等，于42°C水浴化，70°C保溫15min，制成待测样品cDNAs， 置冰上待用。
[0013] 优选的，所述步骤②中巧光定量PCR反应程序为：95°C 30sec，95°C 5sec，60°C 30sec，35个循环;95°C 15sec，60°C lmin，95°C 15sec;上述反应结束后，利用计算机分析 软件自动获得标准曲线、扩增曲线和溶解曲线。
[0014] 本发明针对兰州百合PR1基因提供了一种快速、敏感、特异的定量检测试剂盒和检 巧巧法，为兰州百合PR1基因的表达及检测诊断提供了重要的技术支持。
【附图说明】
[001引图1:兰州百合PR1基因标准品巧光定量PCR扩增曲线图；1-5分别对应:5.87 X 108copies/]iL、5.87Xl〇7 copies/]iL、5.87Xl〇6 copies/]iL、5.87Xl〇5 copies/]iL、5.87Xl〇4 copies/jiL 标准品。
[0016]图2:兰州百合18S rRNA基因标准品巧光定量PCR扩增曲线图；1 -6分别对应:3.29 Xl〇9 copies/]iL、3.29Xl〇8 copies/]iL、3.29Xl〇7 copies/]iL、3.29Xl〇6 copies/]iL、3.29 X l〇5 copies/]iL、3.29X l〇4 copies/uL标准品。
[0017]图3:兰州百合PRl基因标准品巧光定量PCR标准曲线图。
[001引图4:兰州百合18S rRNA基因标准品巧光定量PCR标准曲线图。
[0019 ]图5:兰州百合PR1基因标准品巧光定量PCR溶解曲线图。
[0020] 图6:兰州百合18S rRNA基因标准品巧光定量PCR溶解曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，W使本领域的技术人员可W更好的 理解本发明并能予W实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0022] 标准品的获得 1、总RNA的提取 将50mg感染CMV和LSV的兰州百合叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒(天根生 化科技(北京)有限公司)进行感病组织总RNA的提取。
[0023] 2、引物设计与合成 根据中国科学院寒区旱区环境与工程研究所皋兰生态与农业综合试验站微生物实验 室首次从兰州百合上克隆的PR1基因序列，W及GenBank上登录的百合18S rRNA基因序列 (GenBank登录号：D29775)设计了2对特异性引物P1、P2及P3、P4,由生工生物工程(上海） 股份有限公司合成。
[0024] 3、阳性标准品的制备 1)RT反应 利用兰州百合PR1下游引物P2、内参18S rRNA下游引物P4 W及M-MLV反转录酶进行RT反 应，合成cDNAs第一链。
[0025] 10化RT反应体系如下：2化总RNA，PR1下游引物P2、18S rRNA下游引物P4(各lOy mol/L)各化L，化L DEPC-此0,70°C变性10 min,迅速置冰上急冷2 min;再加入化L M-MLV buffer 巧X)，化L dNTP混合物（各 10mmol/L)，0.3化L RNase抑制剂（3011/化），0.3扣L M- MLV反转录酶（200U /化）和0.3化L DEPC-H20;混合后42°C水浴lh，70°C保溫15 min,置冰上 待用。
[0026] 2)PCR 反应 利用上述cDNAs为模板，在rag DNA聚合酶作用下分别进行PR1和18S rRNA基因的PCR 扩增。
[0027] PCR反应体系为25化，包括：1化cDNAs(约50ng)，0.化L Tag DNA聚合酶巧U/y 1)，2.化1 10XPCR buffer,化L dNTP混合物（各2.5mmol/L)，0.5化上游引物P1 或P3(l化 mol/L)，0.5化下游引物P2或P4( 10皿ol/L)，18.3化 d地2〇。
[002引 PCR扩增条件为：94°C预变性4min; 94 °C变性30s，60 °C退火45s，72 °C延伸Imin，循 环扩增30次，最后72°C延伸7min。
[0029] PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，按照克隆载体试剂盒(大 连宝生物(TaKaRa)工程有限公司）的说明将目的片段连接在PMD18-T载体上，转化D册a感受 态细胞，进行蓝白斑平板筛选;随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨节LB培养基上，37 °C摇 菌12~16h;使用(大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司）的质粒微量抽提试剂盒提取质粒;分 另峨化L质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增;将PCR检测得到的阳性重 组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序;测序证实序列完全正确的阳性质粒， 即为标准品，兰州百合PR1和18S rRNA基因对应的片段长度分别为126bp和lllbp;用 NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析仪测定标准品的0〇26日nm和0〇28日加1值，根据0〇26日加1和 OD28〇nm值计算质粒浓度，换算为拷贝数/体积，然后用双蒸水将标准品进行10倍梯度稀释。
[0030] 4、结果： 经测序，上述设计的标准品与预期完全相符，10倍系列稀释的PR1基因标准品的浓度范 围为：5.87X 104~5.87X 108 copies/化；18S rRNA基因标准品的浓度范围为:3.29X 104~ 3.29X 109 copies/化;回收的标准品片段序列如下： 兰州百合PR1基因标准品序列： 邑CC曰Ct曰C曰C邑C曰邑邑tt邑t邑t邑邑C邑邑曰邑C曰CCC邑CC邑曰etc邑邑Ct邑C邑C曰曰邑邑邑t邑邑ttt邑t邑曰C邑邑C邑邑C邑曰 tgtgttc过tg过过ctgc过过ct过eg过cccgccgggg过过tt过cgtcggcg过g过ggc; 兰州百合18S rRNA基因标准品序列： gggg过过过ett过CC过ggtcc过g过C过t过gt过过gg过ttg过C过g过ctg过g过gctctttcttg过ttet过tgggtggtg 邑t邑cat邑邑cc邑ttctta邑tt邑邑t邑邑a邑c邑attt邑tct邑。
[0031 ]巧光定量PCR检测兰州百合PRl基因表达方法的建立 1、待测样品总RNA提取及cDNAs合成 采用天根生化科技(北京)有限公司的植物总RNA提取试剂盒，按照说明书提取待测兰 州百合叶片的总RNA，根据实施例1中RT第一链cDNAs合成体系，将RNA反转录为cDNAs。
[0032] 2、巧光定量PCR反应 W上述cDNAs为模板，用兰州百合PR1基因上下游引物P1、P2及内参18S rRNA基因上下 游引物P3、P4分别在Stra化gene公司的Mx3000p巧光定量PCR仪上进行PCR扩增。
[0033] PCR反应液组成如下： 上述cDNAs模板 化1 SYBR Premix Ex 7a/^(2X) lOyL 上游引物(PI或P3) 0.化L 下游引物（P2或P4) 0.化L Rox Reference Dye II (50X ) 0.化1 PCR-grade water 6.8yL PCR反应条件为:95°C 30sec，95°C 5sec，60°C 30sec，35个循环;95°C 15sec，60°C lmin，95°C 15sec。上述反应结束后，利用计算机分析软件自动获得待测样品PRl基因和18S rRNA基因的扩增曲线和溶解曲线。
[0034] WDEPC水为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，若待测样品cDNAs模板的巧光增 长曲线超过阔值线，并呈良好的对数增长，且溶解曲线形成单一的溶解峰，则判断为阳性。
[0035] 同时，在相同条件下W10倍系列稀释的PR1标准品和18S rRNA标准品进行扩增，并 分别绘制标准曲线。
[0036] 测得待测样品cDNAs的Ct值后，分别对照相应的标准曲线获得待测样品cDNAs中 PR1基因 W及18S rRNA基因的起始模板拷贝数，按照W下公式得到经过内参归一化校正后 的待测样品PR1基因的标准拷贝数：
[0037] 检测结果 兰州百合PR1基因和18S rRNA基因标准品的巧光定量PCR扩增曲线结果参见图1和图2， PRl基因标准品浓度分别为l:5.87X 108 copiesA^L、2:5.87X107copiesA^L、3:5.87X106 copies/iiL、4:5.87Xl〇5 copies/iiL、5:5.87Xl〇4 copies/化;18S rRNA基因标准品浓度分 别为l:3.29X 109 copies/liL、2:3.29X 108 copies/liL、3:3.29X107copies/liL、4:3.29X 1〇6 copies/]iL、5:3.29Xl〇5 copies/]iL、6:3.29Xl〇4 copies/uL。
[003引图3和图4分别为兰州百合PRl基因和18S rRNA基因对应的标准曲线，其中PRl基因 回归方程:Y =-3. ：346礼0G(X)+45.54，RSq: 0.998，PCR的扩增效率为99.0%; 18S rRNA基因 回归方程:￥=-3.113礼06(乂)+40.61，1?59:0.999，口〔如勺扩增效率为109.5%;其中￥:对应 的Ct值;X:基因的精确拷贝数。
[0039] 图5和图6分别为兰州百合PR1基因和18S rRNA基因的溶解曲线，其中PR1基因和 18S rRNA基因的目的产物溶解溫度分别在88°C和83°C左右，扩增产物单一，形成特异的溶 解峰，没有杂峰出现，且峰值较为一致，说明本发明定量结果准确、可靠。
[0040]根据巧光检测的Ct值W及扩增曲线和溶解曲线，判断待测样品PR1基因是否有表 达;若巧光检测结果呈典型的扩增曲线和溶解曲线，如图1和图5所示，判断为阳性，所测样 品中PR1基因有表达，PR1基因的表达量可根据上述PR1基因的标准拷贝数公式计算得到;若 没有典型的扩增曲线和溶解曲线，则判断为阴性，所测样品中PR1基因无表达。
【主权项】
1. 一种兰州百合PR1基因定量检测试剂盒，包括特异性引物、第一链cDNA合成试剂以及 荧光定量PCR反应试剂，所述特异性引物由兰州百合PR1基因和内参18S rRNA基因的特异性 引物组成，所述特异性引物的序列如下： 兰州百合PR1 基因上游引物Pl:5'_ GCCACTACACGCAGGITGTG -3' 兰州百合PR1 基因下游引物P2:5' -GCCTCTCGCCGACGTAAITC -3' 内参 18S rRNA基因上游引物P3:5'_ GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3' 内参 18S rRNA基因下游引物P4:5' -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3'； 其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为兰州百合 PR1基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品，所述阴性对照品为DEPC水;所述阳性对照品 序列如下： 兰州百合PR1基因标准品：内参18S rRNA基因标准品：其特征在于将上述阳性对照品序列构建到质粒载体中，测定阳性质粒浓度后换算为拷 贝数，然后用双蒸水将上述阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液 作为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对 数值与标准品Ct值的关系可绘制得到PR 1基因和18S rRNA基因的标准曲线；同时将待测样 品提取总RNA后进行反转录RT反应，以合成的cDNAs为模板，应用上述特异性引物P1、P2及 P3、P4在相同条件下进行荧光定量PCR扩增，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即 可获得待测样品起始cDNAs中PR1基因和18S rRNA基因的精确拷贝数，再经过内参校正后最 终获得待测样品PR1基因的标准拷贝数。2. 根据权利要求1所述的兰州百合PR1基因定量检测试剂盒，其中兰州百合PR1基因标 准品质粒浓度为5.87 X 108 copies/yL;内参18S rRNA基因标准品质粒浓度为3.29 X 109 copies/yLo3. -种如权利要求1所述的兰州百合PR1基因定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于 包括如下步骤： 步骤①以兰州百合叶片、茎杆或种球为待测样品，提取总RNA，进行反转录RT反应合成 cDNAs; 步骤②荧光定量PCR:以待测样品cDNAs作为模板，用兰州百合PR1基因和内参18S rRNA基因的特异性引物P1、P2以及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增；以DEPC水为阴性对照 于相同条件下进行荧光定量PCR扩增;所述检测方法同时以10倍系列稀释的PR1基因和18S rRNA基因的标准品进行荧光定量PCR扩增； 步骤③数据采集与分析:上述步骤②反应结束后，分别根据拷贝数的对数值与各标准 品Ct值的关系绘制得到PR1基因和18S rRNA基因的标准曲线;利用计算机分析软件自动获 得待测样品PR1基因和18S rRNA基因的扩增曲线以及溶解曲线，若待测样品PR1基因荧光增 长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，且溶解曲线形成单一的溶解峰，则判断为阳性， 所测样品中PR1基因有表达； 若没有典型的扩增曲线和溶解曲线，则判断为阴性，所测样品中PR1基因无表达； 若判断阳性样品中PR1基因的表达量，可将测得的阳性样品cDNAs的Ct值分别对照相应 的标准曲线获得cDNAs中PR1基因以及18S rRNA基因的精确拷贝数，按照以下公式得到经过 内参归一化校正后的阳性样品PR1基因的标准拷贝数：
【文档编号】C12Q1/68GK106048067SQ201610673491
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月16日 公开号201610673491.5, CN 106048067 A, CN 106048067A, CN 201610673491, CN-A-106048067, CN106048067 A, CN106048067A, CN201610673491, CN201610673491.5
【发明人】张玉宝, 王亚军, 谢忠奎, 王乐, 王若愚, 杨果, 郭志鸿, 邱阳
【申请人】中国科学院寒区旱区环境与工程研究所