本发明属于分子遗传学领域，具体地说，涉及一种检测绵羊sry基因的单核苷酸多态性的方法与应用。
背景技术：
哺乳动物的性染色体(x和y染色体)，最初是由一对原始常染色体进化而来。在性染色体的进化过程中，x染色体趋向保守，基因的数量和结构在哺乳动物之间高度保守。y染色体则在进化过程中则丢失了祖先性染色体上的大部分基因。y染色体具有与其他染色体不同的特性，其95％的区域在减数分裂过程中不与x染色体发生配对重组，被称为y染色体雄性特异区(malespecificregionofychromosome，msy)，而只有位于y染色体末端的拟常染色体区域(pseudoautosomalregion,par)在减数分裂的过程中与x染色体发生重组，交换遗传物质。哺乳动物y染色体具有物种特异性的特征，其基因含量在不同的物种中有着比较大的差异，这种差异在msy区和par区均存在。
20世纪50年代以前，因为其异染色质特性和较小的长度，y染色体被认为是基因的荒漠区，不含有任何功能。但到1976年，有学者发现人y染色体有些区域的缺失与精子的生成有关，这个区域后来被称为无精症因子(azf)。研究表明10％-18％的先天性少精和无精症与位于azf的微缺失有关。随后一个被称为睾丸决定因子的性别决定基因的发现，使人们更加确信y染色体并非没有转录活性。1990年，sinclair和他的同事将这个睾丸决定因子命名为y染色体性别决定区域(sex-determiningregiony,sry)。研究发现sry基因可以启动许多雄性特异基因的表达，诱导雄性生殖腺细胞的转移和增殖，并对哺乳动物性别决定起关键作用。大量研究表明，除少数物种外，sry基因存在于几乎所有的哺乳动物中。众多研究表明sry基因是性别决定的核心基因，直接诱导精巢发育，对睾丸发育起着关键性的作用，sry能够触发睾丸的发生，决定雄性性状。sry基因在哺乳动物中是相对保守的。人类sry基因的开放阅读框包含1个外显子，可编码204个氨基酸的蛋白质。该蛋白质可分为3个区域，其中的79个氨基酸称为hmg盒(highmobilitygroupbox,hmgbox)，这个区域的蛋白质具有结合dna并使dna弯曲的功能，是sry的主要功能区。此外，hmg盒还带有2个核定位信号。比较人和小鼠、兔、小袋鼠、羊等动物的sry蛋白，结果发现在hmg区域内有70％的同源性，而在hmg区域外没有保守序列。这表明sry基因除了具有性别决定的功能之外，可能还有其他功能，如精子生成等。sry基因在绵羊上定位到y染色体的长臂上。sry基因作为父系遗传的标记，已被成功地运用于性别决定、趋中杂交、人类的起源与进化分析、系统发育分析及遗传多态性分析。虽然许多关于家养动物sry基因的研究显示有限的遗传多样性，但它仍然能够在父系遗传结构上提供一些有价值的信息。
y染色体的结构十分复杂，由大量高度重复的基因序列和回文结构组成，测序非常困难，难以研究。迄今为止，只有人类、黑猩猩、猕猴、小鼠、牛等少数物种的y染色体完成了测序。关于绵羊的y染色体，学者们只扩增出少数基因的部分片段，尚没有研究得到完整的y染色体基因序列。蒋利等(蒋利,王康环,王海,等.阿勒泰羊、藏绵羊(贾洛类群、欧拉类群)sry基因序列分析及亲缘关系研究[j].西南民族大学学报(自然科学版),2013,39(4):487-494.)利用山羊sry基因序列设计引物，扩增得到阿勒泰羊、藏绵羊sry基因整个编码区序列，其cds全长723bp，并且在不同绵羊品种间具有高度的同源性。meadows等(meadowsjr,hawkenrj,kijasjw.nucleotidediversityontheovineychromosome.[j].animalgenetics,2015,35(5):379-385.)在sry基因5′启动区筛选得到一个a/g的突变。zhang等(zhangg,vahidismf,mayh,etal.limitedpolymorphismsoftwoy‐chromosomalsnpsinchineseandiraniansheep[j].animalgenetics,2012,43(4):479-480.)在sry基因筛选到g/t的突变。
到目前为止，许多研究者已在sry基因发现snps位点，并用于绵羊父系起源进化研究及父系单倍型构建。但是绵羊sry基因snps与绵羊繁殖性状关联分析的研究较少。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种检测绵羊sry基因的单核苷酸多态性的方法与应用，利用pcr-rflp方法针对其基因位点上的单核苷酸多态性进行检测。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种绵羊sry基因的单核苷酸多态性标记，所述标记是在绵羊sry基因的的第215bp位的g/a多态。
本发明还公开了一种检测上述的单核苷酸多态性标记所用的引物，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。
本发明还公开了一种检测绵羊sry基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：
1)提取待测公绵羊全基因组dna；
2)以待测公绵羊全基因组dna为模板，利用权利要求2所述的正向引物和反向引物进行pcr扩增绵羊sry基因；
3)用限制性内切酶hpy188i消化pcr扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊sry基因上单核苷酸多态性位点的基因型。
可选地，pcr反应体系为：2×easytaqsupermix12.50μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，双蒸水10.7μl，dna模板1μl，以上体积总量为25μl。
可选地，pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62.6℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
可选地，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。
可选地，所述的单核苷酸多态性位点表现为第215bp位g或a的单核苷酸多态性，具有aa和gg两种基因型，电泳结果分别为：aa型表现为54bp、63bp、151bp和172bp四个条带；gg型表现为63bp、172bp和205bp三个条带。
本发明还公开了一种上述的单核苷酸多态性标记、引物、方法在绵羊辅助选择和分子育种中的应用。
本发明还公开了一种上述的单核苷酸多态性标记、引物、方法在胚胎性别鉴定、绵羊父系单倍型鉴定和提高公羊繁殖力中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明利用rflp-pcr方法对绵羊sry基因片段的第215bp位上的突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当位点由g突变为a时，为g>a的突变，该突变未引起氨基酸的改变，属于同义突变，使具有重要生理功能的sry基因所编码蛋白的空间二、三级构型未发生变化。
2)针对上述sry基因的snp多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的pcr引物扩增片段，能够用rflp-pcr方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明绵羊血样基因组dna电泳检测图；其中，1-4均为绵羊基因组dna；
图2是本发明绵羊sry基因pcr扩增的440bp片段的电泳图；其中，1-3泳道为公羊dna扩增产物；4-6泳道为母羊dna扩增产物；7-9泳道为灭菌水扩增产物；m为marker；
图3是本发明绵羊sry基因440bppcr产物的hpy188i酶切电泳检测sry基因多态性的电泳结果图；其中，泳道1，3：aa基因型个体(54bp、63bp、151bp和172bp)；泳道2，4：gg基因型个体(63bp、172bp和205bp)；m：marker(2000bp、1000bp、750bp、250bp和100bp)；
图4是本发明绵羊sry基因片段第215bp位snp的不同基因型测序峰图，其中图4a为绵羊sry基因片段215位gg基因型个体的测序图；图4b绵羊为sry基因片段215位aa基因型个体的测序图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明以sry基因保守序列(geneid:100529253)设计引物扩增sry基因440bp片段，以绵羊基因组为模板，进行pcr扩增，扩增产物经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态。
实施例1绵羊sry基因多态性的检测
1、绵羊血样的采集及处理
取绵羊血样5ml，加入0.5mol/l的edta500μl抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。
本发明采用绵羊品种，具体如表1所示。
表1绵羊样品信息
2、血样基因组dna的提取
(1)冰冻的血样在室温水浴中融化；
(2)将1ml全血转入一个无菌的2ml离心管中；
(3)加入等体积(1ml)的pbs缓冲液，温和摇动15-20min；
(4)4℃12000g离心10min；
(5)用移液枪弃上清，重复步骤3、4至上清液透明，沉淀白色；
(6)离心管中加dna提取液650-750μl，温和摇动使细胞沉淀悬浮；
(7)37℃水浴1h；
(8)加入蛋白酶k3μl(终浓度为60ug/ml)，混匀；
(9)在恒温水浴箱中55℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；
(10)反应液冷却至室温，加入1倍体积(800μl-1ml)的tris饱和酚，放置冰上温和摇动15min；
(11)4℃，12000g离心10min；
(12)将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；
(13)加入0.5倍体积(0.5ml)的酚和0.5倍(0.5ml)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；
(14)4℃，12000g离心10min；
(15)将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；
(16)加入1倍体积(1ml)的氯仿，放置冰上温和摇动15min；
(17)4℃，12000g离心10min；
(18)将上层水相用移液枪移到另一灭菌离心管中；
(19)加入2倍体积的预冷无水乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至dna析出，然后-20℃放置30min；
(20)4℃，12000g离心10min；弃上清液
(21)加入70％乙醇1ml，温和摇动10min；
(22)4℃，12000g离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次；
(23)真空干燥或室温下使乙醇挥发干净；
(24)根据dna的量，加入超纯水100-300μl，4℃保存至dna完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。
3、dna池的构建
(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测
选部分dna样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择dna样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行dna池的构建。
(2)od值测定
用紫外光光度计测定dna样品在260nm、280nm处的od值。计算dna含量和od260/od280的比值。如od260/od280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除rna纯化。
dna浓度(ng/μl)＝50×od260值×稀释倍数
(3)品种dna池的构建
dna检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μl，然后从浓度为50ng/μldna样品中取10μl混合构建dna池；
绵羊血样基因组dna的检测结果见图1，从图中可以看出绵羊基因组dna的质量非常高。
4、pcr扩增
以绵羊dna池为模版，以母羊dna和水为对照，用设计的引物对p进行pcr扩增，pcr总反应体系为25μl(表2)，pcr总反应程序见表3。
表2pcr反应体系
表3引物最佳pcr反应程序
5、pcr产物雄性特异性验证、纯化和测序
pcr扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到只有以公绵羊dna为模板能扩增出pcr产物条带，且扩增产物长度与预期的440bp相符合，而以母绵羊和水为模板没有任何pcr产物，可以确定pcr产物为绵羊y染色体基因片段；然后进行pcr产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用pcr产物回收纯化试剂盒(北京六合华大基因科技有限公司)纯化pcr产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：
(1)首先向吸附柱中加入500μl平衡液，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将单一的目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
(3)向胶块中加入等体积溶液pc，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(5)向吸附柱中加入700μl漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(6)向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。
(7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000r/min离心1min收集dna溶液。
(8)为了提高dna的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。
把以绵羊dna池为模板的pcr纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。绵羊sry基因目的片段的测序结果如图4所示，其核苷酸序列如seqidno.3所示。
对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；位于绵羊sry基因目的片段的第215bp位出现了g和a两种检测结果，即为筛查到的绵羊sry基因的snp多态性，该位点是为g或a的碱基多态性。
实施例2绵羊sry基因g>a突变多态性的rflp-pcr检测
由于筛查到的碱基多态性为自然酶切位点，能被常用的内切酶进行pcr-rflp鉴定。当绵羊sry基因目的片段的第215bp位未发生g>a突变时，即为突变前g，利用引物对p扩增的sry基因序列tcaga/tctga，为hpy188i的限制性内切酶识别位点；可直接通过hpy188i对目的片段的酶切进行基因分型。
1、rflp-pcr引物
pcr扩增引物为上述验证为雄性特异性的引物p：
正向引物：5’-gtctgctgcaccttcatcct-3’20nt；
反向引物：5’-gttcatgggtcgcttgacgt-3’20nt。
该引物能够扩增绵羊sry基因440bp片段。
2、rflp-pcr反应条件
pcr产物扩增体系和反应条件分别如表2和表3所述，pcr扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示，可以看到设计的引物对p能够扩增440bp的片段。
3、pcr扩增产物的hpy188i酶切
(1)酶切体系为：为hpy188i内切酶1μl，buffer5μl，ddh2o15μl，4μlpcr扩增产物，总计25μl。
(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化3-4h。
(3)hpy188i消化pcr产物后琼脂糖凝胶电泳分析
用2.5％的琼脂糖凝胶，80v电压电泳1h，核酸染料染色检测酶切结果，用uvp凝胶成像系统(geldoc-ittsimagingsystem)照相分析，并判型、记录其基因型；
由于pcr-rflp扩增的440bp片段中包含其它的hpy188i酶切识别位点，当sry基因片段的第215bp位未发生g>a突变时，pcr扩增的sry基因产物被限制性内切酶hpy188i识别后，在tcaga/tctga对扩增片段酶切，将扩增片段切为3段；而当sry基因440bp片段的第215bp位发生突变，在tcaga/tctga对扩增片段酶切，将扩增片段切为4段。
由于绵羊的y染色体为单倍体，所以当发生g>a的突变时，可形成2种不同的基因型，分别为aa和gg基因型，其pcr-rflp检测的凝胶结果如图3所示：
其中gg基因型为野生型，它的1条dna链的snp位点能被hpy188i酶切，表现为63bp、172bp和205bp的三条带；aa基因型为突变型，它的1条dna链的snp位点能被hpy188i酶切，表现为54bp、63bp、151bp和172bp四条带。根据条带的个数和条带的大小，如图3所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了点突变，将两种基因型区分开，从而检测其snp多态性。
(4)不同基因型个体pcr产物的测序验证
利用abi5019和abi3730测序仪对不同基因型个体pcr产物分别进行正反双向测序；同时，进行snp位置分析，结果表明包含63bp、172bp、205bp的三条带的gg基因型个体其sry基因440bp片段的第215bp位测序图的确表示为g，如图4a所示；而aa基因型，如图4b所示。
实施例3绵羊的sry基因目的片段的第215bp位的snp作为分子标记在不同绵羊群体多态性中的应用
1、群体单核苷酸多态性的检测
利用上述的snp多态性检测方法对绵羊496份dna样品，进行snp多态性的鉴定；统计其snp位点的频率分布情况。
2、snp位点的频率统计分析
由于y染色体的雄性特异区在减数分裂的过程中不与x染色体发生重组，为单倍体，只有两种基因型，故其基因频率和基因型相等。基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：paa＝naa/n，其中paa代表某一位点的aa基因型频率；naa表示群体中具有aa基因型的个体数；n为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。因此pa＝paa。
3、基因效应的关联分析
基因型数据：hpy188i识别的基因型(aa和gg)
公羊睾丸大小数据：白萨福克羊(12月龄)阴囊围直径
利用spss19.0软件分析基因位点与白萨福克羊睾丸大小的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用单因素方差分析(anova)探究基因型效应。
结果表明(见表4和表5)：对于hpy188i可识别的第215位的snp位点只在萨福克羊和白萨福克羊两个品种中表现出多态性，而在特克塞尔羊、杜泊羊、东弗里升羊、南非肉用美利奴羊、湖羊、藏羊和滩羊中则没有表现出多态性。在萨福克羊和白萨福克羊群体中gg基因型为优势基因型；性状关联分析表明，在白萨福克羊群体中，gg基因型个体的睾丸大小显著的高于aa基因型。结果说明sry基因215bp的snp位点可作为鉴别萨福克和白萨福克羊的父系分子遗传标记，gg基因型可以成为一个提高白萨福克羊睾丸大小的分子遗传标记。根据这个研究结果，绵羊育种工作者可以通过本发明进行胚胎性别鉴定、绵羊父系单倍型鉴定和提高公羊繁殖力。
表4绵羊sry基因片段215bp处snp基因频率分布表
表5sry基因目的片段215bp处snp与白萨福克羊睾丸大小之间的关联分析
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>兰州大学
<120>一种检测绵羊sry基因的单核苷酸多态性的方法与应用
<130>2018
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gtctgctgcaccttcatcct20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gttcatgggtcgcttgacgt20
<210>3
<211>440
<212>dna
<213>sry基因(sex-determiningregionygene)
<400>3
atttgaatacttccatgacaccggttgtatttttaagcaggtattagcgccttcacaaat60
tctgattagatgtaaacaaagaagaaagcagagcgttaatatcctgttaagcacctttgg120
tgggtttgggctggctgccaggaggtattgaggggaggtattgggggcggagaaataaat180
atttcactgcaaattttgcaccaagtcagtctctggtaagaacaacttatgaatagaacg240
gtgcaatcgtatgcttctgctatgttcagagtattgaaagacgatgtttacagtccagcg300
gtggtacagcaacaaaatactttcgcctttgggaaaacctcttccttgtgcacagacaat360
catagcgcaaacgatcagcgtgaaaggggggaaaatgttagggagagcagccagaaccac420
gtcaagcgccccatgaacaa440