本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种鉴别绿壳蛋鸡基因型的多重pcr引物及鉴别方法。
背景技术：
：鸡蛋壳颜色是重要的蛋用性状和经济性状，蛋壳颜色的深浅直接影响到鸡蛋的销售，从而影响到养殖者的经济效益。绿壳蛋因其颜色符合当前人们追求健康的需求，因而受到广泛欢迎。在我国，只有东乡绿壳蛋鸡、长顺绿壳蛋鸡等几个地方鸡种产绿壳蛋，成为宝贵的遗传资源。国内多家育种企业也通过导入绿壳蛋基因进行杂交配套培育绿壳蛋鸡专门化品系进行商业生产。但在实际生产中，由于杂合型母鸡也可以产绿壳蛋，而公鸡则不能产蛋，因此均都不通过表型检测其基因型，而常规的测交鉴定等方式不但周期长，而且人力物力浪费巨大，因此通过分子标记鉴定绿壳蛋基因型不但准确率高，极大的节约成本，而且加快育种进程，推进育种进展。punnett认为鸡的绿壳性状是1号染色体上显性绿壳基因(oocyan，o)作用的结果。bartlett等将鸡的绿壳基因(o)定位于1号染色体短臂上，它与内源病毒因子(evl)及豆冠位点(p)连锁。它们在染色体上的排列顺序为p-evl-o，遗传距离分别为4.1cm(p与o之间)和1.8cm(evl与o之间)。bitgood等进一步验证了bartlett等的结论。wang等和wragg等均发现鸡的绿壳性状是由有机阴离子转运多肽1b3基因(solutecarrierorganicaniontransporterfamilymember1b3，slco1b3，位于1号染色体65319441bp～65338450bp)的5’侧翼区插入鸟类逆转录酶病毒(eav-hp，长度约为4.2kb)所造成。当eav-hp插入到slco1b3的5’侧翼区后，导致slco1b3基因在子宫部特异表达，从而使蛋壳颜色表现为绿壳，因此，只要鉴定出待测鸡只基因组slco1b3的5’侧翼区中是否有此段插入序列即可鉴定该个体的基因型。目前报道的采用分子标记鉴定绿壳蛋基因型的专利方法虽然可以鉴定绿壳蛋基因型，但是有的方法需要二次扩增，有的方法扩增的两条目的片段在琼脂糖凝胶中存在条带相距较近，导致有的个体分离不清楚等问题。技术实现要素：本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种鉴别绿壳蛋鸡基因型的多重pcr引物及鉴别方法。本发明根据已发表的slco1b3和eav-hp序列，设计三条引物f、r1、r2。其中，f和r2均为鸡正常基因组slco1b3基因5’侧翼区中的片段，如果个体不携带插入片段，则f和r2配对，只扩增出片段长度为397bp的单一目的条带，表明该个体不产绿壳蛋；r1为eav-hp插入序列中的片段，如果个体携带插入片段，则f和r1配对，只扩增出片段长度为223bp的单一目的条带，表明该个体产绿壳蛋。如果个体的两条同源染色体中一条染色体携带插入片段，另外一条染色体不携带插入片段，则扩增出223bp和397bp两条目的条带，则该个体仍然产绿壳蛋。本引物组合与其他鉴定方法相比，只需一次扩增，而且杂合子中的两条带能够更加清楚分离，利于提高待测个体基因型鉴定准确率。本发明首先提供了一种鉴别绿壳蛋鸡基因型的多重pcr引物，其特征是，所述多重pcr引物为三条引物f、r1、r2，其中引物f和引物r2均为鸡正常基因组slco1b3基因引物，引物r1为eav-hp插入序列引物；其中：引物f：5’-tgaccagcgtagataaacat-3’(seqidno:1)；引物r1：5’-tcagaaagacccatagaaat-3’(seqidno:2)；引物r2：5’-aacacgtagcctatagcaat-3’(seqidno:3)。本发明还提供了一种鉴别绿壳蛋鸡基因型的鉴别方法，其特征是，1)提取待测鸡只的基因组dna；2)以待测鸡只的基因组dna为模板，采用引物f、r1、r2进行多重pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；3)然后pcr产物进行基因型判定：如果pcr产物只扩增出片段长度为397bp的单一目的条带，表明该个体基因型为nn/nn(非绿壳蛋)；如果pcr产物只扩增出片段长度为223bp的单一目的条带，表明该个体基因型为ls/ls(绿壳蛋)；如果pcr产物扩增出223bp和397bp两条目的条带，表明该个体基因型为ls/nn(绿壳蛋)。其中，所述步骤2)多重pcr扩增体系(25μl)：2×taqpcrmastermix12.5μl、ddh2o8.5μl、f引物(10pmol/μl)1.0μl、r1引物(10pmol/μl)1.0μl、r2引物(10pmol/μl)1.0μl，模板dna(50ng/μl)1.0μl。pcr程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，36个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。本发明的有益效果是：1、本发明根据已发表的slco1b3(genebankaccession:jn020139.1)和eav-hp(genbankaccessionnumber:jf837512)序列设计引物，引物设计针对性强，保证了鉴定方法的可靠性和准确性；2、本发明通过实验表明，该引物组合扩增出的目的片段符合预期，且没有杂带，条带特异单一，边缘清楚。本引物组合与其他鉴定方法相比，不但只需一次扩增，而且杂合子中的两条带能够更加清楚分离，利于提高待测个体基因型鉴定准确率。具体实施方式实施例1：鉴定绿壳蛋鸡基因型的多重pcr引物组合的设计及测序验证1.引物设计根据已发表的slco1b3(genebankaccession:jn020139.1)和eav-hp(genbankaccessionnumber:jf837512)序列，设计三条引物f、r1、r2(其序列如seqidno:1，seqidno:2和seqidno:3所示)，该组引物是为研究鸡slco1b3的5’侧翼区中是否有eav-hp部分序列插入而设计的。其中，f和r2均为鸡正常基因组slco1b3基因的片段，r1为eav-hp插入序列中的片段。如果个体不携带插入片段，则f和r2配对，只扩增出片段长度为397bp的单一目的条带，表明该个体不产绿壳蛋(基因型为nn/nn)。如果个体携带插入片段，则f和r1配对，只扩增出片段长度为223bp的单一目的条带，表明该个体产绿壳蛋(基因型为ls/ls)。如果个体的两条同源染色体中一条染色体携带插入片段，另外一条染色体不携带插入片段，则扩增出223bp和397bp两条目的条带，由于绿壳蛋基因为显性，则该个体仍然产绿壳蛋(基因型为ls/nn)。2.测序验证采用琅琊鸡(非绿壳蛋鸡)、绿壳蛋鸡专门化品系的纯合以及杂合型个体对上述设计的引物进行验证。2.1待测鸡基因组dna抽提待测鸡翅下静脉采血约1ml，acd抗凝，-20℃保存备用。试验前将所用器具、耗材等高压灭菌。采用高盐法进行血液基因组dna抽提，提取方案参考(extractionofdnafromtissue:highsaltmethod,animalgenomicslaboratory,universityofliverpool)，稍作修改。(1)向2ml离心管中加入30μl抗凝血，600μl裂解缓冲液(100ml0.5mol/ledta，25ml6m/lnacl100ml，加入ddh2o后高压灭菌，再加入20％sds，定容至1000ml)，加入10μg/μl蛋白酶k40μl，混匀，56℃消化过夜，至溶液澄清。(2)加入600μl饱和nacl(6m)，600μl氯仿，充分摇匀20min，12000rpm离心15min。(3)取上清液于新的2ml离心管中(注意不要吸取下面的液体)，加等体积提前预冷的90％乙醇混匀，有白色沉淀析出。(4)挑出白色沉淀至新的2ml离心管中，70％乙醇清洗1h。(5)把乙醇倒掉，待乙醇完全挥发后，加入500μlte或ddh2o。(6)盖上管盖，56℃放置2h后-20℃保存备用。2.2待测个体基因型检测引物采用上述f、r1和r2引物组合。多重pcr扩增体系(25μl)：2×taqpcrmastermix(北京天根)12.5μl、ddh2o8.5μl、f引物(10pmol/μl)1.0μl、r1引物(10pmol/μl)1.0μl、r2引物(10pmol/μl)1.0μl，模板dna(50ng/μl)1.0μl。pcr程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，36个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。pcr产物检测：120v，1.5％琼脂糖凝胶电泳30min，凝胶成像系统拍照保存用于后续基因型判定。2.3结果利用该组引物扩增了琅琊鸡(非绿壳蛋鸡)、绿壳蛋鸡专门化品系的纯合以及杂合型个体，结果如图1所示。结果表明，该引物组合扩增出的目的片段符合预期，且没有杂带，条带特异单一，边缘清楚。分别选取397bp(非绿壳蛋鸡)和223bp(绿壳蛋鸡)两个纯合个体送公司测序，使用bioedit软件比对结果表明测序结果与原设计序列相符，其序列分别如seqidno:4和seqidno:5所示。实施例2：大群体检测鉴定绿壳蛋鸡基因型及非绿壳蛋鸡基因型的准确性1.1检测素材表1待检个体一览表品种公母汶上芦花鸡绿壳系3028绿壳蛋鸡专门化品系13琅琊鸡1248汶上芦花鸡1248鲁禽鸡839所有238只待测个体，均为随机取样，翅下静脉采血约1ml，acd抗凝，-20℃保存备用。1.2基因组dna抽提同实施例1。1.3待测个体基因型检测引物采用f、r1和r2引物组合，同实施例1。多重pcr扩增体系、pcr程序同实施例1。pcr产物检测：120v，1.5％琼脂糖凝胶电泳30min，凝胶成像系统拍照保存用于后续基因型判定。pcr产物基因型判定：pcr产物只检出片段长度为397bp的单一目的条带(seqidno:4)，表明该个体基因型为nn/nn；pcr产物只扩增出片段长度为223bp的单一目的条带(seqidno:5)，表明该个体基因型为ls/ls；pcr产物扩增出223bp和397bp两条目的条带，表明该个体基因型为ls/nn。2实验结果表2多重pcr结果由表2可知，所采用的5个供试群体中，包含2个山东地方鸡种，2个专门化品系和一个培育品种，共238个待检个体的基因型判定结果符合预期，其中在琅琊鸡、汶上芦花鸡和鲁禽鸡中均未发现有绿壳蛋基因基因型，汶上芦花鸡绿壳系中的绿壳蛋基因纯合型比例较高，在58个供试个体中仅检出一例杂合基因型。绿壳蛋鸡专门化品系中杂合型比例高达92.31％，还需要进一步加大提纯力度。检测结果表明所设计多重pcr引物组合适应性强，准确率高，无论在地方鸡种，专门化品系还是培育品种中均能够准确区分鉴定绿壳蛋纯合型、杂合型以及非绿壳蛋纯合型个体。sequencelisting<110>山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）<120>一种鉴别绿壳蛋鸡基因型的多重pcr引物及鉴别方法<130>0<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tgaccagcgtagataaacat20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tcagaaagacccatagaaat20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3aacacgtagcctatagcaat20<210>4<211>397<212>dna<213>人工序列<400>4tgaccagcgtagataaacatgtattttgggaccttcaacagagggcagaactgggaggag60acaagattaaaactgcttaaaccatagtttgtgttagaagttaatgattcctctaccaag120taccaacacagtcttgcttaaggagagaatattccagattttgagtattcgtgtggtagt180ataacttctgttgttgtggatacagaacctaggtaggaatctctttaatattatttttgt240ttgtcttaatctcaaaatgtcctttagtgtttgtagctaatgaacattacctttgtggtt300ttgtctctatttcctttgaacaactacactgctaacattcatgttgtaaatattaatatt360ttagtgctgatgttagaatttctatgggtctttctga397<210>5<211>223<212>dna<213>人工序列<400>5tgaccagcgtagataaacatgtattttgggaccttcaacagagggcagaactgggaggag60tgttgtatgcgtagcgagggaaacgaggtgtgttgtaggcgtagcgagggaaacgaggtg120tgacgcgtgcaggttcctatgccacctgtgtgttatgccacctttgtgtgccaagtgtaa180cttcgtgattggaggaaacacttgtatttaaacacgtagccta223当前第1页12