本发明涉及一种高产二萜类成分的酵母工程菌,具体涉及到一种敲除了rox1基因、yjl064w基因、ypl062w基因、erg9p基因中的任意一种或多种酵母工程菌,属于药用植物基因工程领域。
背景技术:
牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate,ggpp)是二萜类物质(包括丹参酮、β-胡萝卜素、雷公藤二萜类化合物如雷公藤甲素、紫衫二烯等)的生物合成关键前体物质。二萜类化合物通常以ggpp为底物,在二萜合酶复合体的催化作用下形成,即异戊烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,ipp)通过一系列的反应形成ggpp后,二萜合酶复合体以ggpp为其底物,经过最初的离子异构化后环化形成各种阳离子中间产物,最终通过去质子或捕获亲核物质进一步环化形成一系列二萜骨架中间体,并通过细胞色素p450结构修饰,主要包括羟基化、甲基化、异构化、脱甲基化、加成和还原等,最终生成二萜类化合物。
如丹参酮类化合物为松香烷型二萜醌类化合物,其生物合成在萜类化合物前体物质合成的基础上,通过异戊二烯基转移酶(prenyltransferases,pt)的作用产生20个碳原子的ggpp,ggpp进一步在丹参柯巴基焦磷酸合酶(s.miltiorrhizacopalyldiphosphatesynthase,smcps)和丹参类贝壳杉烯合酶(s.miltiorrhizaent-kaurenesynthase,smks)的作用下形成丹参酮类化合物的基本骨架次丹参酮二烯,在次丹参酮二烯的基础上经过甲基化和羟基化等形成丹参酮类化合物,其中细胞色素p450酶在修饰的过程中发挥着重要作用。
短叶红豆杉来源的紫衫二烯合成酶催化ggpp合成紫衫二烯,可通过将该基因导入底盘细胞中进行生物合成紫衫二烯(cn105820866a)、ggpp在八氢番茄红素合酶的作用下可以合成八氢番茄红素(cn106282207a)。
雷公藤甲素与丹参酮类化合物同属松香烷型二萜,目前已经证实丹参中的smcps与smks基因以及雷公藤中的twcps1与twts基因均能催化ggpp形成松香烷型二萜化合物前体次丹参酮二烯。
活性成分含量的积累一直是药用植物研究关注的重点,目前许多重要活性成分的获取仍然依赖于对原植物的提取,如果能够在微生物中构建重要次生代谢物的生物合成途径,实现化合物低成本、高产量的生产,这将在很大程度上减少药用植物的采挖,促进资源的可持续发展。
酿酒酵母因其遗传背景清楚、扩繁操作简单、生物安全性高等特点,被广泛的用作真核表达系统。酿酒酵母中mva途径(mevalonicacidpathway)代谢流较强,可以生成fpp(farnesyldiphosphate)、ggpp等倍半萜类、三萜类和二萜类化合物的共同前体物质。
技术实现要素:
本发明通过crispr/cas9基因编辑技术改造影响萜类前体物质含量积累的基因,达到提高萜类化合物生物合成产量的目的。
本发明涉及一种改造的酵母工程菌,在所述酵母工程过表达了hmgr、erg20/btsi融合基因或嗜酸热硫化叶菌的saggps等增强ggpp代谢流的基因中的任意一种或多种,以提高ggpp在酵母菌种的表达。
进一步地,所述的酵母菌,在过表达了上述基因的基础上,还包括敲除了如下基因中的任意一种或多种:如抑制甾醇途径上基因表达的转录因子rox1,抑制mva途径代谢流的转录因子yjl064w或ypl062w,控制fpp向三萜和甾醇途径转移的第一个关键基因erg9的启动子激活域(erg9p)。
这些基因的敲除方式,具体的可以是敲除其中的任意一种,如单独敲除酵母菌中的rox1基因,或单独敲除酵母菌中的yjl064w基因,或单独敲除ypl062w基因,或单独敲除erg9p,也可以是敲除这些基因的组合,如敲除rox1基因和erg9p,或敲除rox1基因和ypl062w基因,或敲除rox1基因和yjl064w基因,或敲除erg9p和ypl062w基因,或敲除erg9p和yjl064w基因,或敲除rox1基因、erg9p和yjl064w基因,或敲除rox1基因、erg9p和ypl062w基因,或敲除erg9p、ypl062w和yjl064w基因,或4个基因都敲除调。
本发明中,所用的酵母工程菌,可以是来源于gen.pk系酿酒酵母菌或by系酿酒酵母菌,优选为by系酿酒酵母,如可以是by4741酿酒酵母、by4742酿酒酵母或by-t20酿酒酵母。具体地,比如可以是在by4741或by4742酵母工程菌的基础上,过表达一些可以增强ggpp代谢流基因的同时,并敲除rox1、yjl064w、ypl062w或egr9p基因中的任意一种或多种。
一个优选的实施方案中,本发明涉及一种将by4742酵母菌种改造,先过表达可以提高ggpp代谢流的基因,比如hmgr、erg20/btsi、saggps等,得到一种具有相对于by4742菌株具有更高的ggpp表达的酵母菌株,即by-t20(by-t20由by4742改造而来,基因型为matαtrp1δ0leu2δ0ura3δ0,trp1::his3-ppgk1-bts1/erg20-tadh1-ptdh3-saggps-ttpi1-ptef1-thmg1-tcyc1,在其基因组中过表达了hmgr、erg20/btsi融合基因和嗜酸热硫化叶菌的saggps等增强ggpp代谢流的基因),本发明针对by-t20菌株进一步进行了如下改造:①敲除抑制甾醇途径上基因表达的转录因子rox1;②敲除抑制mva途径代谢流的转录因子yjl064w、ypl062w;③弱化fpp向三萜和甾醇途径转移的第一个关键基因erg9的表达,敲除其启动子序列的诱导型顺式元件uas。
本发明的具体实施方案中,涉及到一种通过crispr/cas9基因编辑技术改造by-t20酵母工程菌的方法,以获得一种具有更高表达二萜类合成的前体物质ggpp的工程菌,所述方法包括选择预敲除目的基因的grna靶位点序列、构建含有预敲除目的基因的grna载体质粒、设计介导预敲除目的基因的同源重组修复双链dna(dsoligo)、制备含cas9载体的酵母感受态细胞、将含有预敲除目的基因的grna载体质粒及dsoligo转化至cas9载体酵母感受态细胞中,获得突变成功的目的酵母工程菌株。
本发明的再一方面,涉及到本发明所述改造的酵母工程菌在生产ggpp中的运用,以及在生产ggpp为中间产物的产品中的运用,如在生产二萜类化合物中的运用。
在本发明的一个实施方案中,涉及到运用本发明所述改造酵母工程菌发酵生产ggpp的方法,将改造完成的酵母菌株进行萜类前体物质ggpp含量检测,筛选得到最优工程菌,可为萜类成分合成生物学研究提供良好的细胞工厂。通过检测表达产物ggpp的含量,发现与未改造的菌株产量相比,均有不同程度的提高。
本发明的又一方面,涉及到生产二萜类化合物次丹参酮二烯的酵母工程菌,将丹参二萜合酶基因smcps和smksl融合基因smksl-cps,或将雷公藤二萜合酶基因twcps1和单萜合酶基因twts组合模块twcps1-twts转化到本发明所述的改造的酵母工程菌中(优选为最优工程菌中),即可获得高产二萜类化合物次丹参酮二烯的酵母工程菌,通过检测表达产物次丹参酮二烯的含量,发现与未改造的菌株相比,产量有明显的提高。
附图说明
图1为一级通用载体pty-u01改造示意图。
图2为sgrna载体构建示意图。
图3为二级通用载体pty-u02改造示意图。
图4为multiplegrna载体构建示意图。
图5为突变基因电泳检测结果图,其中a为突变基因pcr电泳检测图谱,m为marker,每组中左为wt,右为突变基因;b为erg9p突变序列对比结果。
图6为by-t20系列改造菌株ggoh产量对比图。
图7为雷公藤二萜合酶基因转化by-hz16菌株次丹参酮二烯发酵罐产量。
具体实施方式
本发明所用试验材料
实施例1by-t20菌株说明及构建方法
by-t20菌株基因型为:matαtrp1δ0leu2δ0ura3δ0,trp1::his3-ppgk1-bts1/erg20-tadh1-ptdh3-saggps-ttpi1-ptef1-thmg1-tcyc1,来源于中国科学院天津工业生物技术研究所张学礼教授。首先将酿酒酵母菌株by4742(atccnumber:201389)基因组中的trp1基因替换成his3基因,然后在菌株染色体的rdna位点插入以下三个基因,以提高ggpp的代谢流,它们分别是:①mva途径的关键酶基因hmg1的催化活性域thmg1;②可以催化ipp和dmapp依次生成fpp和ggpp的融合酶基因bts1/erg20;③可以直接催化ipp和dmapp生成ggpp的嗜酸热硫化叶菌牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶基因saggps,各基因的启动子和终止子均以酿酒酵母by4741基因组为模板pcr扩增得到(构建方法还可参考文献:zhubodai,beibeiwang,xuelizhang,etal.scientificreorts.2014(4):3698│doi:10.1038/srep03698,1-6)。
实施例2grna位点的筛选
利用酵母crispr/cas9grna设计网站http://yeastriction.tnw.tudelft.nl/#!/[1]分别对rox1、yjl064w、ypl062w3条基因进行grna位点筛选,erg9启动子激活域靶向位点序列参考已报导文献[2]。4条基因grna序列如表1。
表1grna序列
[1]mansr,rossumhmv,wijsmanm,etal.crispr/cas9:amolecularswissarmyknifeforsimultaneousintroductionofmultiplegeneticmodificationsinsaccharomycescerevisiae[j].femsyeastres,2015,15(2):fov004.
[2]
实施例3grna载体构建
由于本发明中用到的载体较多,按照传统的载体构建方法实验过程繁琐,工作量大,因此,本发明中对原始载体进行了改造,插入iis型限制性内切酶位点,通过goldengate载体构建法可实现高通量构建,大大地精简了实验过程,操作简单方便,且阳性率较高。
1、singlegrna(sgrna)载体构建
对原grna载体p426-snr52p-grna进行改造,在20bpsgrna位点处插入两个方向相反的限制性酶切位点aari,以pu01-f和pu01-r为引物进行pcr扩增,构建成为一级通用载体pty-u01(质粒信息见表7)。接下来只要将带有粘性末端和grna序列的24nt引物退火形成双链,在t4连接酶的作用下即可完成构建。
aari:5'...cacctgc(n)4↑...3'
3'...gtggacg(n)8↑...5'
表2一级通用载体pty-u01改造引物
pcr扩增条件:
(1)pcr扩增
(2)将pcr产物用dmt酶37℃消化一小时去除质粒模板。
(3)将消化产物于120v电压下跑1.5%琼脂糖凝胶电泳,按照genejetgelextractionkit胶回收试剂盒回收6000bp左右条带,步骤如下:
①取pcr产物与6×loadingbuffer预混合,在1.5%琼脂糖凝胶上以低电压(约5vcm-1)电泳30-60min;
②用解剖刀或剃刀片切割含有dna片段的凝胶,尽可能的靠近dna片段切割,以减小凝胶的含量,将胶片放在事先称重的1.5ml离心管并称重。记录胶片的重量。注意避免长时间暴露在紫外灯下,损害dna而影响后续实验;
③加1:1量的bindingbuffer到胶片中(量以重量计,如每100毫克琼脂糖凝胶加100微升的bindingbuffer);
④在50-60℃的条件下温育凝胶混合物10min,期间颠倒混匀2-3次,促进胶融化,保证胶全部溶解,在上柱前将凝胶混合物快速涡旋混匀一次;
⑤转移最多800μl凝胶溶解液到基因回收纯化柱,13000g离心1min,弃去流出液,然后将柱放回相同的收集管;
⑥加入700μljet纯化柱13000g离心1min,彻底去除残留的washbuffer;
⑧将genejet纯化柱转移到一个干净的1.5ml离心管,加30-50μlddh2o(可60℃预热)于纯化柱膜,13000g离心1min,弃纯化柱,离心所得液体即为纯化的目的dna。
(4)采用nebt4dna快速连接试剂盒进行dna片段连接反应:
连接反应(20μl体系)
条件:25℃连接5min
(5)转化克隆感受态细胞tran1-t1,步骤如下:
①全量(20μl)加入到100μl的tran1-t1感受态细胞中,冰上放置30min;
②42℃热激60s后,冰上放置3min;
③加入500μllb培养基,30℃,180rpm振荡培养1h;
④取200μl菌液涂布在lb+100mg/lamp的固体培养基上,30℃培养过夜。
(6)挑取单菌落置于lb+100mg/lamp的液体培养基中250rpm,30℃振荡培养4~6h,用以下引物进行菌液pcr。
表3grna插入位点通用引物
将pcr产物跑1%琼脂糖凝胶电泳,在800bp附近有明亮单一条带的菌液送公司测序。
(7)将测序正确的菌液摇培,提取质粒,并将菌液中添加20%的甘油,-80℃冻存。
2、grna位点的插入
(1)将grna位点设计成为带有与载体互补粘性末端的24ntoligo,在退火程序下形成双链。oligo序列见下表。
表4grnaoligo序列
条件:95℃5min
95~25℃-1℃/min71个循环
10℃hold
(2)goldengate反应
(3)将连接产物转化克隆感受态细胞tran1-t1,涂lb+100mg/lamp的固体培养基,30℃培养过夜。
(4)挑取单菌落置于lb+100mg/lamp的液体培养基中250rpm,30℃振荡培养4~6h,菌液pcr,所用引物、体系和条件均同该实施例中关于sgrna构建的步骤(6)。将琼脂糖凝胶电泳检测出现800bp附近条带的菌液送公司测序。
(5)将测序正确的菌液摇培,提取质粒,并将菌液中添加20%的甘油,-80℃冻存。
构建得到载体质粒pty-01、pty-02、pty-03和pty-04(质粒信息见表7)。
2、multiplegrna载体构建
1、与sgrna构建思路相似,先在构建成功的pty-01_载体上插入iis型限制性内切酶位点,以pu02-f和pu02-r为引物进行pcr扩增,构建成为二级通用载体pty-u02(质粒信息见表7),再通过goldengate载体构建法进行多个grna片段的插入。
表5二级通用载体pty-u02改造引物
pty-u02的构建方法同pty-u01构建方法。
2、多个grna片段的插入
(1)设计与载体两端粘性末端互补的串联引物(表6),用于grna片段的扩增,序列如下。
表6grna片段扩增引物
(2)用上述引物的不同组合对grna片段进行pcr扩增,如下:
2grna:hty-01/06扩增erg9pgrna片段;
3grna:hty-01/02扩增erg9pgrna片段,hty-03/06扩增yjl064wgrna片段;
4grna:hty-01/02扩增erg9pgrna片段,hty-03/04扩增yjl064wgrna片段,hty-05/06扩增ypl062wgrna片段。
pcr扩增条件
(3)将各片段切胶回收纯化(同实施例3中sgrna载体构建下步骤(3))。
(4)goldengate反应
(5)将连接产物转化克隆感受态细胞tran1-t1,涂布lb+100mg/lamp的固体培养基,30℃培养过夜。
(6)挑取单菌落置于lb+100mg/lamp的液体培养基中250rpm,30℃振荡培养4~6h,菌液pcr,所用引物、体系和条件均同实施例3中关于sgrna构建的步骤(6)。将琼脂糖凝胶电泳检测2grna出现1200bp、3grna出现1600bp、4grna出现2000bp附近条带的菌液送公司测序。
(7)将测序正确的菌液摇培,提取质粒,并将菌液中添加20%的甘油,-80℃冻存。
利用酵母grna设计网站http://yeastriction.tnw.tudelft.nl设计得到20bpgrna序列,对p426-snr52p-grna质粒进行改造,通过rf克隆和goldengate载体构建法改造并构建重组质粒,包括goldenngate载体和grna质粒。质粒具体信息见下表。
表7质粒信息
实施例4dsoligo的获得
为了获得特定基因型的突变菌株,需要双链dna(dsoligo)介导同源重组修复。在酿酒酵母中,同源臂长度为60bp时即可获得80%以上的同源重组效率,本发明中采取删除整条基因的方式达到基因敲除的目的,即在各基因orf上下游各设计60bp的同源臂(共120bp)通过同源重组修复对目的基因进行敲除。rox1、yjl064w、ypl062w三条基因的dsoligo均采用合成120nt长链oligo,退火形成dna双链,回收纯化获得。
由于erg9p所需同源臂太长(>150bp),合成单链引物有困难,因此采取基因合成,pcr扩增富集纯化的方式获取。
1、oligo退火形成双链
(1)将4odoligo合成一管,用ddh2o稀释到10pmol/μl,oligo序列如下表。
表8dsoligo序列
条件:95℃5min
95~25℃-1℃/min71个循环
10℃hold
(2)dsoligo纯化
将退火产物按照genejetgelextractionkit胶回收试剂盒回收纯化,步骤如下:
①按照体积比退火体系:异丙醇:bindingbuffer=1:1:1的量混合;
②将混合液转移到genejet基因回收纯化柱中,13000×g离心1min,弃去流出液,然后将柱放回相同的收集管;
③加入700μlwashbuffer(已用乙醇稀释)到genejet纯化柱。13000×g离心1min,弃去流出液,然后将柱放回相同的收集管;
④将genejet纯化柱13000×g空柱离心1min,彻底去除残留的washbuffer;
⑤将genejet纯化柱转移到一个干净的1.5ml离心管,加20μlddh2o(可60℃预热)于纯化柱膜,13000×g离心1min,弃纯化柱,离心所得液体即为纯化的目的dsoligo。
(3)测浓度,用于后续的酵母电击转化实验。
2、erg9pdsoligo获得
(1)将去掉诱导型顺式元件uas的erg9启动子序列片段送基因合成公司合成,序列如下:
5’-ctagagaccctgcgagcgtgtcccggtgggttctgggagctctaactccgcaggaactacaaaccttgcttacacagagtgaacctgctgcctggcgtgctctgactcagtacatttcatagcccatcttcaacaacaataccgacttcatcagaatgcgttatcggttttgggtttagtgcctaaacgagcagcgagaacacgaccacgggctatataaatggaaagttaggacaggggcaaagaataagagcacagaagaagagaaaagacgaagagcagaagcggaaaacgtata-3’(seqidno:31)
(2)以合成序列作为模板,用以下引物进行pcr反应。
表9erg9p扩增引物
pcr反应体系:
(3)将pcr产物用dmt酶37℃消化一小时去除质粒模板。
(4)将消化产物于120v电压下跑1.5%琼脂糖凝胶,按照genejetgelextractionkit胶回收试剂盒回收290bp左右条带,步骤(同实施例3中sgrna载体构建下步骤(3))。
(5)以(4)回收得到的dna片段作为模板,按照(2)中程序进行再次扩增,重复多个体系。
(6)将得到的prc产物合并,按照本实施例中dsoligo纯化步骤进行纯化,测浓度,存放于-20℃备用。
实施例5by-t20化学感受态细胞制备及cas9载体的转化
1、化学感受态细胞的制备
根据frozen-ezyeasttransformationiitm试剂盒说明书进行酵母化学感受态细胞的制备,步骤如下:
(1)将by-t20菌液划sc-his固体培养平板,48h后挑取单菌落于10mlypd液体培养基中30℃,220rpm过夜培养,至od600=0.8-1.0。
(2)500×g离心4min沉淀菌体,弃上清;
(3)10mlez1重悬、洗涤菌体,2000×g离心4min,弃上清;
(4)1mlez2重悬菌体,每50μl分装一管,备用。
注:制备完的感受态细胞可以直接转化,或缓慢降温冻存至-80℃(4℃,1h;-20℃,1h;-80℃)。
2、cas9质粒转化
将p414-tef1p-cas9-cyc1t质粒转化by-t20化学感受态细胞。
(1)加入0.2-1μg质粒(≤5μl)至50μl感受态细胞中,再加入500μlez3溶液,彻底混匀;
(2)30℃孵育45min,过程中摇晃2-3次;
(3)离心浓缩菌体,取50-150μl转化混合物涂sc-his-trp固体培养基,30℃培养两天。
实施例6电击转化酵母感受态细胞的制备及电击转化
1、电击转化酵母感受态细胞的制备
挑取含有cas9质粒的by-t20单菌落,按照下面步骤制备电击转化感受态细胞:
(1)收集菌体
单菌落→10mlypd(12~16h)→50mlypd(3~5h)→od600=0.6~1.0
将菌液于4℃,10000×g离心,弃上清,用等体积4℃预冷无菌水重悬清洗一次,同样条件下离心,去上清。
(2)菌体处理
按下表配方配制处理液:
表10处理液配方组成及比例
加入等体积处理液,25℃下放置20min(dtt现用现加)。
(3)离心弃上清,用等体积1m山梨醇洗两次。
(4)用500μl1m山梨醇重悬菌体,分装成100μl/管,梯度降温冻存至-80℃冰箱。
2、grna及同源片段的转化
(1)取grna约500ng,erg9pdsoligo2μg,其余dsoligo1μg,根据不同敲除目的配成混合体系加入到100μlby-t20-cas9感受态细胞中;
(2)将感受态细胞转移至冰上预冷的电转杯中,冰上放置5min;
(3)将电转仪调制fungi-sc4(3kv)档位,电转杯擦去外壁的水珠,放入电极间,按pulse键电击一次,然后加入1ml无菌的1m山梨醇,混匀,转移至无菌ep管中,30℃孵育1~2h;
(4)将菌液轻柔离心,取200μl涂布在筛选培养基上,by-t20菌株涂布在sc-his-trp-ura固体培养基上,30℃培养48~72h。
实施例7突变菌株的获得
挑取实施例6中在grna及同源片段转化步骤中长出的单菌落,by-t20改造菌株置于sc-his培养基中摇培,至培养基浑浊,以未改造的菌株作为对照,用以下引物对菌液进行pcr,检测目的基因是否发生突变,pcr检测结果见图5a。
表11突变检测引物
pcr反应:
琼脂糖凝胶电泳检测,将阳性pcr产物送公司测序,测序正确的菌株即为突变成功菌株。实施例9cas9和grna质粒的去除
(1)将by-t20突变菌株划sc-his固体培养基,42℃培养3天,至长出单菌落;
(2)挑取单菌落,置于相同成分的液体培养基中42℃摇培,传代两次;
(3)将(2)中摇培的by-t20突变菌株分别划sc-his、sc-his-trp、sc-his-ura固体培养基,30℃培养3天,若by-t20改造菌株在sc-his固体培养基上能正常生长,在sc-his-trp和sc-his-ura固体培养基上均无法生长,则证明cas9和grna质粒均已除去。
(4)将不含质粒的突变菌株液体培养基摇培,再次pcr或测序检测基因型,确保突变正确。
(5)将基因型验证无误的菌液添加甘油至20%,置于-80℃冰箱保存。
通过crispr/cas9基因敲除技术共得到不含外源质粒的突变菌株7个,菌株的详细信息见下表。
表12菌株信息
[3]daiz,wangb,liuy,etal.producingaglyconsofginsenosidesinbakers'yeast[j].scirep,2014,4(4):3698-3698.
[4]daiz,liuy,zhangx,etal.metabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforproductionofginsenosides.[j].metabeng,2013,20(5):146.
实施例10突变菌株ggpp发酵及含量检测
以未改造菌株作为对照,将得到的突变菌株进行发酵。由于酵母中生成的ggpp无二萜合酶基因的催化便会在磷酸水解酶的作用下水解成ggoh,因此本实验通过检测ggpp的水解产物ggoh含量对ggpp进行换算定量。
1、突变菌株ggpp发酵
by-t20突变菌株用sc-his液体培养基发酵。发酵过程如下:
(1)挑取单菌落置于相应的液体培养基中30℃,200rpm摇培24h,至od600约为5;
(2)测(1)中菌液的od值,按照终浓度为od600=0.2进行稀释,30℃,200rpm摇培10-12h,进行二次活化;
(3)将(2)中的菌液按照终浓度od600=0.05进行稀释,sc-his液体培养基30℃,200rpm进行发酵,发酵体积为20ml,每个菌株做6个生物学重复;
(4)发酵10h时,向培养基中加入10%体积的正十二烷,继续发酵3天。
2、ggoh的提取和含量测定
发酵结束后,小心吸取100μl正十二烷层到pcr管中,12000rpm离心1分钟,吸取10μl上清,按照1:100溶解到正己烷中,
过0.22μm微孔滤膜,转移至液相小瓶中,密封,用于gc-ms检测。
gc-ms分析条件为:取1μl的进样,无分流的模式下,100℃保持1min,40℃·min-1升至200℃,保持1min,20℃·min-1升至300℃,保持1min;;进样口温度250℃,离子源温度250℃,电子能量70ev,对样品进行20-650m/z范围扫描。gc-ms仪器为thermoscientific公司thermotrace1310/tsq8000gaschromatograph,色谱柱为db-5ms(15m×0.25mm)。以ggoh标准品作为对照,制作标准曲线,并对样品中ggoh含量进行测定。
结果:通过发酵by-t20系列菌株发现,未改造的by-t20菌株就可以生产含量较高的ggpp,为40.26mg/l。本实验通过敲除抑制mva途径和甾醇途径基因表达的转录因子rox1、yjl064w和ypl062w,弱化fpp向三萜和甾醇途径转移的第一个关键酶基因erg9,不同方式的敲除在ggpp表达量上都获得了提升,尤其是将四个基因都敲除后,将by-t20的ggpp含量上调到了原来的6.82倍,缺陷培养基摇瓶发酵后,by-hz16菌株的ggpp产量为274.71mg/l。不同改造菌株ggpp的产量见图6。
实施例11丹参及雷公藤二萜合酶基因真核表达载体构建
前人研究表明,ggpp可在丹参的二萜合酶基因smcps和smksl以及雷公藤二萜合酶基因twcps1和单萜合酶基因twts的连续催化下生成次丹参酮二烯,次丹参酮二烯已被证实为丹参酮类化合物和雷公藤甲素的前体物质。本实验构建了smksl-cps融合酶基因真核表达载体pesc-leu::smksl-cps,以及twcps1-twts真核表达载体pesc-leu::twcps1-twts,意在将这两个质粒转化到ggpp高产菌株中,检测其生产次丹参酮二烯的能力。载体构建以课题组前期研究所得载体pesc-his::thmg1::smksl-cps[5]和pesc-trp::twcps1-twts[6]为模板,通过无缝拼接的方式构建到真核表达载体pesc-leu中。
[5]zhouyj,weig,qixianr,etal.modularpathwayengineeringofditerpenoidsynthasesandthemevalonicacidpathwayformiltiradieneproduction.[j].jacs,2012,134(6):3234-41.
[6]pingsu,hongyuguan,yujunzhao,yurutong,meimeixu,yifengzhang,tianyuanhu,jianyang,qiqingcheng,linhuigao,yujialiu,jiaweizhou,reubenj.peters,luqihuang,weigao.identificationandfunctionalcharacterizationofditerpenesynthasesfortriptolidebiosynthesisfromtripterygiumwilfordii[j].plantj,2017,doi:10.1111/tpj.13756.
1、二萜合酶基因片段扩增
扩增引物见下表。
表13二萜合酶表真核达载体构建引物
pcr扩增反应
2、pesc-leu双酶切
选取pesc-leu载体多克隆位点1的noti限制性酶切位点和多克隆位点2的bamhi限制性酶切位点为twcps1-twts片段和载体的连接位点,选取多克隆位点2的bamhi和hindiii限制性酶切位点作为smksl-cps片段和载体的连接位点。分别配制双酶切体系。
条件:37℃2h
3、切胶回收载体和扩增片段,操作同实施例3中1、singlegrna(sgrna)载体构建(3)。
4、in-fusion反应
注:n(载体):n(片段)=1:2
条件:50℃孵育15min;冰上放置。
5、将10μl拼接产物转化到50μltrans1-t1感受态细胞中,37℃复苏,涂lb+amp固体培养基,30℃培养过夜。
6、挑取单菌落,lb+amp液体培养基37℃,250rpm摇培4~6h,菌液pcr验证,引物同(表13),经琼脂糖凝胶电泳检测,若pesc-leu::smksl-cps菌液pcr产物出现4200bp附近的条带,pesc-leu::twcps1-twts菌液pcr产物出现5000bp附近的条带,则将对应菌液送公司测序。
7、将测序正确的菌液摇培,提取质粒,并将菌液中添加20%的甘油,-80℃冻存。实施例12二萜合酶真核表达载体的转化
1、以构建所得的高产ggpp工程菌株by-hz16为底盘细胞,按照实施例5的步骤制备化学感受态细胞;
2、按照实施例5步骤将pesc-leu::smksl-cps和pesc-leu::twcps1-twts质粒转化到ggpp高产酵母感受态细胞中,涂sc-leu平板。
3、挑取单菌落摇培,菌液pcr检测,引物同实施例11(表13),若pesc-leu::smksl-cps转化菌株pcr产物出现4200bp附近的条带,pesc-leu::twcps1-twts转化菌株pcr产物出现5000bp附近的条带,则为转化成功的菌株。
实施例13半乳糖诱导发酵及次丹参酮二烯含量测定
1、半乳糖诱导发酵
诱导型sc-leu液体培养基:sc-leu+0.2%葡萄糖+1.8%半乳糖
(1)挑取阳性单菌落转接入5mlsc-leu液体培养基中,30℃200rpm摇培24h至od600约为5;
(2)测(1)中菌液的od值,按照终浓度为od600=0.2进行稀释,30℃,200rpm摇培10-12h,进行二次活化;
(3)将(2)中的菌液按照终浓度od600=0.05进行稀释,诱导型sc-leu液体培养基30℃,200rpm进行发酵,发酵体积为20ml,每个菌株做6个生物学重复;
(4)发酵10h时,向培养基中加入10%体积的正十二烷,发酵总时间为6天。
2、次丹参酮二烯含量测定
提取及含量测定方法同实施例10。
结果表明:将含有丹参二萜合酶基因smksl1-cps1以及雷公藤二萜合酶基因twts和twcps1构建到真核表达载体pesc-leu,并转化到by-hz16菌株中,发酵后gc-ms检测次丹参酮二烯含量,twcps1-twts-by-hz16摇瓶发酵产量为39.37mg/l,smksl-cps-by-hz16摇瓶发酵产量为93.63mg/l,产量均显著高于现有报导文献摇瓶发酵产量。
将twcps1-twts-by-hz16进行发酵罐发酵,发酵总体积为6l,发酵时间为7天时,次丹参酮二烯产量可以达到121.43mg/l(见图7)。本发明得到的二萜高产工程菌可将雷公藤甲素的前体物质次丹参酮二烯含量上调到百毫克级。
序列表
<110>首都医科大学
<120>一种高产二萜类成分的酵母工程菌
<130>背景技术中
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