用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其应用。

背景技术：

产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens，c.perfringens)是一种革兰氏阳性厌氧菌，又称为魏氏梭菌(clostridiumwelchii,c.welchii)，是一种人兽共患病病原体。目前至少已发现19种产气荚膜梭菌毒素，根据产气荚膜梭菌分泌的α、β、ε、ι四种主要毒素，可以将分为a、b、c、d和e型。不同型的产气荚膜梭菌可以导致不同的疾病，并都具有发病急、死亡率高等特点。产气荚膜梭菌广泛分布在土壤、污水等自然环境中。在我国由产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件非常严重，摄入被产气荚膜梭菌污染的食物后，能够引起恶心、腹泻等临床症状，从而引发肌坏死性疾病；羔羊、仔猪、牛犊、雏鸡等动物感染产气荚膜梭菌，会导致坏死性肠炎、肠毒血症等疾病。产气荚膜梭菌的污染给人类的健康和畜牧业的发展造成了巨大的危害，因此对产气荚膜梭菌病的早期快速检测显得尤为重要。

目前，对产气荚膜梭菌的传统检测方法主要有分离培养、细胞素方法、卵磷脂水解试验和反向间接乳凝胶结试验等，上述方法检测周期长，过程费时费力。随着分子生物学技术的发展，孙佳芝等建立灵敏度为4.57ug/l的双抗夹心elisa检测方法；鲍长磊等建立了产气荚膜梭菌不同毒素型多重pcr和α毒素抗体elisa检测方法；石玉玲等根据16srrna基因建立了real-timepcr方法，灵敏性则为9×10²cfu/ml；刘哲等建立了特异性检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增方法(lamp)，灵敏性为2.92×10²cfu/ml。elisa方法检测灵敏性不高，试剂盒价格昂贵，且需要特异性设备；lamp方法需要4-6条引物，设计复杂，且极易造成假阳性结果。因此，建立一种反应迅速、操作简便、灵敏性高的检测方法对于产气荚膜梭菌的有效控制依然具有重要意义。

聚合酶重组酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是一种等温扩增技术，主要依赖于重组酶、聚合链置换功能的dna聚合酶、单链结合蛋白等三种核心酶实现对靶基因的等温扩增。在反应过程中，重组酶结合引物形成蛋白-dna混合物并启动寻找模板dna上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，具有链置换功能的dna聚合酶进而从引物3'末端开始启动dna合成，实现对靶基因的级数级扩增。rpa能够在37-42℃恒温条件下20min内完成检测，特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域，目前已经被广泛应用于多种食源性致病菌的快速检测，但尚未见用于产气荚膜梭菌的检测。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对上述技术现状，提供一种用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针，并提供其在建立快速实时荧光rpa检测产气荚膜梭菌方法中的应用。

为达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针组合，其特征在于：

f引物序列如seqidno:1所示，r引物序列如seqidno:2所示，探针序列如seqidno:3所示。

seqidno:1：5’-tagttgggatgattgggattatgcagcaaaggt-3’；

seqidno:2：5’-catgtagtcatctgttccagcatctttctcacc-3’；

seqidno:3：5’-agctaactctcaaaaaggaacagcgggatata(fam-dt)(thf)(bhq1-dt)atagattcttacacga-3’

进一步地，本发明还提供了上述引物和探针组合在实时荧光rpa法检测产气荚膜梭菌中的用途。

更进一步地，本发明还提供了利用上述引物和探针组合检测产气荚膜梭菌的实时荧光rpa快速检测方法，其包括如下步骤：提取待测样品的dna作为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合在rpa体系中进行扩增，并实时检测荧光信号，若荧光信号明显增加，则待测样品中含有产气荚膜梭菌。

优选地，所述rpa反应体系中包括重悬缓冲液、ddh2o、醋酸镁溶液和冻干酶制剂，所述冻干酶制剂包括dntp、单链结合蛋白、reca重组酶、dna聚合酶、核酸外切酶、三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。

更一步地，利用上述引物和探针组合检测产气荚膜梭菌的实时荧光rpa快速检测方法的具体步骤如下：将所述引物和探针组合、待测样品的dna模板、重悬缓冲液和ddh2o混匀，加入到装有所述冻干酶制剂的反应管中，吹吸至完全溶解，再加入醋酸镁溶液，盖紧管盖，离心并涡旋后，放入等温扩增荧光检测系统中进行扩增，在扩增过程实时收集检测荧光信号。

优选地，扩增温度为39℃，扩增时间20min。

本发明还提供用于检测产气荚膜梭菌的试剂盒，其包括上述引物和探针组合。

更一步地，该试剂盒还包括重悬缓冲液、ddh2o、醋酸镁溶液和冻干酶制剂，所述冻干酶制剂包括dntp、单链结合蛋白、reca重组酶、dna聚合酶、核酸外切酶、三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。

与现有技术相比，本发明技术方案所取得的积极效果如下：

本发明是根据编码产气荚膜梭菌α毒素的高度保守的plc基因，设计特异性的引物和exo探针，并通过建立实时荧光rpa方法，为样品中产气荚膜梭菌的快速现场检测提供了有效的技术手段，尤其适用于实验设备较为落后的基层检测实验室和疫情突发现场。本发明的引物和探针特异性强，仅对产气荚膜梭菌有特异性扩增曲线，而其它菌株均无扩增曲线，灵敏度高，检出限为1.0×10¹cfu/ml。

附图说明

图1为本发明real-timerpa方法的检出限试验结果。

在图1中，不同标号的曲线表示样品的不同浓度，1-1.0×10⁶cfu/ml，2-1.0×10⁵cfu/ml，3-1.0×10⁴cfu/ml，4-1.0×10³cfu/ml，5-1.0×10²cfu/ml，6-1.0×10¹cfu/ml，7-1.0×10⁰cfu/ml，8-ddh2o。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所用到的主要试剂和仪器如下：

胰胨亚硫酸盐-环丝氨酸(tsc)琼脂、液体硫乙醇酸盐培养基(ftg)、0.1％蛋白胨水购自北京陆桥技术股份有限责任公司；细菌基因组dna提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；premixextaq，购自宝生物工程(大连)有限公司；twistamp^tmexokit，购自英国twistdx公司。

等温扩增荧光检测系统(genieⅲ)，英国optigene公司；超微量分光光度计(nanodrop2000c型)，美国thermoscientific公司。

实施例1引物及探针序列

本发明所设计的引物及探针序列如表1所示。

表1实验所用引物及探针

实施例2real-timerpa方法的建立

该方法的步骤如下：

1、提取待测菌株的基因组dna；

2、将步骤1提取的dna以及本发明设计的引物和探针加入rpa体系中进行扩增，并实时检测荧光信号。

具体步骤为：

1、基因组dna的提取

将产气荚膜梭菌(atcc13124)菌株接种到ftg培养基中，37℃厌氧培养20h，取纯培养菌液1ml，加入到洁净的1.5ml离心管中，11500rpm/min离心1min，收集沉淀，采用细菌基因组dna提取试剂盒进行dna的提取，使用nanodrop2000c超微量分光光度计测定浓度，-20℃保存备用。

2、real-timerpa检测

以步骤1中制备好的产气荚膜梭菌dna为模板，引物rpa-f/r和探针exoprobe，采用twistamp^tmexokit配制实时rpa反应体系(50μl)，其中rpa-f/r(10μmol/l)各2.1μl，exoprobe(10μmol/l)0.6μl，重悬缓冲液(20％聚乙二醇)29.5μl，dna模板1μl，ddh2o12.2μl，将其混匀，加入到装有冻干酶制剂(1mmol/l的dntp、90ng/μl的单链结合蛋白、120ng/μl的reca重组酶、30ng/μl的bsudna聚合酶、30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三(羟甲基)甲基甘氨酸、20％的聚乙二醇、5mmol/l的二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶)的反应管中，吹吸至完全溶解，再加入2.5μl280mm醋酸镁，盖紧管盖，瞬时离心并涡旋后，放入genieiii中，39℃反应20min。在扩增过程实时收集检测荧光信号，目的基因扩增后荧光信号会明显增加。

实施例3特异性试验

按照实施例2的方法分别对不同菌株进行检测，real-timerpa检测结果如表2所示。

表2不同菌株real-timerpa检测结果

注：+，阳性；-，阴性

由表2可见，仅产气荚膜梭菌有特异性扩增曲线，而其它菌株均无扩增曲线，表明建立的real-timerpa方法具有良好的特异性。

实施例4灵敏性试验

按照常规平板计数法，推算1ml菌液中产气荚膜梭菌的浓度，同时将1ml产气荚膜梭菌的纯培养菌液的基因组dna，进行10倍倍比稀释，使其所对应的活菌浓度在10⁶～10⁰cfu/ml之间，取1μl为模板，进行real-timerpa反应，对该方法的最低检出限进行分析。结果见图1所示。结果表明，本发明方法的检出限为1.0×10¹cfu/ml。

实施例5人工污染样品检测实验

使用已经gb4789.13-2012检测确定不含产气荚膜梭菌的鸡肉和奶粉样品，分别取25g加入到225ml灭菌的0.1％蛋白胨水中，再加入1ml产气荚膜梭菌的纯培养液，拍打混匀，用生理盐水进行10倍倍比稀释，每个稀释度分别取1ml人工污染产气荚膜梭菌的样品均液进行核酸提取，并以之作为模板通过real-timerpa方法进行检测。结果见表3。

表3人工污染样品检测结果

由表3可见，本发明real-timerpa方法对污染样品中产气荚膜梭菌的最低检出限为1.0×10²cfu/ml，且仅需要3-13min即可实现对所有阳性样品的检测，较real-timepcr方法更为简便快捷。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心；河北省检验检疫科学技术研究院

<120>用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其用途

<130>2018.03.19

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