本发明属于细胞分离纯化领域，具体涉及一种分离纯化细胞的专用离心管、基质和方法，分离纯化后的细胞可用于细胞分析、鉴定、培养或临床病理诊断等方面。
背景技术：
细胞分离纯化在细胞病理学诊断和细胞生物学研究中是一种必不可少的重要实验手段。
在临床获得的细胞学标本中，包括血液、浆膜腔积液、尿液、细针吸取细胞学标本等，目的细胞只是那些具有诊断价值的细胞，通常情况下，这些细胞细胞的数量少、含量低；血液中的循环肿瘤细胞（tct）则更为稀少，而tct在肿瘤的诊断、复发监测和预后判断中具有重要的价值。此外，有的细胞学标本中会含有许多不具有诊断价值的细胞和黏液、蛋白沉淀、细胞碎片等，这些成分会干扰目的细胞的分析检测和疾病的诊断。临床实践中，对目的细胞进行分离纯化以后进行检测分析，将提高诊断阳性率和分析检测结果的准确性。在细胞生物学的研究中，包括细胞培养、细胞代谢分析、基因表达和蛋白质合成研究、药物敏感实验等，通常也需要对细胞进行分离纯化后才能进行进一步的实验和检测。
目前，有多种方法进行细胞的分离纯化，包括密度梯度离心、流式细胞术、免疫磁珠、微流控芯片等方法，流式细胞术、免疫磁珠、微流控芯片等方法，一般需要经特异性的抗体识别细胞以后，借助复杂或昂贵的试剂、仪器设备，才能对细胞进行分离纯化；微流控芯片技术也可以根据细胞的大小、形状等性质分离细胞。显然，这些分离细胞的方法复杂或价格昂贵；有的方法分离后的细胞上带有捕获细胞时使用的材料，也限制了其应用。密度剃度离心法是一种较简单的方法，通过用特定密度的密度剃度分离液实现对细胞的分离纯化，但只有少数几种有明显密度差异的细胞能够通过该方法进行分离，如淋巴细胞。
在细胞病理学实践中，具有诊断价值的病变细胞主要是肿瘤细胞，其绝大多数具有细胞体积显著增大、核浆比增高的生物学特征。通过简便、高效地分离这些大细胞，能够提高肿瘤诊断的阳性率和准确性，并能为肿瘤的分子治疗靶点和预后判断指标检测提供良好材料。在正常细胞的发育过程中，也具有随着细胞发育成熟细胞体积发生明显变化的过程，不同种类细胞之间也具有细胞体积的差异，按照体积大小分离细胞也有重要的科学价值。
技术实现要素：
本发明提供了一种细胞分离纯化的专用离心管、基质材料和方法。通过专用离心管和基质材料，实现对细胞的经济、简便的分离纯化。
一种分离纯化细胞的专用离心管，由离心管和两个离心管盖构成。离心管是两端开口的中空管，两端口径可以相同，或者上大下小。离心管两端的外表层带有外螺纹（卡扣）。离心管盖是密封型盖，底面为平面或凹面，底部可有密封圈（垫），内侧壁表层设有内螺纹（卡扣），能够与离心管两端拧紧咬合，防止液体渗出，形成密闭的空间。设计成一组内外径不相同的离心管，离心管内径从2~15mm，外径一般在不超过18mm。管壁厚度1~2mm。离心管由玻璃或透明塑料制成，瓶盖由透明塑料制成，便于对分离后细胞所处位置和基质情况进行观察。为了分离少量细胞，通常制成上端内径较大，下端内径较小的离心管，上段为内径较大的圆柱形中空管，下段为内径较小的圆柱形中空管，上下两段之间有一个平滑过度空间，这样易于加样混匀，并能将分离后的细胞富集在小的柱状空间，使收集细胞更加容易。
分离细胞的关键是基质材料，该发明所述基质材料为在4∼95℃范围内具有物态（液态和固态）能随温度变化而变化的特性，如琼脂糖、琼脂、明胶、基质胶、matrigel等，这些基质材料通常在低温时是固态，高温时是液态；有的如matrigel在低温时（4℃）是液态，高温（22∼35℃）会快速成胶转变为固态，物态在这个温度范围变化的基质，适用于对存活细胞进行分离，分离后的细胞用于细胞培养、药敏和代谢等研究。
该发明提供了一种创新性的细胞分离纯化技术方法，使用专用离心管和基质材料对细胞进行分离。利用温度不同，离心管中基质的物态（液态和固态）也随着变化的特性，对细胞进行分离并固定。液态基质作为细胞分离介质材料，固态基质作为支架材料。使基质液化和凝固的方法，都既包括加热也包括冷却，这取决于基质的性质而定。将在液态条件下分离后的细胞，改变温度后使基质转变成固态，即可将分离后的细胞支撑固定在基质的特定空间位置上。即达到分离细胞的目的。
该分离细胞的方法包括离心和自然沉降两种方式，同时用液态基质的分子筛和黏滞作用，除去细胞中的黏液、蛋白沉淀、细胞碎片等杂质。
现以琼脂糖（参数：熔点≤65℃，胶点≤28℃）作为细胞分离基质为例子加以说明。将琼脂糖用ph=7.4的磷酸盐缓冲液配制成1.5%的琼脂糖，加热完全溶解后，将离心管直立在桌面或者离心管架上，拧下上端的离心管盖，将基质分装到离心管中，拧上离心管盖。装有基质的离心管可以在4℃冰箱中长期保存备用。基质的使用量是根据细胞数量多少和选择的离心管规格确定，细胞数量多时应该适当增加细胞基质材料的使用量。
分离细胞时，将带有基质材料的离心管放入恒温金属浴（其它恒温设备亦可）中，温度调至70℃以上（高于基质的熔点温度），加热20分钟以上，使固态的基质转变成液态。室温较低时，应该增加熔化基质的温度，以便在室温中基质有较长的时间不会凝固，能够从容进行后续操作。
拧下上端的离心管盖，将预热到37℃的细胞混悬液，轻轻加到液态基质的表面上；或将细胞混悬液（不加热）加入液态基质中，用滴管抽吸混匀。然后，立即用水平离心机300∼400×g离心5分钟，将细胞分离富集到特定的基质空间位置上。另外的方法还包括，将细胞混悬液加到离心管固态基质的上面，将离心管垂直放入恒温金属中，70℃以上温度加热20分钟，使基质变成液态，离心使细胞通过胶垫（层）后，分离富集到特定空间位置上。取出离心管，垂直放于4℃冰箱中15min以上，使基质重新凝固变成固态。切割下分离后的目的细胞层。
上述操作步骤中，也可以将装有基质的离心管加热融化，加入细胞混悬液以后，直接放置在恒温金属浴中，在高于基质胶点的温度条件下，利用自然沉降的原理将细胞分离富集在特定的空间位置上。有的细胞上的分子对热敏感，温度升高容易使分子破坏，此时可以将基质加热熔化以后保持在37℃，同时将细胞悬液也加热到37℃后，再进行上述分离细胞的操作。
如果分离纯化后的细胞需要保持其生物学活性，进行细胞培养或其它活性检测等，此时需要采用物态变化（液态和固态）在4∼37℃期间的基质材料作为分离介质，matrigel是一种适合进行活细胞分离的基质材料，其在4℃是液态，22∼35℃开始迅速转变为固态。用matrigel作为基质材料分离细胞时，将冷却后的细胞混悬液（4℃）加到冷却（4℃）液化后的基质上，用低温离心机（4℃）300∼400×g离心5分钟分离细胞，然后将离心管置于37℃20min,使基质凝固后。取出并切割下目的细胞层置于离心管中，4℃冰箱过夜后，再用预冷的生理盐水（4℃）洗涤细胞，即获得分离纯化的活细胞。
与现有技术方法相比，本发明有以下有益技术效果。
使用该创新的技术方法，能够高效经济便捷地将细胞按照体积大小进行分离。分离后的细胞有序排列，大细胞分布在最下层，最上层为小细胞，中间层为中等大小的细胞。切割下目的细胞层可以直接进行冰冻切片或制作成石蜡切片，然后进行免疫组化、分子病理检测和细胞病理学诊断。
该方法简便地分离获得大细胞（位于最下层），在细胞病理学中，这些细胞通常是具有诊断价值的病变细胞，制作切片时首先被切割下来制作成细胞切片，观察到病变细胞的概率增加，提高诊断阳性率。分离后的细胞将大大提高进行免疫组化和分子病理检测的质量。
由于液态基质具有分子筛和黏滞作用，该方法同时能够有效除去标本中的黏液、蛋白沉淀、细胞碎片等杂质。
使用不同的基质材料，可以达到分离不同细胞以满足实验要求。使用小内径的离心管，能够对临床或者实验过程中获得的少量细胞进行分离纯化。
附图说明
图1为本发明的专用离心管的结构示意图。
图2离心管盖上盖子以后形成密闭空间的纵切面示意图。
图3和图4为将细胞混悬液加到离心管基质上的纵切面示意图。
图5通过离心或自然沉降将细胞分离富集到特定空间位置的纵切面示意图。
图6为分离后处于不同位置的不同细胞层，细胞基质凝固后，活塞推出并切下目的细胞层的纵切面示意图。
具体实施方式
下面结合实例和附图来详细说明本发明，本发明并不仅限于此。
例一对固定细胞（无活性）进行分离纯化。
如图1所示，一种用于分离细胞的专用离心管，由离心管①和离心管盖②、③构成。
离心管①两端开口，上段为内径较大的圆柱形中空管，下段为内径较小的圆柱形中空管，上下两段之间有一个平滑过度空间，其两端的外表层带有外螺纹（卡扣）（图中未标示出外螺纹和卡扣）。离心管盖②和③底面一般为平面或凹面，盖底部带有密封圈（垫）（图中未标示出密封圈），内侧壁表层有内螺纹（卡扣）。离心管盖②、③能够与离心管①拧紧咬合，形成密闭的空间，防止液体渗出。
如图2所示，将离心管盖②③拧紧咬合到离心管①两端上以后，形成一个密闭空间。
如图3和图4所示，预先将基质④分装到离心管中，分离细胞时，将带有基质④的专用离心管放到温度高于基质熔点温度的恒温金属浴（其它恒温设备亦可）中，使基质④融化变成液态。拧下上端的离心管盖，将细胞混悬液⑤加到基质④上，直接离心或将细胞混悬液⑤和液态基质④混合后离心。另外的方法是直接将细胞混悬液⑤加到固态基质④上面，加热熔化基质以后，直接离心或混合以后离心分离富集细胞。
如图5所示，离心以后，细胞在离心力的作用下，被分离富集到基质④的特定空间位置上，形成细胞由大到小有序排列的细胞层⑤⑥⑦，细胞层中的最下层为大细胞⑤，最上层为小细胞⑦，中间层为中等大小的细胞⑥。
如图6所示，将图5的离心管直立放入4℃冰箱中15分钟以上，待基质④凝固以后，拧下两端的离心管盖，使用活塞⑧原理将含有细胞层⑤⑥⑦的基质端推出离心管。用刀片切下带有分离后细胞层⑤⑥⑦的基质材料。即达到分离纯化细胞的目的，获得不同种类的细胞。
例二对存活细胞进行分离纯化。
分离活细胞的专用离心管、方法与例一中所述相似，主要是基质不同。
如图1和如图2所示，分离存活细胞的离心管结构与例一中所描述的离心管一致，离心管中所含基质为matrigel。
如图3和如图4所示，预先将基质分装到离心管中，分离细细胞时，如图3，将带有基质④的离心管放到（4℃）冰箱中，使基质④融化变成液态。拧下上端的离心管盖，将预冷（4℃）细胞混悬液⑤加到基质④上，拧上（紧）离心管盖，于冷冻离心机（4℃）上直接离心，或如图4，将细胞混悬液⑤加到液态基质④上，将两者混合以后再离心。
如图5所示，离心完成以后，细胞在离心力的作用下，被分离富集到基质④特定的基质层⑤⑥⑦中，大细胞在最下层⑤，上层为小细胞⑦，中间层为中等大小的细胞⑥。
如图6所示，将图5的离心管直立放入37℃培养箱中静置20分钟，待基质凝固以后，拧下两端的离心管盖，使用活塞⑧原理推出带有细胞层⑤⑥⑦的基质端。用刀片切下带有目的细胞层⑤⑥⑦的基质，置于普通离心管，4℃冰箱过夜液化，再用预冷的生理盐水洗涤细胞后，即获得活细胞。