本发明涉及一种用于检测玉米中1768基因的引物组及其应用。
背景技术：
玉米(zeamaysl.)是禾本科中玉米族,玉米属的玉米种,玉米属中只有一个玉米栽培种,目前尚未发现野生种。但在玉米族中,除玉米属外还有七个属。其中起源于亚洲的有五个属,起源于美洲的三个属。类玉米属是与玉米种亲缘最近的一个属,包括两个种即:墨西哥野生玉米和多年生玉米。玉米按其籽粒形状,胚乳性质与结构及秤壳的有无,可以分为九个类型或亚种。即硬粒型、马齿型、半马齿型、粉质型、甜质型、甜粉型、糯质型、爆裂型和有移型。玉米起源拉丁美洲墨西哥、秘鲁一带。明朝(1500-1511年)开始传入我国。经400多年的风土驯化,栽培选择形成了各种生态型的丰富的地方品种。目前而言，饲料消费仍然是玉米的最重要的消费渠道，大约占总消费量的70%左右，而口粮消费并没有想象中那么高，仅仅只占据了5%的比重。剩下的大部分都被作为粮食储备而保存着。由于它的可利用能量高，亚油酸的含量较高，所以是最受欢迎的饲料之一。虽然它所包含的蛋白含量偏低并且种类偏少，但是仍然不能撼动它成为一种非常重要的粮食的地位。
玉米产量与其籽粒大小和胚乳饱满程度息息相关，胚乳是种子内营养物质的储藏场所，是一种可再生的、能够被生物分解利用的原材料。人们通过改良胚乳特质可以更好的应用于饲料、食品加工以及深加工产品。因此控制籽粒大小及胚乳发育的相关基因的研究具有重要的理论和实践意义。同时玉米因其物种优异的遗传操作性和长期积累的丰富的遗传学资源，使其成为遗传学和基因组学研究的模式系统。另外玉米作为高效的c4植物，其对研究生物产量和光合作用能源模式也具有重要研究意义。
1768经过遗传学分析，发现其是一个单基因控制的隐性突变，突变体呈现opaque（opaquekernel）表型，这是一类影响广泛的突变体类型，其中大多数的胚乳发育成粉质，这类突变通过影响诸多重要生物进程使得其对种子发育机制、代谢途径以及营养积累都具有重要研究意义。根据对1768进行同源性分析以及功能预测，推测1768为rrp44基因，此基因在酵母与人类中研究的很透彻，在拟南芥中找到了其同源基因，rrp44的主要功能是具有3′至5′核糖核酸外切酶活性并且参与成熟细胞rna的加工与降解。对于植物的生长发育起到了及其重要的作用，我们提取了1768野生型和突变体成熟籽粒胚乳中的醇溶蛋白，通过sds-page检测，我们发现突变体中27kda醇溶蛋白的含量在突变体中有所降低，研究表明醇溶蛋白含量的下降植物体作为代偿反应相应的非醇溶蛋白含量会有所增加，进而提高了玉米的营养价值。对于1768基因功能的探索，可以研究和分析醇溶蛋白的调控机制以及玉米质量和品质之间的平衡关系，为玉米品质的改良提出了一个新的途径和可能，对于玉米品质改良具有重要的意义。
该基因的定位是通过图位克隆技术，该实验材料的获得是通过分子标记辅助育种技术，该技术主要是利用与目标性状基因紧密连锁的dna分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术，该技术可在早期对目标基因的转移进行准确并且稳定的选择,同时也能解决再度利用隐性基因识别难的问题,因此能够达到提高育种效率的目的，与常规育种相比,该技术可提高育种效率的2-3倍。分子标记辅助育种技术的基本特点有：（1）所选择的分子标记必须是能够区分育种过程中杂交亲本(纯合1768类型和纯合野生型类型)以及它们杂交子代(f1代)的显性引物组；（2）获得的引物组与控制目标性状基因的连锁情况,连锁越紧密在其后代中错选的概率越低；（3）该引物组可以区分突变体与国内所有主要育种亲本。以往研究中并没有获得位于1768基因上并且与其完全连锁的引物组,故无法对该基因所控制的目标性状进行dna分子标记辅助选择,同时,以往也未获得能够区分突变体与国内所有主要育种亲本的分析标记。所以,对于该种标记的获得和鉴定是对研究玉米体内rrp44基因的功能的重要基础。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种用于检测玉米1768基因的引物组。
本发明的目的之二在于提供该引物组的用途。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测玉米1768基因的引物组，其特征在于：
扩增该基因左侧dna片段的第一对特异性引物fo1-74的碱基序列为：
正向引物从5′端至3′端为：gctgccatcctgaaatcata；
反向引物从5′端至3′端为：ccatgctctggtctcctcat；
扩增该基因右侧dna片段的第二对特异性引物fo1-109的碱基序列为：
正向引物从5′端至3′端为：tgcaccatgtccgtatgttt；
反向引物从5′端至3′端为：gacagcgacttttcctggag。
一种上述用于检测玉米1768基因的引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及其杂交子代基因型的应用。
本发明中提供了2个位于1768基因染色体物理位置两侧，并与其紧密连锁的显性dna分子标记。提供这两个分子标记的同时也发现了利用这两个显性dna分子标记对1768基因进行分子标记辅助选择的方法。这两个分子标记的最大特点和用途是能够对玉米任何生长发育时期以及任何组织的dna进行基因型鉴定,与此同时其检测杂交育种子代各单株中1768基因的存在与否以及是杂合或纯合状态准确性很高,检测程序操作简单,为利用1768基因的dna分子标记辅助育种提供重要的技术手段。
附图说明
图1为1768突变体表型图以及醇溶蛋白差异图；
图2为标记1在w22背景下f2群体中的分离情况，一共20颗籽粒的dna，1-10为野生型（包括+/+和1768/+），11-20为1768/1768纯和突变体（-/-）；
图3为标记2在w22背景下f2群体中的分离情况，一共20颗籽粒的dna，1-10为野生型（包括+/+和1768/+），11-20为1768/1768纯和突变体（-/-）；
图4为本发明中2个分子标记在玉米1号染色体短臂上物理位置的示意位置,其中cen1代表1号染色体着丝粒,tel代表端粒；
图5是标记1在不同自交系间的多态情况；
图6是标记2在不同自交系间的多态情况。
具体实施方法
下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.）或植物分子生物学-实验手册（plantmolecularbilogy:alaboratorymanual,melodys.clark编，springer-verlagberlinheidelberg,1997出版），中所述条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：两个显性分子标记的获得
通过图位克隆对玉米1768基因进行基因定位，在maizegdb上找到定位区间内的基因，进行测序，发现该基因在第20个内含子末端ag突变称cg导致后边的外显子前端13个碱基的缺失。与拟南芥中相似功能的基因进行序列比对，发现同源性很高，认为是具有3′至5′核糖核酸外切酶活性并且参与成熟细胞rna的加工与降解的基因。
本发明通过经典图位克隆方式，得知该基因位于1号染色体。通过分子标记辅助育种技术得到1768的f2群体，抽提纯和突变体、野生型以及f2群体各单株的基因组。首先进行粗定位，在粗定位的基础上筛选一部分有多态的ssr标记（fo1-74与fo1-109），经过上群体把1768基因定位于fo1-74与fo1-109之间。这只是其中的两对分子标记，若想得到更多有多态的分子标记，可以根据fo1-74与fo1-109之间已知的b73基因组序列（http://www.genome.arizona.edu/fpc/maiz）来设计引物。
扩增dna片段fo1-74的特异性引物及碱基序列为
正向引物从5′端至3′端为：gctgccatcctgaaatcata；
反向引物从5′端至3′端为：ccatgctctggtctcctcat；
扩增dna片段fo1-109的特异性引物及碱基序列为：
正向引物从5′端至3′端为:tgcaccatgtccgtatgttt；
反向引物从5′端至3′端为：gacagcgacttttcctggag。
通过测序并对比序列，寻找到纯和突变体与纯和野生型的序列差异，通过所测序列开发标记，能够获得区分育种过程中杂交亲本纯和1768类型与纯和野生型、以及其杂交子代的基因型的显性分子标记fo1-74与fo1-109。
实施例二显性分子标记fo1-74与fo1-109同1768连锁关系的确认
抽提1768/1768与w22背景杂交后f2代群体基因组，一共20颗籽粒的dna进行连锁关系验证。其中1-10为野生型表型的籽粒，基因型包括（+/+和1768/+）；11-20为纯和突变体表型的籽粒，基因型为（-/-）。通过这20颗籽粒的dna进行两个标记与1768连锁关系的确定（参见附图2和3）。实验结果分析表面，fo1-74与fo1-109同1768很连锁，可通过这两个引物，增加群体数量，以达到定位基因的目的。分子标记fo1-74与fo1-109在染色体上与1768的物理位置关系特征参加附图4。
实施例三分子标记在不同亲本之间的多态性验证
选取12种广泛应用的自交系分别为黄c、b73、bim、浓137、9801、综3、9086、w22、ph4cv、郑58和黄早4，抽取其基因组dna，通过pcr反应分析两对显性分子标记在不同品种间的多态性。分析结果显示，本发明中所涉及的两对显性分子标记fo1-74与fo1-109能够区分1768与其余所有自交系，详细结果参见附图5和6。此结果进一步说明，使用本发明中的两个分子标记能够在任何育种背景群体中准确鉴定到1768基因。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
<110>上海大学
<120>用于检测玉米1768基因的引物组及其应用
<160>4
<210>1
<211>20
<212>单链dna
<213>人工序列
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gctgccatcctgaaatcata20
<210>2
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<212>单链dna
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gacagcgacttttcctggag20
序列表
<110>上海大学
<120>用于检测玉米1768基因的引物组及其应用
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