本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于肠道中双歧杆菌属定量的引物及定量方法。
背景技术：
双歧杆菌是存在于人和动物的胃肠道中的一种革兰氏阳性厌氧菌。它最早分离自母乳喂养婴儿的粪便。目前包含69个确定种。作为肠道微生物的内源成员或作为异源益生菌物种，双歧杆菌通常被认为具有促进健康的作用，因此被广泛应用于食品和益生产品中。而且在上世纪初就认为双歧杆菌是人与微生物相互作用中的关键共生体，并认为其在维持健康的胃肠道中起着关键的作用。随着生物技术的发展，越来越多的、存在于肠道中的微生物被发现，但是双歧杆菌依然是健康评估的关键指标之一。
张海波等收集83例足月出生婴儿出生3天内每天的粪便，通过real-timepcr对粪便中的双歧杆菌属进行定量，结果发现剖宫产婴儿粪便中的双歧杆菌属低于自然分娩组的，进而得出剖宫产影响了婴儿早期肠道菌群的正常定植(剖宫产对新生儿出生后3d内肠道双歧杆菌和乳酸杆菌定植的影响)。wang等通过real-timepcr对腹膜透析病人的粪便中的双歧杆菌属等进行定量，发现腹膜透析病人粪便中的双歧杆菌数量明显低于健康对照组的。进而推断肠道微生物失衡可能会导致肠道屏障功能受损，宿主易受病原体侵入(real-timepcranalysisoftheintestinalmicrobiotasinperitonealdialysispatients)。zheng等研究发现，患有湿疹的婴儿的肠道中双歧杆菌含量明显低于健康婴儿的(alteredgutmicrobiotacompositionassociatedwitheczemaininfants)。而takahiro等人通过real-timepcr分析人类粪便中的主要细菌时，也将双歧杆菌属就作为主要分析菌属之一(useof16srrnagene-targetedgroup-specificprimersforreal-timepcranalysisofpredominantbacteriainhumanfeces)。
目前用于双歧杆菌属定量的引物大部分基于其16srrna基因序列，早期设计的引物由于双歧杆菌测序种类有限，仅以部分双歧杆菌16srrna基因序列为目的序列，无法包括所有双歧杆菌，不具有代表性。后期以双歧杆菌管家基因或者某些功能基因为目的基因序列设计引物，但是这些基因往往不是双歧杆菌属特有的基因序列，无法确保其引物的特异性。还有某些功能基因在不同双歧杆菌中的拷贝数不同，无法保证定量结果的准确性。因此，需要特异性较好的双歧杆菌属引物，并定量检测粪便样品等复杂样品中的多种双歧杆菌。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于肠道中双歧杆菌属定量的引物，其中所述引物的上游序列为seqidno1.atcaatgattcagcaggaaacgc，下游序列为seqidno2.gttctcgtcgaacttgatgtagg。
优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属定量的引物中，所述引物的pcr扩增片段大小约250bp。
优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属定量的引物中，所述引物的pcr扩增最佳退火温度为60℃。
本发明的另一方面为提供一种构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法，包括以下步骤：
1)引物设计：
比对已经完成全基因组测序的所有双歧杆菌基因序列，寻找其共有核心基因，筛选出单拷贝核心基因，以单拷贝核心基因为目的序列设计引物；
2)引物初步筛选：
以4株双歧杆菌模式菌株为扩增模板进行pcr，利用琼脂糖凝胶电泳初步评估引物的扩增效果并确定最佳退火温度；
3)特异性试验再次筛选引物。
优选地，本发明所述构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法中，所述共有核心基因rp1n的序列为seqidno3.tcgtccactgagcaagaccaagcgttggcgtctcgattccattatcgagcgcgctaagtaacaagttcggcaaggctcgccaatcacccggcccgccccataggagcgggccgggtgattggggagaaccagctcggctaaggagaatcaatgattcagcaggaaacgcggcttcatgtcgccgacaacacgggtgcgaaggaactcctcgccatccgagtgctcggcggatcgaagcgacgctatgccggcatcggcgacgtgatcgtcgcctccgtcaaggacgcaatccctggcgggtcggtcaagaagggcgacgtggtcaaggccgtcgtcgtccgtacagtcaaggaacgccgccgtgcagacggctcctacatcaagttcgacgagaacgccgctgtgattctcggctccggccgtgaacccaagggcactcgtatcttcggaccggttggtcgtgaactgcgcgacaagcgcttcatgcgtatcgtgtccctcgcaccggaggtgatctgacatggtagccaagatcaagagcggcgacctcgtcaaggtcattcgtggcaaggaccgcggcaaggaaggcaccgtcaagcgcgttctcaaggacgaccgactgatcgtcgaaggcgttcagatcgtcaagaagcatgtgcgtgcaaccca。
优选地，本发明所述构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法中，所述双歧杆菌模式菌株为bifidobacteriumanimalisaubsp.animalis，保藏编号atcc25527t、bifidobacteriumbiufidam，保藏编号dsm20456、bifidobacteriumgallicum，保藏编号dsm20093)和bifidobacteriumlongumsubsp.infantis，保藏编号dsm20088。
优选地，本发明所述构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法中，所述步骤3)中特异性试验为微滴式数字pcr来评估与筛选所述引物。
优选地，本发明所述构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法中，所述琼脂糖凝胶电泳使用模式菌株为扩增模板进行pcr。
优选地，本发明所述构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法中，所述微滴式数字pcr为借助qx200dropletdigitalpcr系统依次对(a)双歧杆菌属亲缘相近的7个属(乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、片球菌属、肠球菌属、肠膜明串珠菌属、魏斯氏菌属)的其中一株模式菌株dna稀释液、(b)不同浓度的bifidobacteriumbifidum(dsm20456)模式菌株dna稀释液、(c)灭菌超纯水和(d)一份粪便dna稀释液进行定量检测。
本发明的另一方面为利用上述引物进行肠道中双歧杆菌属定量的方法，包括以下步骤：
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本试验比对目前已经完成全基因组测序的所有双歧杆菌的全基因序列，以其单拷贝核心基因rp1n为目的序列设计引物，通过琼脂糖凝胶电泳进行初筛、微滴式数字pcr进行复筛，筛选出一对特异性较好的双歧杆菌属引物。这对引物可以特异性的“识别”出粪便样品等复杂样品中的双歧杆菌。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中的琼脂糖凝胶特异性检测结果图；
图2为本发明的一个实施例中的微滴式数字pcr特异性检测结果图；
图3为本发明的一个实施例中的微滴式数字pcr定量结果图；
图4为本发明的一个实施例中的一份粪便的数字pcr定量检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的提供的用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如下：
bif-d7f：atcaatgattcagcaggaaacgc，
bif-d7r：gttctcgtcgaacttgatgtagg。
下面提供利用上述用于肠道中双歧杆菌属定量的引物对，实现双歧杆菌属的精确定量的实施例。
实施例1利用琼脂糖凝胶电泳检测本发明引物的特异性
以bifodobacteriumgallicum、bifodobacteriumlomgumsubsp.infantis、weissellabeninensis、weissellacofusa、weissellakandleri、lactobacilluscasei、lactobacillushelveticus、lactobacillussalivarius、enterococcusasini、enterococcusfaecium、enterococcusitalicus、pedicoccusacidilactici、pedicoccuspentosaceus、leuconostocpsedomesenteroides、streptococcusthermonphillus、lactococcusplantarum、salmonellatyphimurium、escherichiacoli、staphylococcusaureus、shigellacastellani、listeriamonocytogenes和pseudomonasaeruginosa共22株模式菌株dna为模板进行pcr扩增，其中2株为双歧杆菌模式菌株，20株为非双歧杆菌模式菌株，退火温度60℃，用1％琼脂糖凝胶电泳检测是否有扩增条带。具体结果见图1。其中，从左到右依次为marker、bifodobacteriumgallicum、bifodobacteriumlomgumsubsp.infantis、weissellabeninensis、weissellacofusa、weissellakandleri、lactobacilluscasei、lactobacillushelveticus、lactobacillussalivarius、enterococcusasini、enterococcusfaecium、enterococcusitalicus、pedicoccusacidilactici、pedicoccuspentosaceus、leuconostocpsedomesenteroides、streptococcusthermonphillus、lactococcusplantarum、salmonellatyphimurium、escherichiacoli、staphylococcusaureus、shigellacastellani、listeriamonocytogenes、pseudomonasaeruginosa。由图1可以看出，除了受试的双歧杆菌模式菌株，余下的非双歧杆菌模式菌株均未检测到。本发明提供的引物具有较好的特异性。
实施例2：利用微滴式数字pcr检验本发明引物的特异性
对bifodobacteriumlomgumsubsp.infantis、lactobacillussalivarius、enterococcusfaecium、pedicoccuspentosaceus、weissellacofusa、streptococcusthermonphillusleuconostocpsedomesenteroides和lactococcusplantarum共8株模式菌株的dna稀释液进行微滴式数字pcr定量。
具体操作如下：
将2uldna、上下游引物各0.2ul、10ul2×ddpcrsupermix和7.6ul的灭菌超纯水混合，制备成ddpcr反应液。将ddpcr反应液与微滴生成油分别加至微滴发生卡的对应孔，放入微滴生成仪。使用evagreen程序进行pcr扩增。将pcr扩增后的96孔板置于微滴分析仪进行检测和分析。evagreen扩增条件：95℃10min；95℃30s，60℃40s，40个循环；4℃，5min,90℃，5min；具体结果见图2。
借助qx200dropletdigitalpcr系统依次对(a)双歧杆菌属亲缘相近的7个属(乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、片球菌属、肠球菌属、肠膜明串珠菌属、魏斯氏菌属)的其中一株模式菌株dna稀释液、(b)不同浓度的bifidobacteriumbifidum(dsm20456)模式菌株dna稀释液(2ng/ul、0.2ng/ul、0.2×10-1ng/ul、0.2×10-2ng/ul)、(c)灭菌超纯水和(d)一份粪便dna稀释液进行定量检测。
由图2可以看出，除了受试的1株双歧杆菌模式菌株，余下的7株非双歧杆菌模式菌株均未检测到阳性微滴。说明本发明提供的引物均具有较好的特异性。
实施例3：使用本发明引物对一株双歧杆菌模式菌株进行定量
借助微滴式数字pcr系统，使用本发明引物对不同浓度的bifodobacteriumlomgumsubsp.infantis的dna稀释进行定量，具体操作为：
将2uldna、上下游引物各0.2ul、10ul2×ddpcrsupermix和7.6ul的灭菌超纯水混合，制备成ddpcr反应液。将ddpcr反应液与微滴生成油分别加至微滴发生卡的对应孔，放入微滴生成仪。使用evagreen程序进行pcr扩增。将pcr扩增后的96孔板置于微滴分析仪进行检测和分析。evagreen扩增条件：95℃10min；95℃30s，60℃40s，40个循环；4℃，5min,90℃，5min。其中，bifodobacteriumlomgumsubsp.infantisdna稀释液浓度分别为2ng/ul、0.2ng/ul、0.2×10-1ng/ul、0.2×10-2ng/ul。对应拷贝数分别依次为4320拷贝/ul、544拷贝/ul、64.9拷贝/ul和9.2拷贝/ul，不同浓度dna稀释液的拷贝数呈阶梯式降低。具体定量结果见图3。
通过图3和检测到的拷贝数可知，将本发明的引物对不同浓度bifodobacteriumlomgumsubsp.infantis的dna稀释液定量，其检测结果按照高浓度到低浓度呈阶梯状逐级下降，进而证明了其定量的灵敏性。
实施例4：使用本发明对一份粪便dna稀释液进行定量
借助微滴式数字pcr系统，使用本发明引物一份已确定含有双歧杆菌的粪便dna稀释进行定量，具体操作为：
将2uldna(～20ng/ul)、上下游引物各0.2ul、10ul2×ddpcrsupermix和7.6ul的灭菌超纯水混合，制备成ddpcr反应液。将ddpcr反应液与微滴生成油分别加至微滴发生卡的对应孔，放入微滴生成仪。使用evagreen程序进行pcr扩增。将pcr扩增后的96孔板置于微滴分析仪进行检测和分析。evagreen扩增条件：95℃10min；95℃30s，60℃40s，40个循环；4℃，5min,90℃，5min。
结果得到的拷贝为99.7拷贝/ul，具体结果见图4。
图4结果显示，阳性微滴和阴性微滴明显分开，同时检测到的双歧杆菌属拷贝数经换算之后与之前试验检测到双歧杆菌数量基本一致，进而证明本发明引物可以特异的将复杂样品中的双歧杆菌分离并定量出来。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>内蒙古农业大学
<120>一种用于肠道中双歧杆菌属定量的引物及定量方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atcaatgattcagcaggaaacgc23
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gttctcgtcgaacttgatgtagg23
<210>3
<211>669
<212>dna
<213>bifidobacterium
<400>3
tcgtccactgagcaagaccaagcgttggcgtctcgattccattatcgagcgcgctaagta60
acaagttcggcaaggctcgccaatcacccggcccgccccataggagcgggccgggtgatt120
ggggagaaccagctcggctaaggagaatcaatgattcagcaggaaacgcggcttcatgtc180
gccgacaacacgggtgcgaaggaactcctcgccatccgagtgctcggcggatcgaagcga240
cgctatgccggcatcggcgacgtgatcgtcgcctccgtcaaggacgcaatccctggcggg300
tcggtcaagaagggcgacgtggtcaaggccgtcgtcgtccgtacagtcaaggaacgccgc360
cgtgcagacggctcctacatcaagttcgacgagaacgccgctgtgattctcggctccggc420
cgtgaacccaagggcactcgtatcttcggaccggttggtcgtgaactgcgcgacaagcgc480
ttcatgcgtatcgtgtccctcgcaccggaggtgatctgacatggtagccaagatcaagag540
cggcgacctcgtcaaggtcattcgtggcaaggaccgcggcaaggaaggcaccgtcaagcg600
cgttctcaaggacgaccgactgatcgtcgaaggcgttcagatcgtcaagaagcatgtgcg660
tgcaaccca669