本发明涉及化学分析检测领域，具体涉及一种氘代银杏酸的制备方法。
背景技术：
银杏(ginkgobiloba.l)属于银杏科银杏属的落叶乔木。自古以来，我国就有将银杏叶入药和食疗的记载，如《本经逢源》中记载：“银杏叶归肺经，能敛肺平喘，益心止痛”。近几十年来，国内外学者对银杏中活性成分的化学、生物与药理活性以及临床和应用等进行了大量研究，银杏提取物及其制剂目前已成为国际上公认的治疗和预防心、脑血管疾病的植物药，并有望成为治疗阿尔兹海默症等老年性痴呆相关疾病的有效药。银杏酸是银杏中的一种主要成分，为6-烷基或6-烯基水杨酸的衍生物。银杏酸因具有致敏性、胚胎毒性、免疫毒性和细胞毒性等生物毒性，而被认为是银杏叶提取物及其制剂中的主要毒副作用成分，并规定其限量不得超过5ppm，银杏酸的含量己经成了银杏制剂质量标准中的一个主要控制指标。
药物分析方法中质量控制有外标法和内标法。外标法就是向空白样品中添加标准品监控分析过程及结果，外标法要求对整个操作过程严格控制，否则造成分析误差；内标法是在待测样品中添加内标物的方法进行监控，减少了许多客观因素的影响。对于内标法和外标法的选择，一般认为：对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响的条件下，首先选择内标法。因为内标法可以避免药物分析中由于复杂的基质效应、前处理和质谱检测器等因素对分析方法测定结果的影响，尤其是可以有效控制假阴性的发生，可以有效地校正方法中出现的误差，显著提高目标化合物的回收率和方法稳定性。而采用内标法进行分析时，为获得最严谨、最准确的分析结果，最佳的内标物是各分析对象的氘代标准品。
目前，国内市场上销售的氘代标准品以代理国外的产品为主，价格昂贵，而关于氘代银杏酸的产品更是空白，市场紧缺，也未见相关制备方法的研究报道。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，弥补市面上氘代银杏酸产品的紧缺，本发明提供一种工艺设计合理，可操作性强，产物纯度高，得率高，可实现工业化生产的氘代银杏酸制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种氘代银杏酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)用氘代甲醇和重水的混合溶液溶解，得二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液；
2)将银杏酸先以重水溶解，然后再添加步骤1)制备的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，搅拌，以氘代氢氧化钠调ph值至10～12，微波加热，所述的银杏酸结构式如下所示：
3)将步骤2)中反应完成的溶液以酸性调节剂调至酸性，以乙醚萃取2～5次，合并乙醚层，干燥，浓缩后得氘代银杏酸；
作为优选方案，所述步骤1)制备的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液的质量分数为1.6％～3.3％，混合溶液中氘代甲醇和重水的体积比为1∶6～10；
作为优选方案，所述步骤2)微波加热的温度为160℃～220℃，反应时间为18min～35min。
常用的制备同位素标记化合物的方法，是以使用同位素标记的反应底物来合成，在产物的预想获得方面具有优势，但是相对于自然同位素而言，需要花费更多的时间和昂贵试剂。让目标分子进行h/d交换来制备含氘化合物是一种更具有优势的方法，该方法更快、更有效和更经济实惠。该方法省去了后面纯化的步骤，但是必须采用能够有效的和可预测的模式引入氘原子。作为一种合成技术，h/d交换是一种主要集中于ph所依赖的催化和金属催化的反应过程。在实践中发现：一定质量分数的可溶性铑配合物作为一种均相催化剂，在碱性条件下特别适用于化合物中h/d的交换，但是如果铑配合物的质量分数过高，其的催化性能太强，则将会促使银杏酸分解。在上述反应环境中，碱性是有利于银杏酸的氘代反应，且开始时随着氘代氢氧化钠量的增加，银杏酸的氘代率也随之增加，当氘代氢氧化钠的量超过一定值时，氘代反应出现了回反应，因此氘代氢氧化钠的添加量要严格控制。微波辅助反应是有机合成中一种常用的方法，它能在短时间内获得高产率的产物。微波辅助具有促进h/d交换反应的效果，该原理是磁电管释放的能量能直接影响盐溶液，进而活化c-h键，提高了h/d交换效率。在实践中发现，微波的加热温度和时间均会对h/d交换反应的效果产生影响，控制不严格易产生分解现象。
作为优选方案，所述步骤2)中，每2.5mg的银杏酸内，加入的重水体积为1.6ml～3.3ml，加入的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液体积为0.1ml～0.7ml。
作为优选方案，所述步骤3)中的酸性调节剂为氘代盐酸、氘代磷酸、氘代甲酸、氘代乙酸、氘代三氟乙酸中的一种。
根据上述的氘代银杏酸制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)称取二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)于带塞试管中，加入混合溶液，混合溶液由体积比为1∶6～8的氘代甲醇和重水组成，超声辅助溶解，得质量分数为1.6％～2.8％的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液；
2)分别向微波反应罐内添加2.5mg的银杏酸，1.6ml～2.8ml的重水，0.2～0.5ml的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，以氘代氢氧化钠调ph值至10～12，混匀，密封；
3)将反应罐置于微波消解仪内，在温度为190℃～210℃的条件下，反应26min～31min；
4)完成后，将反应液转移至分液漏斗中，以氘代盐酸调ph值至3～6，加入10ml～23ml乙醚萃取，反复萃取3次，合并乙醚层，以无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得氘代银杏酸。
附图说明
图1为银杏酸的质谱图；
图2为氘代银杏酸的质谱图；
图3为银杏酸和氘代银杏酸的红外光谱图；
图4为银杏酸的1h-nmr图；
图5为氘代银杏酸的1h-nmr图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
实验试剂与仪器：
银杏酸(13:0，纯度：hplc≥98％)购自成都克洛玛生物科技有限公司；、二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)(纯度为99％)、重水(d2o)、氘代盐酸(dcl)均购于购自于百灵威公司；甲醇(ch3oh，色谱纯，oceanpak，sweden)；1mol/lnaod/d2o由钠和重水反应自制；乙醚、正己烷、无水硫酸钠、盐酸均购于北京国药试剂集团；光谱纯溴化钾购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；超纯水(>18.2mω)采用美国milli-q超纯水仪公司制备；
brukeravance-500超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪(bruker，germany)，lcqadvantagemax质谱仪(fennigancorp.，ca，uk)，ethosa微波消解仪(意大利，milestone)，电热鼓风干燥箱101型(永光明医疗仪器有限公司)，反应罐(滨海县正红塑料厂)，超声波清洗器kq3200e型(上海沪沁仪器设备有限公司)，电子天平al204型(上海梅特勒-托利多有限公司)。
实验方法：
纸喷雾质谱检测：负离子模式，纸喷雾电压-3.5kv，毛细管电压和毛细管温度分别设为10v和250℃。进样量15μl，以甲醇为洗脱液，分析氘代银杏酸样品甲醇溶液；用质谱、傅里叶变换红外光谱、核磁共振等分析技术来表征银杏酸(13:0)的h被d取代的位置和氘代率。
催化ph环境条件的选择
称250.8mg二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)于25ml带塞试管中，加入1ml氘代甲醇和8.75ml重水超声溶解，得2.5％二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，简称rh配合物溶液。分别向多个微波反应罐内添加2.5mg的银杏酸，2.8ml的重水，0μl～40μl的摩尔浓度为1.0mol/l的氘代氢氧化钠，0μl～10μl的质量分数为35％的氘代盐酸，0.2ml的质量分数为2.5％的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，混匀，密封；将反应罐置于微波消解仪内，在温度为100℃的条件下，反应30min；反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，以质量分数为50％的氘代盐酸调ph值至6，加入10ml乙醚萃取，反复萃取3次，合并乙醚层，以无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得氘代银杏酸，结果见表1-1。
由表1-1可知，rh配合物在不加酸或碱的情况下对银杏酸的h/d交换反应均没有催化性能。其中序号ii和iii可知，rh配合物加入酸或碱对银杏酸h/d交换有催化性能，加入40μl的1mol/lnaod/d2o，银杏酸的质谱图显示主峰为[m+1]峰，即一个h原子被d取代的d1峰，次峰为原物质d0峰和两个h原子被d取代的d2峰，d0、d1和d2三者相对百分含量分别为23.50％、54.64％、21.86％；rh配合物体系中加入10μl的dcl，rh配合物的催化银杏酸h/d交换效果不如碱性条件好，质谱显示主峰为原物质峰d0峰，只有极少量的d1峰。
表1-1催化剂和反应酸碱性的选择
注：分子量由纸喷质谱确定，比例由质谱相对百分含量确定。d0、d1指银杏酸h被d取代的个数。
实施例2
氘代氢氧化钠添加量的选择
分别向多个微波反应罐内添加2.5mg的银杏酸，2.8ml的重水，20μl～80μl的摩尔浓度为1.0mol/l的氘代氢氧化钠，0.2ml的质量分数为2.5％的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，混匀，密封；将反应罐置于微波消解仪内，在温度为150℃的条件下，反应30min；反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，以质量分数为50％的氘代盐酸调ph值至6，加入10ml乙醚萃取，反复萃取3次，合并乙醚层，以无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得氘代银杏酸，结果见表1-2。
由表1-2可知，银杏酸的氘代率随着氘代氢氧化钠添加量的增加而增加，反应底物d0-银杏酸的含量越来越低。氘代氢氧化钠添加量量加至50μl时，h/d交换反应迅速加快和剧烈，d0-银杏酸和d1-银杏酸的峰都消失，出现超过50％d3-银杏酸的峰，继续增加氘代氢氧化钠的量，氘代反应程度继续加大，加入60μl的氘代氢氧化钠即ph为11时，d3-银杏酸成为了主峰，为77.5％，约含1/4的d4-银杏酸，但是氘代氢氧化钠量加到80μl时，银杏酸h/d交换反应反而不如加60μlnaod的效果，氘代出现了回反应。
表1-2naod/d2o的量银杏酸h/d反应的影响
注：分子量由纸喷质谱确定，比例由质谱相对百分含量确定。d0-d4指银杏酸h被d取代的个数为0-4。
实施例3
反应温度的选择
分别向多个微波反应罐内添加2.5mg的银杏酸，2.8ml的重水，60μl的摩尔浓度为1.0mol/l的氘代氢氧化钠即ph为11时，0.2ml的质量分数为2.5％的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，混匀，密封；将反应罐置于微波消解仪内，在温度为120℃～200℃的条件下，反应15min；反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，以质量分数为50％的氘代盐酸调ph值至6，加入10ml乙醚萃取，反复萃取3次，合并乙醚层，以无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得氘代银杏酸，结果见表1-3。
表1-3温度对银杏酸h/d交换反应的影响
分子量由纸喷质谱确定，比例由质谱相对百分含量确定。d1-d5指银杏酸的h被d取代的个数。
由表1-3可知，高温有利于银杏酸h/d交换反应，但考虑到银杏酸太高温度分解加剧。120℃时银杏酸微波反应15min就发生了h/d交换，d0-银杏酸占主体，剩下66.23％，次峰为d1-银杏酸，还有少量的d2-银杏酸。升高温度，氘代率明显增加，d0峰迅速减少，d1和d2峰增加，升至180℃时，出现了d3产物。加热至200℃时反应底物d0-银杏酸仅有5％，产物主要是d3和d4-银杏酸，还出现了少量的d5-银杏酸，估计是苯环的3个芳香质子和苄基位的亚甲基2个质子发生了氘代反应，而且分解和二聚现象也不明显。
实施例4
反应时间的选择
分别向多个微波反应罐内添加2.5mg的银杏酸，2.8ml的重水，60μl的摩尔浓度为1.0mol/l的氘代氢氧化钠即ph为11时，0.2ml的质量分数为2.5％的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，混匀，密封；将反应罐置于微波消解仪内，在温度为120℃的条件下，反应5min～40min；反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，以质量分数为50％的氘代盐酸调ph值至6，加入10ml乙醚萃取，反复萃取3次，合并乙醚层，以无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得氘代银杏酸，结果见表1-4。
表1-4反应时间对银杏酸h/d交换反应的影响
注：分子量由纸喷质谱确定，比例由质谱相对百分含量确定。d0-d4指银杏酸的h被d取代的个数为0-5。
由表1-4可知，微波氘代反应相比传统的加热氘代反应快得多，大大缩短了反应时间。反应5min银杏酸就发生了比较大的h/d交换反应，d1的产物就占了30％以上，反应底物就只有60％左右。适当延长反应时间有利于银杏酸h/d交换，反应30min已检测不到底物d0-银杏酸，产物主要是为d3-银杏酸，还有约22％的d4-银杏酸。但是加长反应时间氘代率并没有升高，而是发生了回反应，产物以d0-银杏酸和d1-银杏酸为主，并且整体响应值几乎低了一个数量级。这说明高温会加快银杏酸的h/d交换速率，但反应时间长却也会产生分解现象。
实施例5
实验方法：
红外光谱检测：适量样品与溴化钾混匀后压片，进行红外光谱定性分析；核磁共振分析：用dmso-d6为溶剂，对样品进行了1h-nmr和13c-nmr检测。
氘代银杏酸的表征
称250.8mg二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)于25ml带塞试管中，加入1ml氘代甲醇和8.75ml重水超声溶解，得2.5％二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，简称rh配合物溶液。分别向微波反应罐内添加2.5mg的银杏酸，2.8ml的重水，60μl的摩尔浓度为1.0mol/l的氘代氢氧化钠即ph值为11时，0.2ml的质量分数为2.5％的二氯(五甲基环戊二烯)铑(ⅲ)溶液，混匀，密封；将反应罐置于微波消解仪内，在温度为200℃的条件下，反应30min；反应完成后，将反应液转移至分液漏斗中，以质量分数为50％的氘代盐酸调ph值至6，加入10ml乙醚萃取，反复萃取3次，合并乙醚层，以无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得氘代银杏酸，且纯度为93.5％，回收率为88.6％。分别通过质谱(见图1和2)、红外光谱(见图3)、核磁共振谱图(见图4和5)对通过上述方法制备的氘代银杏酸进行表征。
由图1和2可知：银杏酸h/d交换反应后氘代产物因含同位素d原子的个数不同会有不同的分子质量，因此可以用质谱分析和鉴别这些氘代产物。图1和2为银杏酸和氘代银杏酸的质谱图。银杏酸负离子模式下的分子离子峰[m-1]是319.3。图2中的主峰为322.5和323.4，说明银杏酸的氘代产物为主要为d3-银杏酸，含量为78.17％，还有少量的d4-银杏酸。反应底物d0-银杏酸和其他的氘代产物很少已低于检测线。d3-银杏酸和原物质d0-银杏酸在质谱图中已能完全分开，且和d0-银杏酸的自然同位素峰已分开，因此完全适合作质谱内标定量分析银杏酸含量。
由图3可知：银杏酸和氘代银杏酸的官能团一样，所以红外谱图基本一致，唯一不同的是c-h键和c-d键伸缩振动峰位置不同，c-d键的振动峰波长(2200cm-1附近)要低于苯环c-h键(3000cm-1附近)。由于银杏酸(13:0)分子量比较大，支链c-h基团比较长，苯环质子和支链烷基质子h/d交换没进行完全，因此图3中氘代银杏酸和底物普通银杏酸的红外谱图很相似，看不出很大的变化。因此需要用核磁共振光谱进一步精确的表征氘代产物的结构。
由图4可知：图4是银杏酸ga(13:0)的1h-nmr谱图，利用ga(13:0)的nmr谱可知化学位移(δ)为10.196处的宽峰是ga(13:0)的-cooh质子峰，3个苯环质子化学位移如下：h4(δ7.15，m，1h，j4,3＝8.5hz，j4,5＝7.5hz，)、h3(δ6.714d，1h，j＝8.5hz)、h5(δ6.67，d，1h，j＝7.5hz)。δ3～4之间一宽峰为银杏酸-oh质子和样品中的水分峰，δ2.592的三重峰为于苯环相连的7号苄基亚甲基质子峰，δ1.5处的多重峰为紧邻7号亚甲基的8号亚甲基质子峰，δ1.23附件的大包峰为银杏酸支链的8号亚甲基和9号甲基中间的10个亚甲基质子峰，δ0.856的三重峰为支链末端9号甲基峰。
由图4和5可知ga(13:0)甲基-ch3质子没有发生h/d交换，因此计算氘代率时没有加入其他的内标，用其他质子的积分值与-ch3的3个质子的积分值相比较来计算氘代率。因此可以看出：h4的h/d交换反应没有完全，氘代率约为57％；h3和h5的h/d交换已基本完全，氘代率为95％；h7的反应后积分将近减少了1，因此可知苄基2个质子中1个被d取代，氘代率约为94％。因此，3、5、7号位的3个质子h/d交换已基本完全，4号位的质子已经超过一半被d取代，这与质谱结果相符。