专利名称：：测定体液中的蛋白片段的制作方法
技术领域：
：本发明涉及胶原或其它蛋白的降解产物的测定及为此而用到的材料。胶原和胶原代谢性疾病骨质疏松是人类最常见的骨病。原发性骨质疏松常伴有骨折发生率增高，这是由骨骼骨质的进行性减少引起的。据估计仅在美国就可影响一千五百一二千万人。它的基础是年龄依赖性的骨重建失衡，即骨组织的形成率和吸收率失衡。在美国每年大约有一百二十万的老年人发生骨质疏松相关性骨折，其中包括大约538,000脊椎受压骨折，约227,000髋部骨折并且有相当多的早期四肢骨骨折。因为髋部骨折引起严重的损伤和出血，所以约有12-20％是致命的，一半的幸存者需要家庭护理。目前在美国每年对骨质疏松性损伤的总花费至少达100亿美元(Riggs，新英格兰医学杂志，327620-627(1992))。骨质疏松在绝经后的妇女中最常见，这些妇女在绝经后的10年中平均失去骨质的15％。这种疾病也可发生在老年男性和年轻的闭经的女运动员中。虽然骨质疏松带来重要的、增长着的社会和经济上后果，但是用于测定病人或健康人骨吸收率的方法非常有限。其它导致胶原代谢异常的(和与之相关的)疾病包括佩吉特氏病，马凡氏综合征，成骨不全，胶原组织中的肿瘤生长，侏儒症，类风湿性关节炎，骨关节炎和脉管炎综合征。目前已经描述了三类人类胶原。已知I类胶原形成原纤维，它分为1型、II型、III型、V型和XI型。WO95/08115的附录A中给出了I-III型氨基酸序列(就其已被阐明的范围)。I型胶原占据骨有机基质的90％以上。因此，原则上可通过监测I型胶原的降解来估计骨吸收率。同样，包括结缔组织在内的一些其它疾病也可通过检测胶原的降解而进行监测。例如，II型胶原降解与类风湿性关节炎和骨关节炎相关，而III型胶原降解出现在脉管综合征中。几组研究者已研究并测定了人类III型胶原、人类前α1(II)胶原和人类III型胶原整个前原α1(III)链的氨基酸序列及相应的cDNA克隆，参见Loil等，核酸研究129383-9394(1984)；Sangiorgi等，核酸研究，132207-2225(1985)；Baldwin等，生化杂志，262521-528(1989)；Ala-Kokko等，生化杂志，260509-516(1989)。I型、II型和III型胶原均在有机体内以前胶原分子的形式存在，包括与核心胶原分子接合的N端和C端前肽序列。前肽被移去(这是在体内胶原合成的过程中自然发生的)后，剩余的核心胶原分子由大量末端端肽序列不是三股螺旋的三股螺旋区组成。这些端肽序列有重要功能，是胶原原纤维细胞外进行分子内交联的部位，α-螺旋区也包括交联部位。分子内交联使胶原原纤维具有生物力学稳定性。这些交联的形成由赖氨酸和羟赖氨酸残基被修饰为相应的醛所启始。一些位于胶原相邻链上的残基能自然形成不同的分子内交联。交联部位在胶原端肽和螺旋区域的确切位置以前已有论述。例如，可参阅Kühn，K.，细胞外基质的免疫化学，11-29，CRC出版公司，BocaRaton，Florida，(1982)，Eyre，D.R.，生化综述年刊，53717-48(1984)或美国专利No.5140103和5455179。并且，下面的表1中给出了I、II和III型胶原中形成交联的一些潜在部位的氨基酸序列。纤维蛋白、胶原和弹性蛋白是基于由赖氨酸或赖氨酸侧链形成醛这一独特机制而交联的。I、II和III型胶原分子中的四个交联的同源位点很明显(参阅Kühn，K.，细胞外基质的免疫化学，11-29(1982))。两个为醛部位，每个端肽区域有一个。另外两个部位是对称分布于距每一分子末端90个残基的羟赖氨酸。当胶原分子组装成原纤维时，这些螺旋区域中最近的部位排列成直线并且与邻近分子中的端肽醛作用。有可靠证据证明3-羧羟基吡啶鎓残基是由羟赖氨酸而来的醛形成的成熟交联。然而，由其它途径形成的成熟交联残基，即由赖氨酸残基的醛形成而来的仍然不清楚。由下面讨论的EP-0394296中的分子式进行的说明，已经发现两个3-羟基吡啶鎓交联是羟赖氨酸羟赖氨酰吡啶啉(亦简称作吡啶啉)和赖氨酰吡啶啉(亦称作“脱氧吡啶啉”)。这些交联化合物是天然荧光性的。如EP-A-0424428中论述的，发现一些羟赖氨酰吡啶啉交联是糖基化的。然而，如Last等在国际生化杂志22(6)559-564，1990中描述的，胶原中天然存在其它的交联。检测胶原降解的现有技术以前已建立了检测体内胶原降解的方法，它是通过测定不同的生化标志物(其中一些是胶原降解产物)而进行的。例如，羟脯氨酸(一种很大程度上局限于胶原的氨基酸，而胶原是骨和其它结缔组织中主要的结构蛋白)排泄于尿液中。在某些情况下，其排泄率增加，在佩吉特氏病中较显著，该病是一种代谢性骨病，正如后面所谈到的，这种疾病中的骨的转换率大大增加。为此，人们已广泛应用尿中的羟脯氨酸作为氨基酸标记物测定胶原降解了Singer，F.R.等，代谢性骨病，第II卷(Avioli，L.V.和Kane，S.M.编)489-575(1978)，学术出版社，纽约。美国专利No.3600132中公开了一种测定体液如血清、尿液、腰脊液和其它细胞内液体的方法，以用于监测胶原代谢的偏差。该专利中指出羟脯氨酸与增加的胶原合成代谢或分解代谢相互关联，而这些代谢与病理情况如佩吉特氏病、马凡氏综合征、成骨不全、胶原组织中的肿瘤生长和各种侏儒症相关。与佩吉特氏病相关的骨吸收也可通过检测含有羟脯氨酸的小肽进行测定，这些小肽是随骨胶原的降解而排泄到尿液中的；Russell等，代谢性骨病和Rel.Res.4和5，2250262(1981)，Singer，F.R.等，同上。佩吉特氏病中，尿液中羟脯氨酸的增高可能大部分来自骨降解；然而羟脯氨酸通常并不能作为骨降解的特异性指标。尿液中许多羟脯氨酸来自新胶原的合成(相当数量的新合成蛋白被降解，没有掺入组织结构中就被排泄了)，也来自某些血液蛋白的转换及其它含有羟脯氨酸的蛋白。而且大约80％的来源于蛋白降解的自由羟脯氨酸在肝脏中代谢，在尿液中从不出现。Kiviriko，K.I.，国际结缔组织研究综述593(1970)，Weiss，P.H.和Klein，L，J.临床研究481(1969)，即使羟脯氨酸对骨吸收并不特异，由于它对骨中的胶原特异，所以是骨质疏松的一个良好的标记物，但它难于控制。羟赖氨酸和它的糖苷衍生物均对胶原蛋白特异，所以人们认为作为胶原降解的标记物，它们比羟脯氨酸更准确。但是由于与上面提到的羟脯氨酸同样的原因，羟赖氨酸和它的糖苷同样是非特异的骨吸收标记；Krane，S.M.和Simon，L.S.，生化进展，22185(1981)。另外一些研究人员检测尿液中的交联化合物3-羟基吡啶鎓，以此作为关节疾病中胶原降解的指标。作为背景和实例，参阅Wu和Eyre，生化，231850(1984)；Black等，风湿性疾病年刊，45969-973(1986)；Seibel等，皮肤学杂志16964(1989)。与本发明不同的是，先前的研究人员从体液中获取水解的肽，然后检查自由3-羟基吡啶鎓残基的存在。EP-0394296和美国专利No.4973666和No.5140103中公开了检测I、II和III型胶原降解物的方法。但是这些专利限于含有交联物3-羟基吡啶鎓的胶原片段。另外，上述方法耗费时间且需要从尿液中得到完全纯化的含3-羟基吡啶鎓的胶原片段，以在测定中用作抗原和制备抗体。目前很少有临床报道应用美国专利No.4973666和No.5140103中所描述的方法。尤其没有关于尿液中含3-羟基吡啶的I型胶原端肽的浓度(接上述专利中的方法测定)与实际上已形成的骨损失(由骨密度测定法重复测定而确定)间的关系的数据。尿中含3-羟基吡啶鎓端肽的出现需要在处于骨吸收过程之前的不同时间的骨组织中合适地形成这种特异的交联结构。关于这些方法的资料很少，并且希望这种方法能避免依赖于交联结构的正确形成。英国专利申请No.2205643中报道，通过测定体液中III型胶原N末端端肽的浓度来定量测定III型胶原的降解。该方法应用时N末端端肽特异的抗体，通过III型胶原被细菌的胶原酶降解而释放，测定中所用的端肽要标记。Schroter-Kermani等，免疫研究19475-491(1990)中讲述了基于I、II型胶原CNBr片段基础上的免疫学测定系统。应用骨蛋白酶溶解了的胶原，端肽留在组织中(上述英国专利申请No.2205643)。因此，片段和从中产生的抗体间并不一致。而且，参考文献仅讲述了对离体组织测量的实例。针对胃蛋白酶溶解了的I型胶原产生单克隆抗体的方法，Werkmeister等在欧洲生化杂志1987439-443(1990)中有所论述。抗体在对组织切片进行免疫组化染色时应用，以检测细胞培养中所含的胶原。这种测定尚未在体液中进行。欧洲专利申请No.0505210中描述了用从I型胶原得到的纯化交联C末端端肽进行免疫，从而产生抗体的方法。通过用细菌的胶原酶溶解人类的骨胶原而制备免疫原。这些制备的抗体可与交联和非交联的端肽作用，并与非吡啶啉的交联物作用。国际专利申请No.WO91/09114公开了某些用于促使细胞粘附在固体底物的合成肽。没有提到用这种合成肽作为免疫反应物。有一些报道指出可以通过对某种前胶原肽定量来测定胶原降解，前肽和端肽及核心胶原的α-螺旋区不同，它们在前胶原分子的位置及在体内的分裂时相不同；参阅美国专利No.4504587；No4312853；Pierard等，分析生化141127-136(1984)；Niemela等，临床化学31/81301-1304(1985)；Rohde等，欧洲临床研究杂志，9451-459(1979)。欧洲专利申请No.0298210和No.0339443中均描述了III型前胶原肽和其片段的免疫学测定。另外，欧洲专利申请No.0465104中指出了基于前胶原测定的一种方法。PCT专利申请No.WO90/08195中公开了用其序列来源于IX型胶原的合成肽来产生免疫反应物。该申请中也描述了这样产生的抗体在检测体液中的IX型胶原片段中的应用。美国专利No.4778768涉及一种测定关节软骨变化的方法，包括对滑液标本中的蛋白聚糖或其抗原片段定量。Dodge于临床研究杂志83647-661(1981)中指出了分析II型胶原降解的方法，该方法应用了与人和牛II型胶原的解旋α链和溴化氰衍生的肽发生特异性反应的多克隆抗血清。胶原的降解产物没有在体液中检测，而是对细胞培养物进行组化染色，即“原位”检测。WO94/03813中论述了一种竞争性免疫测定法，以检测样品中的胶原或胶原片段，其中结合配体含有与胶原的非螺旋C末端或N末端区一致的合成的线性肽，它与对线性合成肽和样品特异的抗体共同培养，检测抗体与结合配体的结合。WO95/08115涉及测定方法，其中通过与可以与合成肽进行反应的抗体反应来确定体液中的胶原片段。这种测定可以是竞争性的方法，其中样品和这种肽竞争一种抗体，或是针对胶原酶降解胶原而得到的胶原片段产生的多克隆抗体。另外，它可以是这样一种测定方法，其中的抗体，也许是单克隆抗体，是针对该合成肽而产生的。在体液尤其是尿液中，我们发现一种特殊的下式肽片段式1上式中，K-K-K代表交联，例如可以是羟基吡啶鎓交联，但也可以是任何自然发生的交联和上面Last等的文献中所谈到的任何一种特殊的交联。包括上述较小片段在内的较大肽片段在EP0394296中有报道。现在我们发现“肽”片段在体液中的比率与相同氨基酸序列的肽相关，例如式1中的肽通过式中的天冬氨酸异构化作用形成异天冬氨酸。这里我们把“肽”放在引号中是因为异构化作用意味着这些种类不再是严格意义上的肽。先前已报道这种含天冬氨酸蛋白的异构化作用是在生理情况下自然发生的反应。例如，Brennan等，蛋白科学1993，2，331-338，Galletti等，生化杂志，1995，306，313-325，Lowenson等，血液细胞1988，14，103-117和Oliya等，药学研究，第11卷，第5期，1994，p.751。异构化的效果是把羧基末端方向天冬氨酸残基下游的部分肽从天冬氨酸的α-羧酸转换为通过普通蛋白中的肽键与侧链的羧酸结合形成非肽酰胺键，如下所示这种非肽键合的天冬氨酸残基称作“异天冬氨酸”。在含有天冬酰胺残基的蛋白中也可发生相似的异构化作用(即，在上面的反应式中用-NH2替代开始蛋白中的-OH)。上述发现表明在骨组织中也可发生这种异构化作用，因此希望把这种异构化作用的程度作为受试者骨组织年龄的标记。另外，在骨肽片段中异构化肽的存在证实，片段确实来自骨降解而非其它来源，比如从未掺入骨中的新形成胶原的降解。因此，本发明的第一方面是提供一种测定机体蛋白(如骨胶原)降解率的方法，包括确定体液中含一种或多种异天冬氨酸的物类的量。上述异构化肽可以以I型、II型或III型胶原为代表，但优选以I型胶原为代表。更优选地，该方法确定了体液中存在的含一种或多种特异性的异天冬氨酸的异构化肽的量。优选地，该方法确定体液中存在的式2(如下)的异构化肽的含量式2其中一个或两个*均为异天冬氨酸，或一或多个合并到存在于式2的异构化肽表位的异构化肽，它包含异天冬氨酸。在上式中，K-K-K是一种交联，如羟基吡啶鎓交联，它可以是吡啶啉(糖基化或非糖基化的)或是脱氧吡啶啉。优选地，该方法中应用了免疫结合配体，该配体对方法中的样品存在的含异天冬氨酸的物类有特异性，优选地，式2的异构化肽或合并到存在于式2的异构化肽表位的异构化肽包含有异天冬氨酸。免疫结合配体可以是单克隆或多克隆抗体。根据需要，这种免疫结合配体对含有异天冬氨酸的物类具有的特异性是指，免疫结合配体有别于测定中应用到的所述物类和类似的含天冬氨酸的物类(肽)。合适的免疫结合配体也包括能够与包括Fab、Fab′和F(ab′)2片段的相同抗原决定簇结合的抗体片段。优选地，免疫结合配体是针对线性异构化肽而产生的，优选合成的异构化肽，它对应于胶原的序列，其氨基酸序列中异天冬氨酸替代了胶原蛋白序列中天冬氨酸。该测定可按多种形式进行，包括ELISA、RIA或IRMA，这些方法是众所周知的，本文不必描述。第二方面，本发明包括在测定胶原衍生的异构化肽时合成的异构化肽的应用，合成的异构化肽的氨基酸序列对应于胶原序列，而该氨基酸序列中异天冬氨酸替代了该胶原蛋白序列中的天冬氨酸。在竞争性测定中，合成的异构化肽可用于和样品中的一个或多种异构化的肽竞争免疫结合配体。在这种类型的ELISA中，可把合成的肽固定在固体支持物上。样品可与单克隆抗体共同培养，合成的异构化肽与固体支持物接触，洗涤后添加过氧化物酶结合(显色)抗体。进一步培养后，加过氧化物酶底物溶液。通过竞争，样品中的肽异构体与抗体反应，从而抑制了过氧化物酶反应。另外，可用合成的肽的异构体来产生单克隆免疫结合配体。于是在测定中，合成的异构化了的肽不必作为竞争剂。例如，可纯化胶原酶处理的胶原，并把它固定到固体支持物上，可应用单克隆抗体进行ELISA。因此，在第三方面，本发明包括抗体，优选单克隆抗体，该抗体对相应于蛋白中的一段序列的氨基酸序列(例如胶原序列)有特异性，所述蛋白例如这样一种胶原，在其氨基酸序列中，异天冬氨酸替代了胶原蛋白序列中的天冬氨酸。在本发明这一方面的优选实施方案中，抗体对包含EKAHiDGGR序列的异构化肤序列具有特异性或者抗体含有对该序列中存在的iD具有特异性的表位，其中iD指异天冬氨酸。因此，本发明的这一方面包括一种抗体，优选与包含，包含于肽的异构体序列EKAHiDGGR或由之组成的表位反应的单克隆抗体，其中iD指异天冬氨酸。在第四方面，本发明提供一种抗体，优选单克隆抗体，该抗体是针对含有对应于蛋白内一段序列的氨基酸序列的肽异构体产生的，所述蛋白例如这样一种胶原，在其氨基酸序列中，异天冬氨酸替代了该氨基酸序列中的天冬氨酸。本发明包括产生本发明第三或四方面中单克隆抗体的细胞系。本发明还包括本发明第三或四方面中的抗体，它与可检测的标记物偶联。合适的可检测的标记物包括但不限于酶、生色团、荧光团、辅酶、酶抑制物、化学发光物质、药物、自旋标记、放射性核素、核酸或核酸类似物序列。在第五方面，本发明包括在测定胶原或其它蛋白衍生的异构化的肽时，对对应于蛋白(例如胶原)内一段序列的氨基酸序列具有特异性的抗体的应用，其氨基酸序列中的异天冬氨酸替代了蛋白(例如胶原)序列中的天冬氨酸，以获取关于含异天冬氨酸的肽异构体或体液中异构体含量的信息。在第六方面，本发明包括一种合成的肽异构体，它含有的氨基酸序列对应于胶原的序列，而该氨基酸序列中异天冬氨酸替代了胶原蛋白序列中天冬氨酸，优选地至少基本上缺失相应的肽。优选在氨基酸序列的天然肽形式中，甘氨酸残基邻近天冬氨酸残基，因为邻近的甘氨酸有利于天冬氨酸的异构化作用。可分别选择为一种或多种含天冬氨酸的肽和它们含异天冬氨酸的类似物制备抗体。这样可对两种肽的变异体进行测定。如果测定的是胶原片段类型的话，那么异天冬氨酸的相对数量可以提供骨和已破坏了的蛋白的年龄的指标。因此，本发明的第六方面提供了一种获取有关患者胶原吸收方面信息的方法，包括测量体液中至少一种源于胶原的含天冬氨酸的肽和相应的含有异天冬氨酸的肽的类似物的相对含量。本发明还包括可在上述方法中应用的检测试剂盒。该试剂盒中包括本发明第三或第四方面中的抗体，或类似的特异性抗体片段，优选与下列一种或多种物质组合可以与抗体反应的含异天冬氨酸的合成的肽类似物，抗体-酶轭合物和/或其底物，终止酶轭合物-底物反应的组合物，或清洗溶液。本发明可应用于人和动物。合适的体液包括人或动物的尿液、血液、血清、血浆和滑液。本方法也试图用于唾液和汗液。体液可以原液应用或在接触步骤之前纯化。这种纯化步骤可用一些标准的方法完成，包括药筒吸附和洗脱，分子筛层析，透析，离子交换，氧化铝层析，羟基磷灰石层析和它们的组合，但并不仅限于此。下面更详细地对本发明进行阐述。附图被用作参考。附图简述图1给出了EKAH*GGR序列的合成肽和肽类似物的HPLC分离，如实施例3a中所述，两序列的区别在于*分别是异天冬氨酸(峰2)和正常天冬氨酸(峰3)；图2给出了图1中分离的肽和肽类似物在两种形式的ELISA中不同反应性，如实施例3a所述；图3(a)和3(b)给出了HPLC分离的尿液中交联肽和肽类似物的荧光(a)和吸收(b)，如实施例3(b)所述；图4和5给出了应用不同的抗体监测二膦酸盐治疗骨吸收的效果对血清进行测定的结果。本发明方法的优选实施方案，尿液或其它体液中I、II或III型胶原片段的检测用抑制性ELISA(酶联免疫吸附试验)进行，从机体的尿液中量出样品，与序列来源于胶原的合成的肽类似物及与合成的肽类似物有免疫反应性的抗体接触。合成的肽类似物被固定在固体支持物上。抗体可以是针对合成肽类似物而产生的或者是针对胶原降解产物而产生的，用合成的肽类似物对其筛选。合成的肽类似物的制备可依照该领域熟知的方法进行合成肽和肽类似物的制备，如按通常描述为“Merrigield合成”的固相肽合成肽技术进行。也可应用传统的液相技术。相关序列包括胶原交联的潜在部位(参阅例如Kuhn，K.，细胞外基质的免疫化学，11-29(1982)，Eyre；D.R.，生化综述年刊，53717-48(1984)，或美国专利N0.5140103)。下面的表1中给出了这些肽序列的实例。传统的肽合成方法可以产生肽(具有常规的肽键合的天冬氨酸)和与天冬氨酸结合发生异构化作用的肽类似物混合物。通常这种混合物可适合作为测定中插入的肽。但是，给这种混合物加热时通常导致肽的异构化作用而形成异构产物。关于合成的肽类似物，可以从(或给)它的可交联部位的序列删除(或增加)一个或几个氨基酸残基，而基本上不丢失下述能力(a)产生的抗体识别与天然胶原片段一致的异天冬氨酸类似物，或(b)抑制抗体与天然胶原的类似物相结合。可以用较长的胶原片段和/或嵌合的肽类似物诱导抗体产生，原则上不必用相同的类似物作免疫原和竞争测定方法中的竞争物。表1不同胶原类型中具有交联潜在部位氨基酸序列的实例，在本发明中它们用作含异天冬氨酸合成的肽类似物的主要成分。I型胶原端肽类似物中的潜在部位NCα1(I)N-末端，(异)天冬氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丝氨酸-苏氨酸-甘氨酸-甘氨酸(α1(I)N1)α1(I)C-末端，谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸-组氨酸-(异)天冬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸(α1(I)C1)α2(I)N-末端，谷氨酰胺-酪氨酸-(异)天冬氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-缬氨酸-甘氨酸(α2(I)N1)II型胶原端肽类似物中的潜在部位NCα1(II)N-末端，甘氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-(异)天冬氨酸-异亮氨酸-缬氨酸α1(II)C-末端，谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-脯氨酸-(异)天冬氨酸III型胶原端肽序列中的潜在部位NCα1(III)N-末端，(异)天冬氨酸-缬氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-缬氨酸抗体的制备本领域中熟知制备单克隆抗体和多克隆抗体的方法。例如可参阅，Campbell，A.M.，生化和分子生物学实验技术，第12卷(1986)。通过免疫可以制备针对合成肽类似物的抗体。但是，因为这些化合物分子量相对较小，所以优选半抗原与载体分子结合。合适的载体分子包括牛血清白蛋白，甲状腺球蛋白，卵白蛋白，破伤风类毒素，钥孔血蓝素，但并不仅限于此。优选的载体是牛血清白蛋白。为了把半抗原以最强的免疫原形式传递给被免疫动物的抗体形成细胞，可应用一些替代的偶联方案。适宜的过程包括戊二醛，碳化二亚胺和过碘酸盐，但也不仅限于此。优选的结合试剂包括戊二醛和碳化二亚胺。抗体的制备可用传统的技术进行，包括用包含有天然异构化作用或与载体联合的合成的异构肽的胶原片段进行免疫。为了提高免疫原性，优选在注射前把免疫原与佐剂混合。佐剂的实例包括氢氧化铝，弗氏佐剂和免疫刺激复合体(ISCOM)，但并不仅限于这些。可依照Morein，B.等，自然308457-460(1984)中描述的方法制备ISCOM。对半抗原-载体分子所产生的单克隆抗体或多克隆抗体均可制备。制备单克隆抗体时，优选被免疫了的小鼠。收集免疫鼠的脾细胞，匀浆后在聚乙二醇存在时与癌细胞混合，产生杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞可产生对胶原来源的异构化肽片段具有特异性的单克隆抗体。适宜的瘤细胞包括，但不仅限于骨髓瘤，肝细胞瘤，癌和肉瘤细胞。Goding，J.W.，单克隆抗体原理和实施，(1986)中对单克隆抗体的制备进行了详细论述。优选地初选方案包括应用覆盖在微滴孔板固定表面的与载体联合的合成的异构化肽。为了制备与胶原来源的异构化肽片段反应的多克隆抗体，可对不同种类的动物进行免疫。适宜的种类包括小鸡，兔子和山羊，但不限于此。优选小鸡和兔子。依照本发明，可通过检测与合适序列的含异天冬氨酸的合成肽类似物的反应力来筛选适于应用的所制备的抗体。应用本领域所熟知的方法来制备抗体片段(参阅E.Ishikawa，免疫测定杂志3209-327(1983))。免疫测定的实施利用上述制备的抗体所进行的免疫测定，可测定生物液标本，而不需先进行分级分离或水解。通过抗体与测定结构中应用的合成异构化肽(抗体针对它而产生或无论如何抗体与之进行免疫化学性反应)结合，可以提供对生物液中的目的胶原片段所产生的特异性。作为另一途径，免疫测定可用单克隆抗体进行。这种测定设计的主要思想是把测定的特异性从抗原(对胶原的合成肽异构体)移到抗体(从兔的抗血清得到的单克隆抗体)。应用这种结构的话，测定就不必进一步利用合成的肽同分异构体。这种免疫测定适于这样进行，即把患者的样品或标准溶液与结合过氧化物酶的抗体溶液在预先铺有经纯化胶原酶处理的胶原的微滴定板中培育。洗涤之后，板中的孔与底物溶液在暗室中培养。添加终止溶液来终止显色反应，最后测定吸收值。可从本领域中常规的各种测定方案中选择任何一种来实施免疫测定。如通常所理解的测定的建立以依赖于特异免疫结合配体和目的分析物间的相互作用来测定特异性，并且利用一些方式来检测分析物和免疫结合配体形成的复合物。免疫结合配体可复合到固体支持物，作为分析物的捕获免疫结合配体。这种方案可以以直接的方式进行，其中检测分析物-免疫结合配体复合物的形成，例如用荧光，放射活性或酶标记的方法，或者以竞争的形式进行，其中标记的标准物与分析物竞争免疫结合配体，这种形式也可构建成凝集反应的方法或通过给反应混合物中添加合适的沉淀剂而使复合物沉淀。该免疫测定方案的具体设计可有多种选择，本领域中可获得的临床检测建议和方案的数量是很大的。对不同的方案，可参阅美国专利No.5001225。用标准检测方案进行免疫测定时所用的抗体和显色剂，如用放射性核素标记，荧光标记或ELISA，无论是以直接或竞争的形式，都能方便地以试剂盒的方式提供，试剂盒中包括必要的组分和测定的说明书。在该发明的一个实施方案中，试剂盒包括辅有相关的合成的肽异构体的微滴定板。制备标准曲线的标准液，定性检测分析用的体液(如尿液)对照，与上述合成的肽异构体反应的兔抗体，与过氧化物酶结合的抗兔免疫球蛋白，底物溶液，终止液，洗涤缓冲液和说明书。因为免疫测定可用抗体和特异的合成的异构化肽进行，因此可检测相应胶原片段序列在适宜的生物液中的比率及它们单独的水平和总体水平。因此，该测定可设计为包括抗体，抗体将会引起几种含异天冬氨酸肽类似物和选择性的天然肽序列的确定或单个含异天冬氨酸肽类似物序列的确定，或它们的任何一种所需组合的确定。除应用本文描述的异构化肽作为骨吸收的指标外，可通过基本上同时对同一个体相同的或其它合适的生物液中骨形成标记的测定来有利地确定骨代谢的平衡。“基本上同时”指同一天，优选在4小时之内。这些标记物的实例包括骨钙素(亦称作BGP的骨GLA蛋白)，I型前胶原的前肽，骨的碱性磷酸酶和总的碱性磷酸酶。测定这些标记物的合适方法可以在文献中找到，例如Delmas，P.D.，等。骨的矿物质研究杂志(1986)1333-337。本发明的测定方法提供了一种确定组织代谢状态的指标，当发生降解时产生胶原衍生的肽和异构化肽，这种测定方法在多种情况下有用。首先，当考虑到I型胶原的降解时，该测定通过指示如过度骨吸收而成为评定观察对象的异常状态的方法。这可以显示骨质疏松情况的存在或恶性肿瘤的转移进程。其它以过度骨吸收为特征的情况包括佩吉特氏病和甲状旁腺功能亢进。同样，其它一些包含结缔组织的疾病也可通过确定胶原的降解进行监控。实例为II型胶原的降解与类风湿性关节炎和骨关节炎相关，而在脉管炎综合征中出现III型胶原降解。由于观察对象的情况可被连续监测，所以这些测定的应用也可用于监控施用于治疗这些或其它情况的治疗进程。另外，由于毒性物质的应用经常导致组织降解，所以该测定可用于毒性测定。因此该测定可用于下面的任何一种情况，其中胶原组织的代谢情况可以用作病情，治疗或直接施用给观察对象物质的效果或环境中观察对象所接触到物质的作用的指标。下面的实施例意在解释说明，而并不是限定本发明。实施例1尿液中特异肽序列的免疫测定由固相技术制备的三种异构化肽(α1(I)C1，α1(I)N1和α2(I)N1)(见表1)用以免疫原的制备。免疫时，用碳化二亚胶和戊二醛及该领域熟知的方法使肽异构体与牛血清白蛋白共价结合。单克隆抗体和多克隆抗体均针对肽异构体而产生。为了制备单克隆抗体，用肽异构体-BSA结合物免疫Balb/c小鼠，在脾或淋巴结细胞与Ag8骨髓瘤细胞融合后，用标准技术制备来交瘤细胞。多克隆抗体在兔和小鸡中产生。抗血清和杂交瘤细胞培养基的筛选用ELISA进行，其间应用的微滴定板铺有用本领域所熟知的方法和碳化二亚肽试剂所制备的适当的肽异构体-蛋白载体结合物。尿液中三种肽异构体序列(α1(I)C1，α1(I)N1，和α2(I)N1)的测定按下面的抑制ELISA进行分别把可能含有胶原片段的尿液样品(10-25μl)或每ml含0.015-15μg肽异构体作为参照标准的溶液加到75μl的免疫球蛋白结合配体中，肽异构体在含有0.1％吐温-20表面活性剂(PSB-T)和包括0.1％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液中稀释1∶5000-1∶20000。每个样品都在预先铺有含适当的肽异构体的肽异构体-蛋白载体结合物的平底96孔微滴定板中制备22份。60分钟后，用PBS-T(3次)洗板，用针对初级抗体而制备的辣根过氧化物酶标记的抗体所进行的标准技术来检测结合的抗体。加过氧化物酶底物，用1MH3HO4终止酶反应后，用自动微滴定板读数仪于450nm处测定颜色反应。含有分析物的详品使初级抗体与固定在板上的肽异构体的结合减少，于是颜色浓度降低。参照预先用对数图计算出的包括每一板的标准所建立的曲线来对样品中的分析物进行定量。实施例2用单克隆抗体来检测I型胶原降解物用与适当的载体蛋白结合的含有异天冬氨酸的α1(I)C1合成肽类似物免疫小鼠以产生单克隆抗体。细胞融合、杂交瘤的克隆和繁殖依照标准步骤进行。筛选步骤包括测定对固定在微滴度板上的α1(I)C1合成肽类似物的反应性。抗体的特异性通过抑制实验进行检测，其中应用了来源于肽类似物形式中I型胶原C-端肽的不同重叠序列，即包括异构化的连接如天冬氨酸。建立了一种应用MAbA-ISO抗体的测定方法。简言之，用碳化二亚胺或戊二醛使含异天冬氨酸的合成肽类似物α1(I)C1与牛血清白蛋白结合，结合物用于覆盖微滴度板。也可应用替代物，主要的特征是EKAHiDGGR序列的暴露。铺板后，微滴度板的板孔与15μl尿液和100μl的与辣根过氧化物酶结合的MAbA-共同培养。1小时后，洗板加底物(如TMB)。实施例3异天冬氨酸肽类似物的ELISA与基于其它肽片段和抗体的ELISA测定的对比对本发明的多克隆ELISA和WO95/08115中描述的MAbA7ELISA，在HPLC分离的(a)合成的和(b)从尿液中分离的肽种类间的联系进行了评估。MAbA7ELISA是一种竞争性测定，其中应用了针对8AA肽(EKAHDGGR中D是正常天冬氨酸)产生的MAbA7单克隆，胶原降解的胶原固定于微滴度盘中与样品中的胶原片段竞争与单克隆抗体(MAbA7)结合。本实施例中应用的ELISA如下进行(a)多克隆的ISO-ELISA。多克隆的ELISA是基于固定化的合成肽类似物之上的，该类似物有对I型胶原α1链(谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸-组氨酸-(异)天冬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸)C端肽的异构化了的部分具有特异性的8个氨基酸序列(8AA)。在与能和这一序列进行反应的抗体培养的过程中，固定的肽异构形式的类似物与样品中的I型胶原α1链的破坏产物间发生竞争。简要地讲，把25μl样品或标准品加到覆盖有式1胶原的微板的每一孔中，随后加75μl针对胶原酶处理的I型胶原而产生的抗血清。在室温搅动的条件下培养1小时，用洗涤缓冲液洗5次。每孔中加入羊抗兔免疫球蛋白G辣根过氧化物酶结合物(100μl)。室温下培养1小时后，如前洗涤5次。加酶的作用底物(100μl/孔)，黑暗处培养15分钟后，加100μl偏磷酸(1mol/L)终止反应。用微板读数仪于540nm处读取光密度。每个样品测量两次，数据表示为ng/mol肌酸酐(Cr)，由标准的比色技术进行测量。这个测定在本文中被称为ISO-ELISA。MAbA7ELISAMAbA7是按上述方法在小鼠体内针对EKAHDGGR序列的肽(即有正常天冬氨酸的肽)而产生的单克隆抗体。这种测定方法按如下三个步骤进行第一步，预先铺有纯化的胶原酶处理过的胶原(CTC)的微滴定板，在室温下与15μl标准液或样品和100μl过氧化物酶结合的单克隆抗体液共同培养1小时。在第二步中洗涤后，各孔与100μl底物溶液于暗处室温下共同培养15分钟。最后，第三步，加100μl终止液终止反应。2小时内在450nm处测吸收值。实施例3(a)这个实施例表明可以建立对合成的EKAHDGGR或EKAHiDGGR特异的抗体。用HPLC分离合成的EKAHDGGR和EKAHiDGGR的混合物(图1，分别为峰2和峰3)。序列分析表明峰2含有异构化了的天冬氨酸。这由在组氨酸残基之后停止的测序操作表明。峰3含有通常的天冬氨酸并且序列能正常进行。收集HPLC级分，用MAbA7ELISA或多克隆ISO-ELISA测定其免疫反应性。实验证明，这两种测定方法检测单独的峰，即峰2用ISO-ELISA检测，峰3用MAbA7ELISA检测。结果如图2所示。实施例3(b)本实施表明可以从尿液中纯化ISO-ELISA相关的分子，并且这些分子可被分成含有普通天冬氨酸或异构化天冬氨酸的二肽相关物类。首先，用MAbA7对尿液进行免疫纯化。依照厂家的说明，MAbA7与CNBr活化的SepharoseTM偶联。尿液在PBS缓冲液中1∶3(v/v)稀释，用1MNaOH调pH为8.0。800ml已稀释的尿液在柱(14cm3)上再循环24小时，4℃，流速为0.8ml/min。用200mlpH8.0PBS缓冲液洗柱后，用-20℃贮存的含1％TFA(v/v)50％的饱和(NH4)2SO420ml洗脱结合的抗原。用1mlC18Sep-PakTM柱对洗脱的抗原进行脱盐。在加抗原之前，用20ml80％的甲醇(v/v)调节Sep-PakTM柱，并用含1％TFA(v/v)的水20ml进行平衡。用20ml含1％TFA(v/v)的水洗涤结合的抗原，用含0.1％TFA(v/v)的40％的乙腈(v/v)洗脱，冷冻干燥，-20℃保存。对从上述步骤中获得的特定峰中的分子进一步用HPLC进行分离，用三氟乙酸(TFA)作离子对。用氨基酸组分，氨基酸测序，质谱及在MAbA7和ISO-ELISA中的免疫反应性来分析级分。HFBAHPLC的荧光(3-羟基吡啶鎓交联)和吸收在图3中表明。进一步分离得到纯化品并用质谱和免疫反应性(表2)及氨基酸测序(表3)和氨基酸组分(表4)检测。数据表明可以鉴定分子量都在2038KD左右的三种单独的分子。在F-24-17-10峰中氨基酸测序在组氨酸后被阻遏，而在另外两个峰中(F-26-18-09和F-29-19-24，表3)得到完整的EKAHDGGR序列。氨基酸组分分析(未区分异构化的和通常的天冬氨酸)确定这三个峰含有同样的氨基酸。这些数据表明可以在尿液中鉴定这三种不同的交联二肽相关的物类。分子的区别在于EKAHDGGR序列中含有异构化的天冬氨酸或含有普通的天冬氨酸。F-24-17-10峰表明包含EKAHiDGGR序列的二肽类似物，F-26-18-09峰一个是EKAHiDGGR，另一个是EKAHDGGR，F-29-19-24峰包含EKAHDGGR序列的两个交联的肽。此外，对分子量为2039左右的分子也进行了类似的观测，这些不包含3-羟基吡啶鎓交联(因为荧光缺失)，也没有检测到天然的交联物。表2对来自尿液的用HPLC分离的肽相关物类进行的MAbA7和ISO-ELISA检测</tables>表3F-24-17-10，F-26-18-09和F-29-19-24中肽相关分子的序列数据</tables>表4F-24-17-10，F-26-18-09和F-29-19-24肽的氨基酸组成(残基/肽)</tables>多克隆测定对含有异天冬氨酸残基的肽类似物具有特异性，MAbA7测定对含有正常天冬氨酸残基的肽具有特异性。异构化的及非异构化的天冬氨酸均包含在内的二肽类似物可用两种方法检测。因此应用这两种方法对尿样所进行的检测可对含异天冬氨酸的异构体肽的水平，和正常形式的水平进行对比，给出晚建立的骨组织被破坏程度的指示。实施例4研究了异构化肽类似物出现在血清中的临床意义，研究是这样进行的从经磷酸氢盐，Ibandronate(宝灵曼公司)治疗前后的绝经后的妇女中收集血清样品，用上述的ISOELISA多克隆方法和MAbA7ELISA单克隆方法进行分析。为测定血清中I型降解产物而建立的方法，是基于一种与存在于肽和肽异构体中的EKAHDGGR氨基酸序列相混合的固定化合成肽/肽异构体之上的。用经两步碳化二亚胺法而偶联于BSA的异构化肽免疫兔子。如果在兔中应用的异构化肽比氨基酸序列的肽形式的抗原性更强，则可用偶联于BSA的肽/肽异构体混合物进行免疫。覆盖微滴定板时，用戊二醛使肽与甲状腺球蛋白偶联。与抗体共同培养的过程中，固定化的肽异构体(测定中固定化的肽无活性)和血清中I型胶原的破坏产物发生竞争。随着溶液中肽含量的增加，很少的抗体与固定化的肽异构体结合，导致光密度下降。简言之，50μl标准液(合成的8AA-肽异构体/肽混合物)或待测试管中的未知样品被加到100μl测定缓冲液中(500mmTRIS，0.0％吐温20，1.0％BSA；pH＝6.5)。从这150μl中吸取50μl加到预先铺好了的ELISA板的适当孔中。然后每孔加50μl抗体溶(对EKAHiDGGR产生的兔抗血清，在测定缓冲液1∶2000稀释)，用密封带封板，在室温，振动器上培育60分钟。随后的所有操作均在室温进行。温育后，用稀释的洗涤缓冲液(25mmol/LTRIS和50mmol/LNaClpH＝7.2)洗板三次。每孔加100μl与抗体偶联的过氧化物酶(HRP-偶联羊抗兔的IgG(JacksonImmunochemicals，PA)在测定缓冲液中1∶4000稀释)，密封的板在振荡器上温育60分钟。又一次洗涤之后，每孔加100μlTMB底物液，密封板后培养15分钟。15分钟后加100μl终止液来终止酶反应。在ELISA取读数仪上于450nm处测定密度。通过标绘5个标准品的平均吸收值，在对数线性图纸上绘制标准曲线(25ng/ml-500ng/ml)。通过在标准曲线上进行内插法，可测定每一患者标本中EKAHiDGGR的浓度。结果如图4和图5所示。图4中没有见到在单克隆测定方法中具有反应性分子的血清水平有明显改变，而这种方法是直接用于测定和抗体竞争的分子，而抗体在用预期减少骨吸收率的治疗进行15个月前后与肽序列EKAHIDGGR具有反应性。图5中可看到在用2.5mg/天的Ibandronate治疗6个月后，在多克隆测定方法中具有反应性分子的水平下降了60％以上，而这种方法是直接测定与非肽EKAHiDGGR竞争多克隆血清中的抗体的分子，这反映了预期的治疗结果。本实施例表明血清中肽的总量掺入了EKAHDGGR序列，其中也可包括美国5455179中所描述的那种交联肽和基于其它交联的相同分子或根本无交联，不作为骨吸收率的指标，但经氨基酸序列中天冬氨酸键合的异构化作用而形成的相关非肽分子则可以。这表明对八肽异构化类似物的特异性使ISOELISA对血清中在MabA7ELISA中有反应性的分子产生敏感性。相信异构化作用的水平与骨的年龄相关，因此可作为成熟骨更新的定量标志物，然而干扰单克隆测定方法的分子与骨吸收无关，并且可以“年轻”胶原分子的更新中产生，例如从还没有掺入到骨基质的细胞外基质胶原的蛋白溶解破坏物而来，或在短寿I型胶原更新的过程中在非骨架部位生成。尽管人们相信人体有通过天冬氨酸的异构化作用来修补损伤的蛋白这样的机制，但在骨胶原中，正是这种保护免于把这些修补机制产生的同分异构作用当作骨中“老”胶原吸收的不寻常的好指标。尽管已用具体的实施例对本发明进行了描述，但是在本发明范围之内可有许多变化。例如，本发明不仅应用于胶原，对含天冬氨酸或天冬酰胺的蛋白通常也可应用。权利要求1.一种测量机体蛋白降解率的方法，其包括测定体液中一种或多种含异天冬氨酸的物类的量。2.权利要求1的方法，该方法测定体液中至少一种含异天冬氨酸的异构化肽的量。3.权利要求2的方法，其中异构化肽是胶原特有的。4.权利要求3的方法，其包括测定体液中存在的式2(如下)肽类似物的量式2其中K-K-K是任意天然存在的交联，*是异天冬氨酸；或测定一种或多种肽类似物，该肽类似物掺入存在于含异天冬氨酸的式2肽类似物中的表位。5.上述权利要求中任一权项的方法，其中所述测定是应用对方法中的样品内存在的含异天冬氨酸的物类有特异性的免疫结合配体进行的。6.权利要求5的方法，其中免疫结合配体是针对线性肽类似物产生的抗体，该线性肽类似物对应于胶原中的一段序列，在所述氨基酸序列中，异天冬氨酸替换了所述胶原序列中的天冬氨酸。7.肽的合成异构体在测定肽衍生的异构化肽中的应用，所述肽的合成异构体的氨基酸序列对应于蛋白中的一段序列，在该氨基酸序列中，异天冬氨酸替换了所述蛋白序列中的天冬氨酸。8.一种对一段氨基酸序列有特异性的抗体，所述氨基酸序列对应于蛋白中的一段序列，在该氨基酸序列中，异天冬氨酸替换了所述蛋白序列中的天冬氨酸。9.权利要求8中的抗体，其对包含氨基酸序列EKAHiDGGR的肽异构体序列有特异性，或对包含于所述序列并包含iD的表位有特异性，其中iD是异天冬氨酸。10.一种针对肽异构体而产生的抗体，所述肽异构体的氨基酸序列对应于胶原中的一段序列，在该氨基酸序列中，异天冬氨酸替换了所述胶原序列中的天冬氨酸。11.一个细胞系，它可产生单克隆抗体和权利要求8-10中任一权项的抗体。12.权利要求8-10中任一权项的抗体，它与可检测标记物偶联。13.一种抗体在测定蛋白衍生的异构化肽中的应用，该抗体对一段氨基酸序列有特异性，所述氨基酸序列对应于蛋白中的一段序列，在所述氨基酸序列中，异天冬氨酸替换了所述蛋白序列中的天冬氨酸，以得到体液中含异天冬氨酸的肽类似物的含量的资料。14.一种合成的肽类似物，其氨基酸序列对应于胶原中的一段序列，在所述氨基酸序列中，异天冬氨酸替换了所述胶原序列中的天冬氨酸。15.权利要求14的合成的肽类似物，其中有甘氨酸残基与异天冬氨酸残基相邻。16.一种获取患者蛋白降解资料的方法，其包括测量体液中的至少一种源于蛋白的含天冬氨酸的肽相对含量，和相应的含异天冬氨酸的肽类似物的相对含量。17.一种用于权利要求1-6中任一权项的测定方法的检测试剂盒，其包括权利要求8-10中任一权项的抗体，或类似的特异性抗体片段，并与下述任意一种或几种物质组合包含异天冬氨酸的合成的肽类似物，它与抗体或抗体片段具有反应性，抗体-酶偶联物和/或其底物，终止酶偶联物-底物反应的组合物，或清洗溶液。全文摘要通过检测体液中蛋白的异构化肽片段,研究机体蛋白如胃胶原的降解,其中肽与天冬氨酸的α－羧基结合或天冬酰胺被异构化,酰胺与侧链天冬氨酸的羧基结合。测定中应用了对异构化肽序列特异的抗体。文档编号C07K14/78GK1185209SQ96194134公开日1998年6月17日申请日期1996年3月21日优先权日1995年3月24日发明者C·弗勒德利尔斯,M·波恩德,P·维斯特申请人:奥斯提奥米特生物技术公司