一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗和制备方法与流程

文档序号：15264222发布日期：2018-08-24 22:43阅读：293来源：国知局

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的病毒疫苗和制备方法。

背景技术：

非小细胞肺癌，属于肺癌的一种，它包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比，其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占肺癌总敉的80～85％。临床上非小细胞肺癌的症状表现发热、胸痛、气促、咳嗽、血痰等。很多人都会因为不了解该病初始症状的具体情况而出现误诊，尤其是咳嗽，该症状主要是由于肺部的恶性肿瘤细胞，也即癌细胞持续的刺激患者的呼吸道引发的。

目前，手术、化疗、放疗等传统疗法对于早期非小细胞肺癌具有一定的疗效，但一方面化疗、放疗具有较大的副作用，另一方面由于许多肿瘤发现较晚，往往失去手术治疗的最佳机会，所以通过增强机体免疫系统的抗肿瘤作用杀灭肿瘤细胞、达到治疗肿瘤目的的免疫与基因疗法作为肿瘤治疗的一种新模式，成为肿瘤治疗和免疫学研究的热点。

mage基因的表达产物中mage-3蛋白是肿瘤特异性抗原的典型代表。mage-3是广泛存在于多种肿瘤的肿瘤特异性抗原，在正常组织中除了胎盘和睾丸低水平表达外，在其他正常成熟组织均不表达，而睾丸是免疫豁免器官，所以，mage-3是一种理想的肿瘤相关抗原，可以作为多种肿瘤免疫治疗的靶点。但是mage-3作为非小细胞肺癌抗原制备疫苗，由于抗原肽的表位有限，不能包括所有的免疫位点、人工合成的抗原肽的空间结构可能与自然产生的抗原空间结构不同，妨碍产生正常的免疫反应或存在免疫性较低的问题，大大影响免疫治疗。

尽管现有技术中常常采用两种细胞抗原融合得到融合蛋白，但是融合蛋白在体外致敏dc的效率一般较低，dc在摄取分子肽后，往往不能有效递呈抗原并激发特异性的ctl，因此如何增强dc对抗原的加工递呈，以期更有效地激发肿瘤抗原特异性的免疫应答仍然是肿瘤免疫治疗研究中亟待解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗和制备方法，使所述融合蛋白具有较强的免疫性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种融合蛋白，包括黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族a3抗原元件；所述黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族a3抗原元件之间还包括连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。

优选的，所述黏蛋白1抗原元件具有如序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列；所述黑素瘤抗原家族a3抗原元件具有如序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列；

所述连接肽具有如序列表中seqidno.3所示的氨基酸序列。

优选的，所述融合蛋白具有如序列表中seqidno.4或seqidno.5所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种融合蛋白的编码基因，编码所述的融合蛋白。

优选的，所述编码基因具有如序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列或具有如序列表中seqidno.7所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

1)将所述的编码基因克隆到穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒；

2)用mva病毒感染细胞，培养90～120min，得到感染细胞；

3)将所述重组穿梭质粒与所述感染细胞混合，37℃培养24～48h，得到单层细胞；

4)反复冻融所述单层细胞2～3次，将冻融的细胞破碎处理2～5次，固液分离，得到上清液；

5)将所述上清液接种细胞，培养，将得到的病变细胞破碎、分离上清液，得到用于治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。

优选的，所述步骤2)中培养的时间为100min。

优选的，所述步骤1)的穿梭质粒为piiidhr-p7.5。

优选的，所述步骤3)中培养的时间为36h。

本发明提供了所述的构建方法得到的重组病毒疫苗，包括所述的融合蛋白的编码基因。

本发明提供了一种融合蛋白，包括黏蛋白1(muc1)抗原元件和黑素瘤抗原家族a3(mage-a3)抗原元件和位于黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族a3抗原元件之间的连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。所述融合蛋白具有两者的生物学功能，既具有黏蛋白1的免疫原性，又具有黑素瘤抗原家族a3的免疫原性，且所述融合蛋白质可以在两种抗原元件的协同下增强抗肿瘤的效果，维持周期长，免疫宿主广泛，不需要添加佐剂为抗肿瘤等治疗提供新方向。

本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗的构建方法，操作简便，重复性好，适合工厂化生产。

本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗，能够诱导小鼠体内产生特异性免疫反应，并且真核细胞具有天然相似的构象，从而可以被天然蛋白诱生的抗体所识别。

附图说明

图1为实施例5中不同重组病毒疫苗在细胞中产生抗体的westernblot结果；

图2为实施例6中不同重组病毒疫苗免疫小鼠产生的抗体滴度结果折线图。

具体实施方式

本发明提供了一种融合蛋白，包括黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族a3抗原元件和位于黏蛋白1抗原元件和黑素瘤抗原家族a3抗原元件之间的连接肽；所述连接肽的氨基酸个数为0～20个。

在本发明中，所述连接肽的氨基酸个数优选为4～15个，更优选为6个。所述连接肽的氨基酸种类优选为疏水性强的氨基酸，例如ser或gly。

在本发明中，所述黏蛋白1抗原元件优选具有如序列表中seqidno.1所示的氨基酸序列；所述黑素瘤抗原家族a3抗原元件优选具有如序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列；所述连接肽具有如序列表中seqidno.3所示的氨基酸序列。在本发明中，所述融合蛋白优选具有如序列表中seqidno.4或seqidno.5所示的氨基酸序列。为了便于分离得到融合蛋白，将所述融合蛋白上添加筛选标签。所述标签包括6个组氨酸形成的寡肽。

本发明提供了一种融合蛋白的编码基因，编码所述的融合蛋白。

在本发明中，所述编码基因优选具有如序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列或具有如序列表中seqidno.7所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

1)将上述方案所述的编码基因克隆到穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒；

2)用mva病毒感染细胞，培养90～120min，得到感染细胞；

3)将所述重组穿梭质粒与所述感染细胞混合，37℃培养24～48h，得到单层细胞；

4)反复冻融所述单层细胞2～3次，将冻融的细胞破碎处理2～5次，固液分离，得到上清液；

5)将所述上清液接种细胞，培养，将得到的病变细胞破碎、分离上清液，得到用于治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。

本发明将上述方案提供的编码基因克隆到穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒。

在本发明中，所述克隆用引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物为cagatctggagccacagccccggt(seqidno.8)，其中划横线的部分为bg1ii的酶切位点；所述反向引物为caagcttggtcactcctcgtctttac(seqidno.9)，其中划横线部分为hindiii的酶切位点。采用所述正向引物和反向引物扩增的编码基因中引入双酶切位点，便于后续克隆到质粒。

所述编码基因的克隆过程中，退火温度优选为65℃。本发明对所述克隆的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的克隆方法即可。

本发明将克隆得到的编码基因进行bg1ii/hindiii酶切，得到酶切片段。同时将质粒采用同样方法进行双酶切，将质粒酶切产物和编码基因的酶切产物进行连接，得到重组穿梭质粒。在本发明中，所述连接采用常规方法进行。所述穿梭质粒为piiidhr-p7.5。本发明对所述piiidhr-p7.5的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知方法即可。

本发明用mva病毒感染细胞，培养90～120min，得到感染细胞。

在本发明中，用于所述转染的细胞优选为cef细胞或bhk-21细胞。

在本发明中，所述培养的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养条件方法即可。所述培养的时间优选为100min。

得到感染细胞后，本发明将所述重组穿梭质粒与所述感染细胞混合，37℃培养24～48h，得到单层细胞。

在本发明中，所述培养的时间优选为32～40d，更优选为36d。

本发明对所述混合没有特殊限制，采用本领域所熟知的混合方案即可。将重组穿梭质粒与所述感染细胞混合后，感染细胞中的mva病毒与穿梭质粒中的目标基因整合，得到的单层细胞中包装得到含有目标基因的mva重组病毒。

得到单层细胞后，本发明反复冻融所述单层细胞2～3次，将冻融的细胞破碎处理2～5次，固液分离，得到上清液。

所述固液分离优选为离心。所述离心的转速优选为1000～3000rpm，更优选为3000rpm。所述离心的时间优选为5～10min。

得到上清液后，本发明将所述上清液接种细胞，培养，将病变后的细胞破碎，分离，得到用于治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。

在本发明中，所述细胞优选为cef细胞或bhk-21细胞。

在本发明中，所述培养的时间优选为5～10d。

在本发明中，所述重组病毒质粒经线性化进入宿主细胞中，在宿主细胞中包装，成毒，得到用于治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。

本发明提供了上述的构建方案得到的重组病毒疫苗，包括所述的融合蛋白的编码基因。

本发明对所述重组病毒疫苗的使用方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的病毒疫苗的使用方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的病毒疫苗和制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.1人黏蛋白1(muc1)cdna的克隆：

收集muc1阳性人非小细胞肺癌细胞，利用细胞总rna抽提试剂trizol(invitrogen公司)制备细胞总rna，利用amv逆转录酶(promega公司)合成第一链，以其为模板，用序列如下的5’和3’端的pcr寡核苷酸引物进行扩增，得到编码muc1的dna片段。

pcr反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ggtaccagccacagccccggt-3’(seqidno：10)；横线处含有kpni限制性内切酶的酶切位点；

3’端引物序列为：

5’-gtcgacggtgctatggctggc-3’(seqidno：11)；横线处含有sali限制性内切酶的酶切位点。

反应参数为：95℃30秒，62.5℃30秒，72℃50秒，28循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为387bp。反应体积为50μl，引物浓度为200nm，dntp的浓度为200μm，镁离子浓度为1.5mm。扩增产物行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。pcr产物按常规方法与市售的pgem-t载体(购自promega公司)重组并转化至感受态大肠杆菌bl21，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(abi公司的377型测序仪，bigdyeterminator试剂盒，pe公司)。进行全自动dna测序。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的muc1编码序列。重组子记为pgem-t-muc1。以pgem-t-muc1为模板，用上述引物进行扩增，得到的pcr产物纯化后经sali单酶切，然后纯化酶切产物。

1.2muc1-mage-a3重组表达质粒的构建：

收集mage-a3阳性人非小细胞肺癌细胞，利用细胞总rna抽提试剂trizol(invitrogen公司)制备细胞总rna，利用amv逆转录酶(promega公司)合成第一链，以其为模板，用序列如下的5’和3’端的pcr寡核苷酸引物进行扩增，得到编码和黑素瘤抗原家族a3(mage-a3)的dna片段。

pcr反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-gtcgaatgcctcttgagcag-3’(seqidno12)，该引物横线处为sali限制性内切酶的酶切位点；

3’端引物序列为：

5’-ggtaccgaggagcagaaatg-3’(seqidno13)，该引物横线处为kpni限制性内切酶的酶切位点。

反应参数：95℃15秒，55.6℃30秒，72℃40秒，29循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为369bp，pcr产物纯化后经sali单酶切，酶切产物使用试剂盒进行纯化。

将muc1与mage-a3的酶切纯化产物在t4dna连接酶(takara公司)的作用下16℃水浴过夜连接，所得的连接产物1∶500稀释后作为模板，用序列如下的5’和3’端的pcr寡核苷酸引物进行扩增，得到编码muc1-mage-a3的dna片段。

pcr反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ggtaccagccacagccccggt-3’(seqidno10)；横线处含有kpni限制性内切酶的酶切位点；

3’端引物序列为：

5’-ggtacctcagaggagcag-3’(seqidno11)，该引物横线处为kpni限制性内切酶的酶切位点。

反应参数为：95℃30秒，64.9℃30秒，72℃45秒，35循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为574bp。将获得的pcr产物纯化后经scai-kpni酶切再与质粒pqe30(购自qiagen公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌宿主菌m15(prep4)(购自qiagen公司)，挑取阳性克隆，经scai-kpni酶切鉴定后纯化并测序(abi公司的377型测序仪，bigdyeterminator试剂盒，pe公司)。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的muc1-mage-a3编码序列，插入位置与读框也全部正确。重组子记为pqe30-muc1-mage-a3。

酶切鉴定结果显示，经scai-kpni酶切鉴定，电泳结果显示，阳性克隆被切下一条约1128bp的插入片段(seqidno7)。

实施例2

1.1人黏蛋白1(muc1)cdna的克隆：

pcr反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ggtaccagccacagccccggt-3’(seqidno10)；横线处含有kpni限制性内切酶的酶切位点；

3’端引物序列为：

5’-gtcgacggtgctatggctggc-3’(seqidno11)；横线处含有sali限制性内切酶的酶切位点。

反应参数为：95℃30秒，62.5℃30秒，72℃50秒，35循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为387bp。反应体积为50μl，引物浓度为200nm，dntp的浓度为200μm，镁离子浓度为1.5mm。扩增产物行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。pcr产物按常规方法与市售的pgem-t载体(购自promega公司)重组并转化至感受态大肠杆菌bl21，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(abi公司的377型测序仪，bigdyeterminator试剂盒，pe公司)。进行全自动dna测序。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的muc1编码序列。重组子记为pgem-t-muc1。以pgem-t-muc1为模板，用上述引物进行扩增，得到的pcr产物纯化后经sali单酶切，然后muc1纯化酶切产物。

1.2人黏蛋白1(muc1)-连接肽的dna片段的构建

将合成的连接肽核苷酸序列(seqidno14：agcggaagcggaagcgga)为模板，用下面的引物进行扩增，纯化，得到含有双酶切位点的连接肽产物；

pcr反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-gtcgacggagcggaagcg-3’(seqidno：15)，该引物横线处为sali限制性内切酶的酶切位点；

3’端引物序列为：

5’-ggtaccggccgcttccgc-3’(seqidno：16)，该引物横线处为kpni限制性内切酶的酶切位点。

将muc1纯化酶切产物和双酶切位点的连接肽产物分别经sali单酶切，酶切产物使用试剂盒进行纯化。纯化后的两片段进行连接，得到muc1-连接肽的dna片段。

1.3muc1-连接肽-mage-a3重组表达质粒的构建：

pcr反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-gtcgaccccagagtcctc-3’(seqidno：12)，该引物横线处为sali限制性内切酶的酶切位点；

3’端引物序列为：

5’-ggtacctcagaggagcag-3’(seqidno：13)，该引物横线处为kpni限制性内切酶的酶切位点。

反应参数：95℃15秒，55.6℃30秒，72℃40秒，35循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为183bp，pcr产物纯化后经sali单酶切，酶切产物使用试剂盒进行纯化。

pcr反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-ggtaccagccacagccccggt-3’(seqidno10)；横线处含有kpni限制性内切酶的酶切位点；

3’端引物序列为：

5’-ggtacctcagaggagcag-3’(seqidno13)，该引物横线处为kpni限制性内切酶的酶切位点。

反应参数为：95℃30秒，64.9℃30秒，72℃45秒，35循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为592bp。将获得的pcr产物纯化后经scai-kpni酶切再与质粒pqe30(购自qiagen公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌宿主菌m15(prep4)(购自qiagen公司)，挑取阳性克隆，经scai-kpni酶切鉴定后纯化并测序(abi公司的377型测序仪，bigdyeterminator试剂盒，pe公司)。经测序证实，已插入了所设计的序列正确的muc1-mage-a3编码序列，插入位置与读框也全部正确。重组子记为pqe30-muc1-mage-a3。

酶切鉴定结果显示，经scai-kpni酶切鉴定，电泳结果显示，阳性克隆被切下一条约1146bp的插入片段(seqidno6)。

实施例3

用下面的一对引物对1146bp插入片段进行pcr扩增，得到含有新的酶切位点的dna片段。正向引物具有如序列表中seqidno.8所示的核苷酸序列，其中cagatctggagccacagccccggt序列中化横线的部分为bg1ii的酶切位点；所述反向引物具有如序列表中seqidno.9所示的核苷酸序列，其中caagcttggtcactcctcgtctttac序列中横线部分为hindiii的酶切位点。

将含有新的酶切位点的dna片段和pshuttle-cmv穿梭质粒用bg1ii和hindiii酶进行双酶切，连接，得到重组穿梭质粒。

用mva病毒感染cef细胞，培养100min，得到感染细胞。

得到感染细胞后，将所述重组穿梭质粒与所述感染细胞混合，37℃培养36h，得到单层细胞。

将培养得到的单层细胞反复冻融所述单层细胞2～3次，将冻融的细胞破碎处理5次，固液分离，得到上清液。将所述上清液接种细胞，培养，将病变后的细胞破碎、分离，得到用于治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。

实施例4

将实施例1制备的muc1-连接肽-mage-a3融合基因按照实施例3的方法制备治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗。

对比例1

将实施例1中纯化得到的编码muc1的dna片段按照实施例3的方法进行制备重组病毒疫苗。

对比例2

将实施例1中纯化得到的编码mage-a3的dna片段按照实施例3的方法进行制备重组病毒疫苗。

实施例5

将实施例2和3制备的重组病毒疫苗分别接种至1cef细胞中，接种量为5×10⁶pfu/ml，待病变80％左右时收获感染细胞，pbs液洗2次，裂解细胞，提取蛋白，sds-page电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，进行westernblot，一抗为马抗muc1蛋白血清，二抗为hrp标记的羊抗马igg，用4-氯-1-萘酚底物显色。

结果如图1所示。由图1可知，实施例3制备的重组病毒疫苗在细胞中表达的融合蛋白的分子量为34610。实施例4制备的重组病毒疫苗在细胞中表达的融合蛋白的分子量为34058。对比例1制备的重组病毒疫苗在细胞中表达的融合蛋白的分子量为22834。对比例2制备的重组病毒疫苗在细胞中表达的融合蛋白的分子量为11242。这表明本发明制备的重组病毒疫苗能够有效在1cef细胞中正确表达抗原。

实施例6

将balb/c小鼠，雌性，6～8周，随机分为5组，每组6只，腹腔接种免疫实施例2、实施例3、对比例1、对比例2制备的重组病毒疫苗，以接种pbs的一组作为空白对照组。共免疫3次，间隔2周。免疫前、加强免疫前和免疫后每周取血1次，直到免疫后第14周结束。分离血清，用elisa法测定抗体滴度。包被抗原为实验室采用常规方法在细胞中表达得到的重组融合蛋白，2μg/ml。吸光度(a)值大于cutoff值的最大稀释度为待测血清的elisa滴度。

不同重组病毒疫苗免疫小鼠产生的抗体滴度结果如图2所示，其中x轴表示免疫时间，y轴表示抗体滴度。实施例1和实施例2制备的重组病毒疫苗免疫小鼠产生的抗体滴度比对比例1和对比例2制备的重组病毒疫苗免疫小鼠产生的抗体滴度高很多，这说明本发明提供的融合蛋白以及该融合蛋白制备的重组病毒疫苗较单个蛋白抗体具有较强的免疫性。同时将实施例1和实施例2制备的重组病毒疫苗对比发现，实施例1制备的重组病毒疫苗比实施例2制备的重组病毒疫苗的免疫性强，这可能是由于实施例1制备的重组病毒疫苗中融合蛋白中含有连接肽，连接肽的连接有利于维持融合蛋白的柔韧度和弹性，使融合蛋白能够产生结构稳定的构型，从而保证融合蛋白的抗原性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京鼎成肽源生物技术有限公司

<120>一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的病毒疫苗和制备方法

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>248

<212>prt

<213>homosapiens

<400>1

serhisserproglyserglyserserthrthrglnglyglnaspval

151015

thrleualaproalathrgluproalaserglyseralaalathrtrp

202530

glyglnaspvalthrservalprovalthrargproalaleuglyser

354045

thrthrproproalahisaspvalthrseralaproaspasnlyspro

505560

alaproglyserthralaproproalahisglyvalthrseralapro

65707580

aspthrargproalaproglyserthralaproproalahisglyval

859095

thrseralaproaspthrargproalaproglyserthralapropro

100105110

alahisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyser

115120125

thralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargpro

130135140

alaproglyserthralaproproalahisglyvalthrseralapro

145150155160

aspthrargproalaproglyserthralaproproalahisglyval

165170175

thrseralaproaspasnargproalaleuglyserthralapropro

180185190

valhisasnvalthrseralaserglyseralaserglyseralaser

195200205

thrleuvalhisasnglythrseralaargalathrthrthrproala

210215220

serlysserthrpropheserileproserhishisseraspthrpro

225230235240

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245

<210>2

<211>122

<212>prt

<213>homosapiens

<400>2

metproleugluglnargserglnhiscyslysproglugluglyleu

151015

glualaargglyglualaleuglyleuvalglyalaglnalaproala

202530

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100105110

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115120

<210>3

<211>6

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<400>3

serglyserglysergly

<210>4

<211>376

<212>prt

<213>homosapiens

<400>4

serhisserproglyserglyserserthrthrglnglyglnaspval

151015

thrleualaproalathrgluproalaserglyseralaalathrtrp

202530

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354045

thrthrproproalahisaspvalthrseralaproaspasnlyspro

505560

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65707580

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115120125

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290295300

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305310315320

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