本发明属于法医dna技术研究领域，具体涉及公开一种39个新始祖插入／缺失（deletionandinsertionpolymorphisms,dip）分子遗传标记的法医dna复合扩增检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：随着二十多年的发展，dna分析分型技术已在法医领域发挥了举足轻重的作用。但目前dna检验在实践中往往仅提供“被动的”分子信息，对于没有目标嫌疑人的案件，虽然可以利用dna检验进行排查，但效率低下，无异于“大海捞针”。如果能够很快认定检材来源人的真实身份，特别是检材来源人的洲际人群身份信息，就能够缩小案件的侦查范围，形成dna线索，使案件从被动比对、到主动查找，提高破案效率，节省警力和物力，有很好的社会效益和经济效益。然而要解决这些问题必须依靠始祖信息分子遗传标记。始祖信息位点是指基因组中一系列在不同地域以及不同群体中等位基因频率存在较大差异的高分化位点。始祖多态性位点应用于法医学领域，可以对犯罪现场的物证检材来源人进行生物地理祖先推断，以便缩小侦查范围，有利于锁定目标对象，能够为科技强警提供技术支持和保障。dip多态性是指不同个体的基因组中单个或多个碱基的插入或缺失，两个等位基因表现为dna长度的差异。由于dip兼具单核苷酸多态性（snp）与短串联重复序列（str）的优点，使其成为研究祖先信息的理想分子遗传标记之一：dip位点在基因组中广泛存在，每7.2kb至少存在一个dip；dip突变率较低为10-8，突变率明显低于str基因座10-3；dip位点的扩增片段也较str基因座的扩增片段小的多，有助于降解样本的dna分型；dip的两个等位基因表现为片段长度多态性，可以采用目前法医实验室常用的荧光标记、复合扩增联合毛细管电泳技术（ce）进行dna分型检测，而且不会出现影响结果判读的stutter峰等干扰峰，等位基因分型更为简便，所以较str和始祖信息单核苷多态性有更多优势。所以我们研发了一种39个新始祖dip分子遗传标记的复合扩增检测试剂盒，并对其在法医学以及群体遗传学中的应用进行了研究。技术实现要素：本发明的内容是：研究开发了一种四色荧光标记39个新的始祖dip位点的引物，复合扩增这些分子遗传标记，并行检测试剂盒。1）一个目的是一种基于推断检材来源及来源人的洲际地理信息的39个新的始祖dip位点的检测试剂盒，具体包括：fam（蓝色）组，dip位点如下：rs3029066、rs5891435、rs3045215、rs3839348、rs3831885、rs10533439、rs34477782、rs4647655、rs3028822、rs2307783、rs10555216。hex（绿色）组，dip位点如下：rs10569275、rs10538061、rs35434967、rs3840222、rs36038238、rs34921138、rs11273905、rs3840794、rs146391383、rs3830479、rs10534050、rs5788637、rs147090496。tamra（黑色）组，dip位点如下：rs16432、rs3835409、rs4147539、rs2307840、rs57406754。rox（红色）组，dip位点如下：rs3216799、rs3044252、rs5896844、rs5788207、rs3034941、rs3842715、rs145119206、rs10580743、rs3047538、rs3033760。2）39个dip位点的复合扩增体系的构建。本发明采用primer5.0软件对各位点进行引物设计，同时通过对pcr引物的优化结合四色荧光物质的调配，实现39个dip位点在同一反应体系中并行检测。在检测不同人源样本dna时，本发明试剂盒的具体扩增体系如下：组分终浓度nuclease-freewater6µl2×mastermix10µlprimermix2µl模版dna（5～10ng）2µl反应终体积20µl本发明所述检测试剂盒对非洲，欧洲，美洲以及东亚人群均具有较高的鉴别效能，可以用于不同洲际群体的鉴别；同时还可以检测各种人体检材样本，例如人源性外周血液/斑、月经血/斑、唾液/斑、牙齿、骨骼、精液、尿液/斑、人体组织脏器、毛发等样本的dna。该检测体系基于毛细管电泳平台对39个dip进行分型检测，产物片段大小小于293bp。3）本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的检测方法，所述检测方法用于鉴别不同洲际群体；具体步骤如下：1）取人源dna样本，加入到所述试剂盒中进行pcr混合扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃最后延伸60min。2）pcr产物与甲酰胺混合，加入阳性、阴性对照，应用毛细管遗传分析仪，进行dna分型；3）结果判读、数据处理与分析。本发明提供一种利用四色检测体系对人类的39个新的始祖dip位点进行毛细管电泳检测的试剂盒，包括扩增体系，检测组分，以及检测结果的分析。本发明采用新一代法医遗传学标记dip构建不同洲际群体鉴别的试剂盒。相比snp试剂盒本发明的试剂盒主要是采用毛细管电泳的方法进行分型检测，这可以在基层法医中推广应用；此外，本发明的试剂盒对未知样本检材进行地缘推断，可以缩减侦查范围，有利于案件的侦破，为科技强警提供技术支持。附图说明图1：应用该试剂盒实施1例样本的检测结果dna分型图（复合扩增39个新的始祖dip分子遗传标记基因分型图）。具体实施方式下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。本发明试剂盒组成：检测方法：1）取人源dna样本1ng/µl，加入到所述试剂盒中进行pcr复合扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；60℃最后延伸60min。；2）光谱矫正（以3130型遗传分析仪为例）。（1）更换测序仪上陈旧的pop7胶和电泳buffer；（2）取10µl5-dyematrixstandards试剂加到200µl去离子甲酰胺中，震荡混匀，在96孔板的两排16个孔中每孔分装10µl；（3）95℃变性3分钟，立即放到冰上冷却3分钟；（此步重要，不可省略）（4）光谱矫正。电泳时，dyeset选择“e5”，runmodule选fragmentanalysis36_pop7，具体参数可以根据仪器灵敏度进行调整，使最终检测峰高控制在750rfu-4000rfu之间；（5）为获得最好的校正效果，建议q值>0.95，如果未能达到此标准，建议调整电泳参数，重新电泳。3）pcr产物与甲酰胺充分混合，进行毛细管电泳。（1）标准毛细管电泳上样体系组分体积（µl）甲酰胺8.5sizestandardorg5000.5pcr产物1（2）批量上样体系：在1ml甲酰胺中加入30～50µlsizestandardorg500，混匀，分装到96孔板中，9µl/孔（3）电泳protocol的建立：点击protocolmanager，在页面中点击new，建立新的protocol，命名为mr39。type选择regular，runmodule选择fragmentanalysis36_pop7，dyeset选择e5，fragmentanalysis36_pop7中参数设置为默认值，不需要改动，进样电压为3kvolts，进样时间10sec。4）数据分析。（1）打开genemapperid软件，初次使用本试剂盒需要先导入panels&bins，建立相应的analysismethod，新建sizestandard（org500:50bp，75bp，100bp，139bp，150bp，160bp，200bp，300bp，340bp，350bp，400bp，450bp，490bp，500bp）；（2）导入电泳数据，选择相应的panel、bin、analysismethod和sizestandard等分析参数，开始分析数据。当前第1页12