本发明涉及生物技术领域。主要是用产肠毒素大肠杆菌fima基因的独特序列位点作为分子标记，利用该序列设计一对特异性的引物，通过常规pcr扩增特征性基因片段进行检测。
背景技术：
仔猪腹泻是生猪生产中最常发的疾病，导致仔猪日增重减少，脱水甚至死亡，对正常生产造成严重的影响。引起仔猪腹泻最常见的病原体包括产肠毒素大肠杆菌(etec)，沙门菌，魏氏梭菌等细菌，以及猪传染病胃肠炎病毒(tgev)，猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪轮状病毒(rv)等病毒。其中病原菌产肠毒素大肠杆菌根据其表达的菌毛类型可以进一步分类为k88+etec，f18+etec，987p+etec，f41+etec，k99+etec等不同血清型。目前临床上对猪场新发仔猪腹泻疾病的诊断主要是：(方法1)通过不同病原体的抗(体)血清进行玻板或者试管凝集实验确认阳性。因此，在确定细菌引发的腹泻时，需要使用针对不同大肠杆菌k88，k99，f18，987p，f41菌毛抗血清，不同沙门菌鞭毛或o抗原单因子抗血清，以及魏氏梭菌鉴定方法分别进行检测，直到获得阳性反应结果，上述凝集反应的敏感性不高，特异性也存在有一定程度局限性，常常存在假阳性；(方法2)通过实验室对肠道、粪便样品进行培养和划线分离，通过生化试验确定菌属后(通常培养需要一天)，再通过血清凝集或者针对不同抗原血清型的引物进行pcr确定具体病原菌血清型，过程繁琐，耗时耗力。值得注意的是，在鉴定过程中，标准株和临床分离株通常都需要筛选特殊的培养基并需要在实验室连续培养传代并在适宜的环境下(如温度、ph值等)，其用于血清学检查的外膜抗原表达较为充分，而未经上述方法处理的菌株其粘附素在体外培养条件下不能达到一定程度的表达，因而采用单因子血清进行玻板或试管凝集试验检测，不能产生肉眼可见的凝集反应，基于检测菌毛的玻板或试管凝集试验和应用受到很大限制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速、简便、特异性强、适合临床使用的pcr特异性检测方法，可以对临床环境样本进行快速鉴别是否为产肠毒素大肠杆菌。
本发明的技术方案：从已知的基因序列信息和比较分析表明，产肠毒素大肠杆菌的fima序列较其他菌属相对保守，并且猪源产肠毒素大肠杆菌的fima序列较非致病性大肠杆菌或其他致病性大肠杆菌在其第71个碱基处存在特有的6个碱基(连续插入“aaacta”)。鉴于基因fima以上特征，在大肠杆菌基因fima设计上下游引物，其中上游引物3’端序列为aaacta。根据pcr原理，引物3’端如果不能有效配对模板序列，则不能发生有效匹配扩增。该设计上游引物末端序列仅在猪产肠毒素大肠杆菌fima序列71个碱基处出现，其他血清型大肠杆菌或其他菌属fima基因均不存在。因此，通过制备各种待检细菌的dna模板用于pcr检测，当模板可以特异性扩增预期294bp大小的条带时，说明并明确该待检菌株为产肠毒素大肠杆菌；当模板不能扩增相应条带，则该待检菌株不是产肠毒素大肠杆菌。
本发明公开了i型菌毛fima基因第71位插入特征序列“aaacta”作为监测、鉴别产肠毒素大肠杆菌的分子标记的应用。
本发明还公开了用于检测仔猪腹泻致病性大肠杆菌的特异性引物，其特征是一段引物的3’端末端序列为aaacta，一个具体的实例，序列如下：
fima-petec-f：cggctctggctgaaacta(seqidno.1)
fima-petec-r：cagctgaactctgcagagccagt(seqidno.2)。
进一步地，本发明提供了一种用于检测产肠毒素大肠杆菌的试剂盒，包括pcr缓冲液、dntps、dna聚合酶、阳性对照dna模板和上述特异性引物。
本发明中所述的i型菌毛fima基因如seqidno.3所示。
本发明的优点在于：
1.用于检测、监测临床样品中猪产肠毒素大肠杆菌，已通过多株产肠毒素大肠杆菌pcr检测验证，该pcr检测方法得出的结果准确无误，且没有假阳性和相互交叉反应的发生。
2.该检测方法所需的试剂及设备成本较低，设计合成的检测引物-20℃可以长期保存，能多次使用。
3.该方法可以用于临床快速鉴别产肠毒素大肠杆菌，使用饲料、饮水(或污水)、扬尘和粪便等环境样品可直接制样扩增，免去分离培养细菌过程，快速简便
附图说明
图1致产肠毒素大肠杆菌的特异性快速检测电泳图。其中：
m为dl2000分子标记，泳道1为k88ab标准株c83901，泳道2为k88ac标准株c83902，泳道3为k88ad标准株c83903，泳道4为f18ab标准株f107/86，泳道5为987p野生株204，泳道6为987p野生株1592，泳道7为f41标准株b41，泳道8为k99标准株c83907，泳道9为k99野生株637，泳道10为k88ac野生株3030-2，泳道11为k88ac野生株2534-86，泳道12为apec野生株o1，泳道13为apec野生株o2，泳道14为k1野生株rs218，泳道15为o157野生株edl933，泳道16为工程菌dh5α，泳道17为黏附侵袭大肠杆菌标准株lf82，泳道18为肠炎沙门菌50336，泳道19为魏氏梭菌标准株c59。
具体实施方式
下述实施例中所用到的生物材料信息如下：
c83901株、c83902株和c83903株分别为k88ab、k88ac和k88ad三种血清型产肠毒素大肠杆菌标准株，c83907株为k99血清型大肠杆菌标准株，均购自中国兽药监察所菌种保藏中心；f18ab血清型产肠毒素大肠杆菌标准株f107/86，k88ac血清型野外分离株3030-2，牛源f41血清型标准株b41由美国南达科达州立大学davidfrancis教授馈赠；肠炎血清型沙门菌50336由美国宾夕法尼亚大学diterschifferli教授馈赠；k1野生株rs218株由上海交通大学姚玉峰教授馈赠；工程菌dh5α购自于takara公司；k88ac血清型野外分离株2534-86株，987p血清型野外分离株204株和1592株，k99血清型野外分离株637株，o157血清型大肠杆菌edl933，禽致病性大肠杆菌o1株和o2株，魏氏梭菌标准株c59株，黏附侵袭大肠杆菌lf82株均由扬州大学朱国强教授分离并保存。
f18ab血清型产肠毒素大肠杆菌标准株f107/86：bertschinger,h.u.,bachman,m.,mettler,c.,pospischil,a.,schraner,e.m.,stamm,m.,sydler,t.,wild,p.,1990.adhesivefimbriaeproducedinvivobyescherichiacoli0139:k12(b):h1associatedwithenterotoxaemiainpigs.veterinarymicrobiology.25,267–281
k88ac血清型野外分离株3030-2：francis,d.h.andj.a.willgohs.1991.evaluationofaliveavirulentescherichiacolivaccinefork881,lt1enterotoxigeniccolibacillosisinweanedpigs.americanjournalofveterinaryresearch.52:1051–1055.
牛源f41血清型标准株b41：j.a.morris,*c.thorns,a.c.scott,w.j.sojka,andg.
a.wells.,1982.adhesioninvitroandinvivoassociatedwithanadhesiveantigen(f41)producedbyak99mutantofthereferencestrainescherichiacolib41.infectionandimmunity.36(3),1146-1153
肠炎血清型沙门菌50336；xiameng,xianchenmeng,chunhongzhu,hengwang,jinqiuwang,jiajianie,philipr.hardwidge4&guoqiangzhu.,2013.thernachaperonehfqregulatesexpressionoffimbrial-relatedgenesandvirulenceofsalmonellaentericaserovarenteritidis.,femsmicrobiologyletters.346(2):90-6
k99血清型野外分离株637株:cmferreiros，mtcriado.,1983.purificationandpartialcharacterizationofak99-antigenassociatedadhesininescherichiacoli(637strain).revista
k88ac血清型野外分离株2534-86株:nmclark，emberberov，mwang，ramoxley.,2006.anti-capsularantibodiesactivatekillingofescherichiacolio8:k87bythealternatecomplementpathwayinporcineserum.veterinaryimmunology&immunopathology.114(1-2):185-191
k1野生株rs218:zhouy,taoj,yuh,etal.hcpfamilyproteinssecretedviathetypevisecretionsystemcoordinatelyregulateescherichiacolik1interactionwithhumanbrainmicrovascularendothelialcells[j].infection&immunity,2012,80(3):1243.
黏附侵袭大肠杆菌lf82：barnichn,boudeauj,claretl,etal.regulatoryandfunctionalco-operationofflagellaandtype1piliinadhesiveandinvasiveabilitiesofaiecstrainlf82isolatedfromapatientwithcrohn'sdisease[j].molecularmicrobiology,2003,48(3):781–794.
o157：h7野生株edl933：hschmidt,lbeutin,hkarch.molecularanalysisoftheplasmid-encodedhemolysinofescherichiacolio157:h7strainedl933.[j].infectionandimmunity,1995,63(3):1055-61.
禽致病性大肠杆菌o1：kariyawasams,johnsontj,debroyc,etal.occurrenceofpathogenicityislandi(apec-o1)genesamongescherichiacoliimplicatedinaviancolibacillosis[j].aviandiseases,2006,50(3):405.
禽致病性大肠杆菌o2：诸葛祥凯.禽致病性大肠杆菌o2:k1菌株imt5155基因组特征及de205b株黏附素和转录因子的功能研究[d].南京农业大学,2016.
魏氏梭菌标准株c59株:林成昌,胡维华,李三星,等.仔猪口服魏氏梭菌c型人工感染试验——病理形态学观察[j].河北农业大学学报,1990(3):64-66.
实施例1
本发明的pcr检测方法所用引物的核苷酸序列如下：
fima-petec-f：cggctctggctgaaacta
fima-petec-r：cagctgaactctgcagagccagt
本发明检测方法过程如下：
1.环境样品收集：(1)饲料：取饲料0.1g，研磨成粉末，备用；(2)饮水(或污水)：1.5ml离心管取水样1ml，10000rpm离心5分钟，去掉上清液，沉淀备用；(3)扬尘：在猪场不同位置放置经灭菌的硫酸纸一张，24h后将硫酸纸上落下的灰尘收集起来，取0.1g备用；(4)粪便：经灭菌的棉拭子取猪粪便0.1g备用。
2.制备待检样品的染色体dna模板：取上一步待检样品加入用灭菌处理后的50-100μl的超纯水悬浮于1.5ml离心管中，充分混匀后，置于100℃沸水中水浴5分钟，冷却至室温后，静止沉淀10分钟(有条件可以10000rpm离心1分钟)吸取2-3μl上清做pcr模板。
3.pcr扩增及产物检测：50μl扩增体系包含了1×pcr缓冲液，0.2mmdntp，上下游引物各1mm，5μl待检样品pcr模板以及0.5μldna聚合酶。扩增循环参数为94℃预变性4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，25个循环；72℃延伸10min。取5μlpcr产物在1.2％琼脂糖胶中以90v恒定电压电泳40min，溴乙锭eb染色，以dl2000dnamarker(takara公司)为标准分子量分析结果，待测样品如同阳性对照能扩增出预期大小为294bp左右条带的pcr产物，则被测样品含有致仔猪腹泻产肠毒素大肠杆菌或其他致病型大肠杆菌。
猪产肠毒素大肠杆菌的特异性快速检测
以fima-petec-f/fima-petec-r一对上下游引物，猪产肠毒素大肠杆菌c83901，c83902，c83903，f107/86，b41，gt60，w8，18ng，25ng，204，1194均能扩增出约300bp左右大小条带，而其他血清型大肠杆菌dh5α，c3040，9#，10#，ce129和a2，以及其他沙门菌50336和14#均无任何条带，为阴性对照，如图1所示。
sequencelisting
<110>扬州大学
国药集团扬州威克生物工程有限公司
<120>产肠毒素大肠杆菌i型菌毛基因fima的应用
<130>
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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<210>2
<211>23
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<213>人工序列
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<210>3
<211>555
<212>dna
<213>大肠杆菌
<400>3
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