本发明涉及一类甲醛荧光探针，具体地，涉及一类基于甲醛诱导催化琥珀酰亚胺水解的甲醛荧光探针及其制备方法和应用，本发明属于荧光探针技术领域。
背景技术：
甲醛是一种有强烈刺激性气味的无色气体，通常以水溶液的形式呈现，其35％到40％的水溶液被称为福尔马林，具有漂白、防腐以及消毒等作用，被广泛应用于各个领域。甲醛有毒，可以对于人眼、鼻、皮肤和呼吸道等可以产生强烈的刺激作用，长期吸入甲醛有可能会导致各种疾病，包括癌症、糖尿病、白血病、老年痴呆以及心血管疾病等。因此发明一种可以快速地，选择性地检测环境中和细胞内甲醛的方法具有重要的实际意义。
传统的甲醛检测方法包括分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等。这些方法成本高且灵敏度低，不能实时对甲醛进行简单快速的分析。同时这些方法仅适合检测环境中的甲醛，并不能实现在活细胞内的检测。而小分子荧光探针的方法因其具有选择性强、灵敏度高、响应时间快速且成本低廉等优势近年来越来越多地被应用于各个领域。同时，小分子荧光探针可以实现对活细胞等生物样品中特定物质的在线监测。
因此，开发可以对甲醛进行特异性检测，反应快速的小分子荧光探针非常有意义。
技术实现要素：
为解决本领域中的上述技术问题，本发明提供如下技术方案。
一方面，本发明提供了一类甲醛荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有下列式ⅰ或ⅱ所示的结构：
其中，r为烷基；n为自然数1、2或3。
优选地，r为甲基、乙基、丙基或正丁基。
优选地，所述式i为下列式i-1：
优选地，所述式ii为下列式ii-1：
另一方面，本发明提供了一种制备式i所示的甲醛荧光探针的方法，其特征在于，通过以下制备路线实现：
优选地，萘酰亚胺的4位n-马来酰亚胺衍生物与苄胺在四氢呋喃溶液中室温反应1小时。
优选地，萘酰亚胺的4位n-马来酰亚胺衍生物与苄胺的摩尔比为1:1。
又一方面，本发明提供了所述的甲醛荧光探针的应用，其特征在于，用于检测水环境中的甲醛或细胞内的甲醛。
再一方面，本发明提供了一种检测水环境中的甲醛的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将本发明的的甲醛荧光探针加入待测水环境，
(2)观察加入前后的荧光光谱变化，其中，荧光激发波长为359nm，
其中，所述荧光光谱变化是指：荧光光谱中，470nm左右荧光峰值的变化，所述荧光峰值变大，表明所述水环境中含有甲醛。
再一方面，本发明提供了一种检测细胞内的甲醛的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)向待测细胞内加入本发明的甲醛荧光探针，
(2)观察加入前后所述细胞荧光成像图的变化，
其中，所述荧光成像图的变化是指：收集荧光显微镜蓝色通道荧光，在检测到甲醛的情况下，蓝色通道荧光增强。
本发明取得如下有益技术效果：
(1)灵敏度高
本发明的荧光探针可以选择性与甲醛快速发生特异性反应，生成具有强荧光的产物。相较于常见的其他醛类、氨基酸和金属离子，本发明的甲醛荧光探针对于甲醛表现出了较高的选择性和灵敏性。
(2)抗干扰能力强
本发明的甲醛荧光探针，能抗乙醛、丙醛、正丁醛、苯甲醛、2-乙基丙烯醛、2-乙基丁醛、异戊烯醛、丙酮醛、异戊醛、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、过氧化氢、铝离子、钙离子、铜离子、亚铁离子、铁离子、镁离子和锌离子的干扰。
(3)应用广泛、潜力大
除了能用于检测水环境中的甲醛外，本发明荧光探针可以实现对细胞内甲醛的检测，具有潜在的实际应用价值。
(4)制备优势显著
本发明的荧光探针制备方法简单，产率较高。
附图说明
通过附图，本领域技术人员将会更加明了本发明的优点和特征。
图1是实施例荧光探针ⅰ-1的1hnmr图谱。
图2是实施例荧光探针ⅰ-1的13cnmr图谱。
图3是在pbs(10mm,ph＝7.4)中浓度为1μmol/l的实施例荧光探针ⅰ-1随不同量甲醛的加入荧光谱图的变化情况；图中，从下至上，甲醛浓度依次为0、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200μmol/l的荧光光谱图。反应时间为10分钟。
图4是在pbs(10mm,ph＝7.4)中浓度为1μmol/l的实施例荧光探针ⅰ-1与200μmol/l甲醛在15分钟内470nm处荧光强度随时间变化图。
图5是在pbs(10mm,ph＝7.4)中浓度为1μmol/l的实施例荧光探针ⅰ-1对200μmol/l不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图，图中：1、空白；2、甲醛；3、乙醛；4、丙醛；5、正丁醛；6、苯甲醛；7、2-乙基丙烯醛；8、2-乙基丁醛；9、异戊烯醛；10、丙酮醛；11、异戊醛；12、丙氨酸；13、甘氨酸；14、丝氨酸；15、精氨酸；16、半胱氨酸；17、谷胱甘肽；18、葡萄糖；19、过氧化氢；20、铝离子；21、钙离子；22、铜离子；23、亚铁离子；24、铁离子；25、镁离子；26、锌离子。反应时间为10分钟。
图6是实施例荧光探针ⅰ-1与hela细胞中甲醛响应的荧光成像图，图中，(a-b)是没有加入任何物质的成像图；(c-d)是先加入200μmol/l甲醛孵育30分钟后，再加入10μmol/l荧光探针ⅰ-1孵育15分钟后的成像图；(e-f)是加入10μmol/l荧光探针ⅰ-1孵育15分钟后的成像图；(a,c,e)为明场成像；(b,d,f)为蓝色通道荧光成像；激发波长为340–380nm，标尺为100微米。
图7是实施例荧光探针ⅱ-1的1hnmr图谱。
图8是实施例荧光探针ⅱ-1的13cnmr图谱。
图9是在pbs(20mm,ph＝5.0)中浓度为1μmol/l的实施例荧光探针ⅱ-1随不同量甲醛的加入荧光谱图的变化情况；图中，从下至上，甲醛浓度依次为0、10、20、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500、600、800、1000μmol/l的荧光光谱图。反应时间为30分钟。
图10是在pbs(20mm,ph＝5.0)中浓度为1μmol/l的实施例荧光探针ⅱ-1与500μmol/l甲醛在40分钟内470nm处荧光强度随时间变化图。
图11是在pbs(20mm,ph＝5.0)中浓度为1μmol/l的实施例荧光探针ⅱ-1对500μmol/l不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图，图中：1、空白；2、甲醛；3、乙醛；4、丙醛；5、正丁醛；6、苯甲醛；7、2-乙基丙烯醛；8、2-乙基丁醛；9、异戊烯醛；10、丙酮醛；11、异戊醛；12、丙氨酸；13、甘氨酸；14、丝氨酸；15、精氨酸；16、半胱氨酸；17、谷胱甘肽；18、葡萄糖；19、过氧化氢；20、铝离子；21、钙离子；22、铜离子；23、亚铁离子；24、镁离子；25、锌离子。反应时间为30分钟。
图12是实施例荧光探针ⅱ-1与hela细胞中甲醛响应的荧光成像图，图中，(a-b)是没有加入任何物质的成像图；(c-d)是先加入200μmol/l甲醛孵育30分钟后，再加入10μmol/l荧光探针ⅱ-1孵育15分钟后的成像图；(e-f)是加入10μmol/l荧光探针ⅱ-1孵育15分钟后的成像图；(a,c,e)为明场成像；(b,d,f)为蓝色通道荧光成像；激发波长为340–380nm，标尺为100微米。
图13是实施例荧光探针ⅱ-1与hela细胞中甲醛响应的细胞器共定位荧光成像图，先加入200μmol/l甲醛孵育30分钟后，10μmol/l荧光探针ⅱ-1孵育15分钟，然后再加入200nmol/l溶酶体红色荧光探针lyso-trackerred孵育10min。图中，(a)为明场成像；(b)为蓝色通道荧光成像，激发波长为405nm；(c)为红色通道荧光成像，激发波长为561nm。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应理解，下述说明仅是为了用于说明本发明，并不对发明内容进行限定。
实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。
实施例1荧光探针ⅰ-1的合成：
将109mg原料萘酰亚胺的马来酰亚胺衍生物(0.31mmol)溶于2ml四氢呋喃中，随后缓慢滴加35μl苄胺(0.32mmol)，将反应液处于室温搅拌1小时，反应完毕。用旋转蒸发仪减压蒸馏将反应液中的四氢呋喃除去得到粗产品。用体积比为500：1的二氯甲烷与甲醇作为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化，得到86mg淡黄色固体(产率为60％，产物为1：1的两个旋转异构体的混合物)。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.69-8.63(m,2h),7.94-7.74(m,2h),7.64-7.56(m,1h),7.42-7.31(m,5h),4.21-4.08(m,3h),4.07-3.95(m,2h),3.28-3.16(m,1h),2.97-2.86(m,1h),2.43(brs,1h),1.71(quint,j＝7.6hz,2h),1.45(sextet,j＝7.6hz,2h),0.98(t,j＝7.2hz,3h)；13cnmr(100mhz,cdcl3):δ(176.9,176.8),(174.1,173.9),163.8,(163.4,163.4),(138.4,138.4),(134.0,133.8),(132.0,131.9),(131.0,130.9),(129.2,129.2),129.0(2c),(128.6,128.4),128.5(2c),(128.2,127.9),128.0,(128.1,127.8),(127.5,127.3),(124.2,124.1),(123.6,123.5),(56.1,55.8),(52.1,51.9),40.4,(37.1,37.0),30.1,20.3,13.8。
实施例2荧光探针ⅰ-1与不同浓度甲醛反应的荧光光谱变化
取实施例1中制备的荧光探针ⅰ-1溶于dmso中，制成浓度为1mmol/l的荧光探针母液；将质量分数为37％的甲醛溶液加入到蒸馏水中，制成浓度为150mmol/l的甲醛母液。根据荧光探针和甲醛的浓度计算好所需的pbs水溶液(10mm,ph＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5ml)，取3μl荧光探针母液加入到pbs水溶液中，再加入不同浓度的甲醛母液(0–200μmol/l)，配置成探针浓度为1μmol/l的测试溶液共3ml。反应10分钟后，用荧光光谱仪测试荧光探针ⅰ-1与不同浓度甲醛反应的荧光光谱变化(激发波长为359nm)。荧光光谱变化如图3所示。可见随着甲醛浓度的逐渐增加，探针溶液在470nm处的荧光峰值逐渐增强。
实施例3荧光探针ⅰ-1与甲醛反应随时间变化的荧光谱图变化
根据荧光探针和甲醛的浓度计算好所需的pbs水溶液(10mm,ph＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5ml)，取3μl实施例2中的荧光探针母液加入到pbs水溶液中，再加入4μl甲醛母液，配制成探针浓度为1μmol/l，甲醛浓度为200μmol/l的测试溶液共3ml。用359nm作激发波长，测试其随时间变化的荧光谱图变化。如图4所示，随着时间增加，470nm处荧光峰值逐渐增强，在接近10分钟左右达到最大值。
实施例4荧光探针ⅰ-1对不同干扰分析物的选择性研究
根据荧光探针和不同干扰分析物的浓度计算好所需的pbs水溶液(10mm,ph＝7.4)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5ml)，取3μl实施例2中的荧光探针母液加入到pbs水溶液中，再加入200μmol/l的不同分析物：为甲醛、乙醛、丙醛、正丁醛、苯甲醛、2-乙基丙烯醛、2-乙基丁醛、异戊烯醛、丙酮醛、异戊醛、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、过氧化氢、铝离子、钙离子、铜离子、亚铁离子、铁离子、镁离子和锌离子，配制成探针浓度为1μmol/l，不同干扰分析物浓度为200μmol/l的测试溶液共3ml，同时留一个只加探针的空白测试样品。反应10分钟后，用荧光光谱仪测试不同样品的470nm处荧光发射强度(激发波长为359nm)。如图5所示，相对于空白测试溶液，甲醛的测试溶液的荧光发生了明显上升，而其他分析物的荧光增强不多。实验结果说明荧光探针ⅰ-1对于甲醛具有良好的选择性。
实施例5荧光探针ⅰ-1与hela细胞中甲醛的荧光成像
取实施例1中制备的荧光探针ⅰ-1溶于dmso中，制成浓度为10mmol/l的荧光探针母液。第一组细胞(含2.5mld-hanks缓冲液)不加任何分析物作为空白对照；第二组细胞先加入200μmol/l甲醛孵育30分钟后，取2.5μl荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/l，孵育15分钟，作为实验组。第三组细胞只加入2.5μl荧光探针母液，探针浓度为10μmol/l，孵育15分钟，作为控制组。随后分别用荧光显微镜对三组细胞进行荧光成像。使用的激发波长为340–380nm，收集>425nm的荧光。如图6所示，空白对照组和控制组没有荧光，实验组有明显荧光。实验结果说明荧光探针ⅰ-1可以对hela细胞内的甲醛进行荧光成像。
实施例6溶酶体靶向荧光探针ⅱ-1的合成：
将96mg原料萘酰亚胺的马来酰亚胺衍生物(0.24mmol)溶于1.5ml四氢呋喃中，随后缓慢滴加26μl苄胺(0.24mmol)，将反应液处于室温搅拌1小时，反应完毕。用旋转蒸发仪减压蒸馏将反应液中的四氢呋喃除去得到粗产品。用体积比为100：1：1的二氯甲烷比甲醇比氨水作为洗脱剂，用硅胶层析柱进行纯化，得到68mg淡黄色固体(产率为56％，产物为1：1的两个旋转异构体的混合物)。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.69-8.63(m,2h),7.95-7.75(m,2h),7.65-7.57(m,1h),7.43-7.32(m,5h),4.35(t,j＝6.7hz,2h),4.20-4.09(m,1h),4.07-3.95(m,2h),3.67(t,j＝4.8hz,4h),3.29-3.17(m,1h),2.98-2.87(m,1h),2.70(t,j＝6.7hz,2h),2.59(brs,4h)；13cnmr(125mhz,cdcl3):δ(176.9,176.8),(174.1,174.0),163.8,163.4,(138.4,138.4),(134.0,133.9),(132.0,131.9),(131.0,130.9),(129.2,129.2),128.9(2c),(128.7,128.2),128.5(2c),(128.1,127.9),128.0(2c),(127.5,127.3),(124.1,124.0),(123.5,123.4),67.1(2c),(56.3,55.9),56.2,53.9(2c),(52.2,52.1),37.5,(37.2,37.2)。
实施例7溶酶体靶向荧光探针ⅱ-1与不同浓度甲醛反应的荧光光谱变化
取实施例6中制备的荧光探针ⅱ-1溶于dmso中，制成浓度为1mmol/l的荧光探针母液；将质量分数为37％的甲醛溶液加入到蒸馏水中，制成浓度为150mmol/l的甲醛母液。由于该探针是溶酶体靶向荧光探针，因此反应溶液使用了ph＝5.0的pbs水溶液用于模拟溶酶体内的生理环境。根据荧光探针和甲醛的浓度计算好所需的pbs水溶液(20mm,ph＝5.0)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5ml)，取3μl荧光探针母液加入到pbs水溶液中，再加入不同浓度的甲醛母液(0–1000μmol/l)，配置成探针浓度为1μmol/l的测试溶液共3ml。反应30分钟后，用荧光光谱仪测试荧光探针ⅱ-1与不同浓度甲醛反应的荧光光谱变化(激发波长为359nm)。荧光光谱变化如图9所示。可见随着甲醛浓度的逐渐增加，探针溶液在472nm处的荧光峰值逐渐增强。
实施例8溶酶体靶向荧光探针ⅱ-1与甲醛反应随时间变化的荧光谱图变化
根据荧光探针和甲醛的浓度计算好所需的pbs水溶液(20mm,ph＝5.0)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5ml)，取3μl实施例7中的荧光探针母液加入到pbs水溶液中，再加入10μl甲醛母液，配制成探针浓度为1μmol/l，甲醛浓度为500μmol/l的测试溶液共3ml。用359nm作激发波长，测试其随时间变化的荧光谱图变化。如图10所示，随着时间增加，472nm处荧光峰值逐渐增强，在接近30分钟左右达到最大值。
实施例9溶酶体靶向荧光探针ⅱ-1对不同干扰分析物的选择性研究
根据荧光探针和不同干扰分析物的浓度计算好所需的pbs水溶液(20mm,ph＝5.0)加入到1cm×1cm石英比色皿中(体积3.5ml)，取3μl实施例7中的荧光探针母液加入到pbs水溶液中，再加入500μmol/l的不同分析物：为甲醛、乙醛、丙醛、正丁醛、苯甲醛、2-乙基丙烯醛、2-乙基丁醛、异戊烯醛、丙酮醛、异戊醛、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、过氧化氢、铝离子、钙离子、铜离子、亚铁离子、铁离子、镁离子和锌离子，配制成探针浓度为1μmol/l，不同干扰分析物浓度为500μmol/l的测试溶液共3ml，同时留一个只加探针的空白测试样品。反应30分钟后，用荧光光谱仪测试不同样品的472nm处荧光发射强度(激发波长为359nm)。如图11所示，相对于空白测试溶液，甲醛的测试溶液的荧光发生了明显上升，而其他分析物的荧光增强不多。实验结果说明荧光探针ⅱ-1对于甲醛具有良好的选择性。
实施例10溶酶体靶向荧光探针ⅱ-1与hela细胞中甲醛的荧光成像
取实施例7中制备的荧光探针ⅱ-1溶于dmso中，制成浓度为10mmol/l的荧光探针母液。第一组细胞(含2.5mld-hanks缓冲液)不加任何分析物作为空白对照；第二组细胞先加入200μmol/l甲醛孵育30分钟后，取2.5μl荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/l，孵育15分钟，作为实验组。第三组细胞只加入2.5μl荧光探针母液，探针浓度为10μmol/l，孵育15分钟，作为控制组。随后分别用荧光显微镜对三组细胞进行荧光成像。使用的激发波长为340–380nm，收集>425nm的荧光。如图12所示，空白对照组和控制组没有荧光，实验组有明显荧光。实验结果说明荧光探针ⅱ-1可以对hela细胞内的甲醛进行荧光成像。
实施例11溶酶体靶向荧光探针ⅱ-1与hela细胞中甲醛响应的细胞器共定位荧光成像
向hela细胞(含2.5mld-hanks缓冲液)先加入200μmol/l甲醛孵育30分钟后，取2.5μl实施例10中配制的荧光探针母液加入其中，探针浓度为10μmol/l，孵育15分钟，然后再加入200nmol/l溶酶体红色荧光探针lyso-trackerred孵育10min。随后用荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像。蓝色通道激发波长为405nm，收集425–475nm的荧光；红色通道激发波长为561nm，收集570–620nm的荧光。如图13所示，蓝色通道和红色通道的荧光有很好的重合。经过计算，蓝色通道和红色通道的共定位系数为0.93。实验结果说明，荧光探针ⅱ-1可以很好地定位在溶酶体上，并可以对其中的甲醛进行荧光成像。
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。