本发明涉及一种聚合利用扬稻4号的三个纹枯病抗性基因的方法，该方法可利用3个分子标记同时聚合3个纹枯病抗性基因以选育抗纹枯病的水稻材料。
背景技术：
水稻是关乎我国粮食安全的重要粮食作物。我国水稻育种界选育纹枯病抗病水稻的传统方法都是通过表型选择进行的，即用纹枯病致病菌在不同的水稻发育时期对水稻单株进行接种鉴定。由于传统的接种鉴定大部分是在田间种植条件下进行的，接种鉴定的结果误差大，准确性差，而且不同年份的接种结果存在差异，导致接种鉴定结果的准确率低。通过分子标记对水稻纹枯病抗性相关基因进行选择可以在水稻苗期即对纹枯病抗性进行选择，选择的准确率高，可以大大提高育种效率。水稻的纹枯病抗性是一个数量性状，受多个数量性状基因座位(qtl)控制。水稻科研界目前已经定位出许多与水稻纹枯病抗性相关的qtl，但是哪些qtl是共同调控水稻纹枯病抗性的？哪些qtl可以同时应用在一个育种过程中？我们对这些问题的了解并不多。根据目前已经报道的与水稻纹枯病抗性基因连锁的分子标记随意将不同的几个抗性基因聚合在一起，希望获得抗性加强的水稻材料这样一个美好的想法在实际操作过程中往往不可行，因为随意选出的几个抗性基因很有可能存在基因之间的上位性互作效应，导致聚合了多个抗性基因的材料的纹枯病抗性反而降低了。为了有效的提高育种效率，加快育种进程，本发明提出一种聚合利用扬稻4号的三个纹枯病抗性基因的方法，该方法利用3个分子标记同时聚合了3个水稻纹枯病抗性基因，以培育抗纹枯病的水稻新株系，该方法可大大提高育种效率。
技术实现要素：
本发明包括以下步骤：
(1)将水稻品种lemont作为母本与水稻品种扬稻4号作为父本进行杂交，并构建重组自交系分离群体fn，所述fn中的n≥5；
(2)用分子标记rm409、d715、d804分别pcr扩增步骤(1)获得的重组自交系分离群体内的不同株系的叶片dna，根据rm409标记与水稻第9染色体上的纹枯病抗性基因qsbrleyd9b连锁的特点，根据d715标记与水稻第7染色体上的纹枯病抗性基因qsbrleyd7a连锁的特点，根据d804标记与水稻第8染色体上的纹枯病抗性基因qsbrleyd8a连锁的特点，将rm409、d715、d804标记的pcr扩增产物分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，将rm409标记扩增扬稻4号的带型命名为a，将d715标记扩增扬稻4号的带型命名为b，将d804标记扩增扬稻4号的带型命名为c，将rm409标记扩增lemont的带型命名为d，将d715标记扩增lemont的带型命名为e，将d804标记扩增lemont的带型命名为f；选择携带a、b、c带型数目越多的株系即是纹枯病抗性越强的水稻株系，选择携带d、e、f带型数目越多的株系即是纹枯病抗性越差的水稻株系。
进一步地，所述步骤(2)中，携带不同数目的a、b、c带型的株系的纹枯病抗性按从强到弱排序为：聚合a、b、c全部三种带型的株系>携带a、b、c三种带型中的任意两种带型的株系>携带a、b、c三种带型中的任意一种带型的株系>不携带a、b、c三种带型中的任何一种带型的株系；需要指出的是，上述排序大小仅适用于种植在同一个环境条件下对同一个fn世代内的分离群体内的株系进行比较，所述fn中n为固定数值。
进一步地，所述步骤(2)中，携带不同数目的d、e、f带型的株系的纹枯病抗性按从弱到强排序为：聚合d、e、f全部三种带型的株系<携带d、e、f三种带型中的任意两种带型的株系<携带d、e、f三种带型中的任意一种带型的株系<不携带d、e、f三种带型中的任何一种带型的株系；需要指出的是，上述排序大小仅适用于种植在同一个环境条件下对同一个fn世代内的分离群体内的株系进行比较，所述fn中n为固定数值。
具体实施方式
实施例1：在水稻品种lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的f6代分离群体中，rm409、d715、d804标记的应用。
1.将水稻品种lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建f6代分离群体(lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的f6分离群体于2013年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验场。
2.利用标记rm409、d715、d804分别对这个219个株系的重组自交系分离群体内的每一株系进行pcr检测。将rm409标记扩增扬稻4号的带型命名为a，将d715标记扩增扬稻4号的带型命名为b，将d804标记扩增扬稻4号的带型命名为c，将rm409标记扩增lemont的带型命名为d，将d715标记扩增lemont的带型命名为e，将d804标记扩增lemont的带型命名f。a、b、c分别是与第9、第7、第8染色体上的3个纹枯病抗性等位基因紧密连锁的分子标记的带型，用a、b、c分别代表3个纹枯病抗性等位基因。d、e、f分别是与第9、第7、第8染色体上的3个纹枯病感病等位基因紧密连锁的分子标记的带型，用d、e、f分别代表3个纹枯病感病等位基因。
3.选择携带a、b、c带型数目越多的株系即是越抗水稻纹枯病的株系，选择携带d、e、f带型数目越多的株系即是越感水稻纹枯病的株系(表1)。
表1.在f6世代利用rm409、d715、d804标记进行选择得到的携带不同基因型的株系的平均纹枯病病斑长度、平均病级，该f6群体于2013年5月播种于杭州
从表1可以看出，聚合a、b、c的数目越多则平均病斑长度越小、平均病级越小，纹枯病抗性就越强，聚合全部3个a、b、c的平均病斑长度和平均病级是最小的(分别为17.7和2.2)，聚合a、b、c中的任意两个次之(分别为21.4和2.6)，聚合a、b、c中的任意一个再次之(分别为23.6和3.1)，不携带a、b、c中的任意一个的纹枯病抗性是最弱的(平均病斑长度和平均病级分别为25.5和3.4)。d、e、f三种带型聚合情况与此类似。表1的结果证明了利用rm409、d715、d804三个标记同时对三个纹枯病抗性基因进行选择的效果是有效的。
实施例2：在水稻品种lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的f9代分离群体中，rm409、d715、d804标记的应用。
1.将水稻品种lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建f9代分离群体(lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的f9分离群体于2015年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验农场。
2.利用标记rm409、d715、d804分别对这个219个株系的重组自交系分离群体内的每一株系进行pcr检测。将rm409标记扩增扬稻4号的带型命名为a，将d715标记扩增扬稻4号的带型命名为b，将d804标记扩增扬稻4号的带型命名为c，将rm409标记扩增lemont的带型命名为d，将d715标记扩增lemont的带型命名为e，将d804标记扩增lemont的带型命名f。a、b、c分别是与第9、第7、第8染色体上的3个纹枯病抗性等位基因紧密连锁的分子标记的带型，用a、b、c分别代表3个纹枯病抗性等位基因。d、e、f分别是与第9、第7、第8染色体上的3个纹枯病感病等位基因紧密连锁的分子标记的带型，用d、e、f分别代表3个纹枯病感病等位基因。
3.选择携带a、b、c带型数目越多的株系即是越抗水稻纹枯病的株系，选择携带d、e、f带型数目越多的株系即是越感水稻纹枯病的株系(表2)。
表2.在f9世代利用rm409、d715、d804标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均纹枯病病斑长度、平均病级，该f9群体于2015年5月播种于杭州
从表2可以看出，聚合a、b、c的数目越多则平均病斑长度越小、平均病级越小，纹枯病抗性就越强，聚合全部3个a、b、c的平均病斑长度和平均病级是最小的(分别为18.7和2.5)，聚合a、b、c中的任意两个次之(分别为19.9和2.7)，聚合a、b、c中的任意一个再次之(分别为24.9和3.3)，不携带a、b、c中的任意一个的纹枯病抗性是最弱的(平均病斑长度和平均病级分别为29.9和3.7)。d、e、f三种带型聚合情况与此类似。表2的结果证明了利用rm409、d715、d804三个标记同时对三个纹枯病抗性基因进行选择的效果是有效的。
实施例3：在水稻品种lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的f11代分离群体中，rm409、d715、d804标记的应用。
1.将水稻品种lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建f11代分离群体(lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的f11分离群体于2016年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验农场。
2.利用标记rm409、d715、d804分别对这个219个株系的重组自交系分离群体内的每一株系进行pcr检测。将rm409标记扩增扬稻4号的带型命名为a，将d715标记扩增扬稻4号的带型命名为b，将d804标记扩增扬稻4号的带型命名为c，将rm409标记扩增lemont的带型命名为d，将d715标记扩增lemont的带型命名为e，将d804标记扩增lemont的带型命名f。a、b、c分别是与第9、第7、第8染色体上的3个纹枯病抗性等位基因紧密连锁的分子标记的带型，用a、b、c分别代表3个纹枯病抗性等位基因。d、e、f分别是与第9、第7、第8染色体上的3个纹枯病感病等位基因紧密连锁的分子标记的带型，用d、e、f分别代表3个纹枯病感病等位基因。
3.选择携带a、b、c带型数目越多的株系即是越抗水稻纹枯病的株系，选择携带d、e、f带型数目越多的株系即是越感水稻纹枯病的株系(表3)。
表3.在f11世代利用rm409、d715、d804标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均纹枯病病斑长度、平均病级，该f11群体于2016年5月播种于杭州
从表3可以看出，聚合a、b、c的数目越多则平均病斑长度越小、平均病级越小，纹枯病抗性就越强，聚合全部3个a、b、c的平均病斑长度和平均病级是最小的(分别为22.1和2.1)，聚合a、b、c中的任意两个次之(分别为28.9和2.7)，聚合a、b、c中的任意一个再次之(分别为30.1和3.1)，不携带a、b、c中的任意一个的纹枯病抗性是最弱的(平均病斑长度和平均病级分别为33.5和3.4)。d、e、f三种带型聚合情况与此类似。表3的结果证明了利用rm409、d715、d804三个标记同时对三个纹枯病抗性基因进行选择的效果是有效的。
以上3个实施例子纹枯病抗性田间接种鉴定方法采用带菌牙签接种方法，该接种方法见zou等，mappingquantitativetraitlocicontrollingsheathblightresistanceintworicecultivars(oryzasatival.)，thero.appl.genet.，2000年101卷，569-573。接种采用的纹枯病致病菌编号为zj03，由中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室提供。每个重组自交系分离群体内的株系接种3个单株，每个单株接种2个分蘖，在始穗期接种，接种后30天调查发病情况。平均病斑长度是每个接种的株系内6个分蘖的平均病斑长度，平均病级是每个接种株系内3个单株的平均值。病级评分的方法采用国际上通用的0-9级评分方法，0级代表植株不发病，9级代表植株发病死亡。在实际应用过程中，无需对重组自交系分离群体内的株系进行田间抗性接种鉴定，只需要利用rm409、d715、d804三个标记进行检测就行了，而上述实施例1至例3的田间接种鉴定结果只是为了证明rm409、d715、d804三个标记确实是有效的，实际操作过程中不需要接种鉴定。
需要指出的是，上述例子所述的聚合不同数目的a、b、c的带型或者聚合不同数目的d、e、f的带型的株系的纹枯病抗性的排序方式仅仅适用于种植在同一年份的同一个fn群体内，例如将f11群体与f9群体进行比较是没有意义的，因为不同年份的环境效应是不同的。
以上3个实施例子pcr扩增所用到的叶片dna的提取方法采用通用的ctab方法；rm409分子标记的pcr扩增程序为94℃5分钟，35个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，及最后的72℃7分钟；d715分子标记的pcr扩增程序为94℃5分钟，35个循环的94℃30秒、45℃30秒、72℃1分钟，及最后的72℃7分钟；d804分子标记的pcr扩增程序为94℃5分钟，35个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，及最后的72℃7分钟。pcr扩增产物采用通用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和硝酸银染色法进行检测。d715、d804的标记序列见zeng等，developmentof1047insertion-deletionmarkersforricegeneticstudiesandbreeding，genet.mol.res.2013年12卷第4期，5226-5235。rm409标记序列见gramene网站(www.gramene.org)。由于上述方法都是通用的常规实验方法，因此在这里不再赘述。
最后，需要指出的是，本发明不仅仅限于以上的实施例子，本领域技术人员从本发明公开内容直接推导或联想到的所有变通情况，均认为是本发明的保护范围。例如，本方法不仅仅局限于应用在lemont和扬稻4号组配的fn(n≥2)分离群体，也可应用于lemont和扬稻4号组配的bckfm(k≥1，m≥1)群体、双单倍体dh群体及用lemont和扬稻4号组配的其他分离群体等。