本发明涉及高砷地下水修复领域，尤其涉及一种砷氧化细菌构建的生物膜反应器。
背景技术：
近年来，利用砷氧化微生物构建的生物反应器氧化去除砷污染水体中的砷受到了很大的关注，一些固定化的砷氧化微生物被应用到砷氧化膜生物反应器中。sun等人采用一株分离自厌氧污泥中的砷氧化微生物群落构建了一个依靠还原氯酸盐来氧化as(iii)的生物反应器，该生物反应器在中性条件下需要24小时才能将0.45-1.92mmol/l的as(iii)氧化98％以上，同时氯酸盐被完全还原成氯离子和水,该反应器以dechloromonas和stenotrophomonas两个属的菌为主,此外，砷氧化酶基因、固碳酶基因和氯酸盐还原酶基因都被检测到。ayumiito等人将一株分离自活性淤泥的砷氧化菌固定到聚乙烯醇颗粒上，构建了一个在ph＝7条件下运行的砷氧化生物反应器，研究发现，当该反应器以水力停留时间为1小时运行时，含有1mg/las(iii)的合成地下水能够被氧化92％，砷的氧化速率是1×10-9μg/cell/min；当反应器以0.5小时运行时，砷的氧化效率降低到了87％，氧化速率升高至2.1×10-9μg/cell/min。一种采用化能自养砷氧化菌aliihoefleasp.2ww构建的生物反应器能够在8小时内将200μg/las(iii)几乎全部氧化。此外，其他砷氧化生物反应器包括caso1反应器和thiomonasarsenivoransstrainb6构建的生物反应器。然而，现有的砷氧化生物膜反应器的砷氧化的稳定性较差、氧化效率低，提升生物反应器的砷氧化速率和效率是将微生物砷氧化应用于砷污染水体修复过程中极为关键的突破点。但是关于生物反应器在稳定性和长期运行方面的研究相对较少，尤其是在以确定的细菌来构建高效的生物膜反应器更加罕见。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种高效稳定的砷氧化细菌构建的生物膜反应器。
本发明提供一种砷氧化细菌构建的生物膜反应器，所述生物膜反应器通过以下步骤得到：
s1，制备并确定含有高效的砷氧化细菌的细菌混合液；
s2，将玻璃反应器放置在恒温器内，然后以珍珠岩颗粒作为成膜载体，将珍珠岩颗粒填充于玻璃反应器中，加入步骤s1确定的细菌混合液浸没所有珍珠岩颗粒，向玻璃反应器内供氧，搅拌，使玻璃反应器内的混合液混合均匀；
s3，向玻璃反应器中加入新鲜的sms培养基，每隔一周更换新鲜的sms培养基，持续三周，砷氧化细菌在珍珠岩上形成生物膜；
s4，向玻璃反应器中加入合成地下水，持续培养三周，砷氧化细菌在生物膜上富集，即得到生物膜反应器。
进一步地，步骤s1中，制备并确定含有高效的砷氧化细菌的细菌混合液的具体过程为：
称取0.5～1.0g珍珠岩颗粒放置于10ml离心管中，用灭菌的玻璃棒将珍珠岩颗粒充分碾碎，涡旋震荡8～10min；
利用灭菌的sms培养基梯度稀释碾碎后的珍珠岩颗粒，选取稀释100倍、1000倍、10000倍的稀释液，分别取100μl的稀释液涂布到含有1mmol/las(iii)和10mmol/lnahco3的无菌sms固体培养基上；
将涂布有稀释液的无菌sms固体培养基放置于30℃生化培养箱中培养，无菌sms固体培养基上长出单个的微生物菌落时，用接种环挑取所有不同的单个菌落，在新鲜的sms固体培养基上划线纯化；
纯化后的细菌长出后，将这些菌株的单菌落分别接种到含有1mmol/las(iii)和10mmol/lnahco3的液体sms培养基中，放置于30℃摇床中，180转震荡培养；
三天后取样，对分离得到的单株进行鉴定以及功能检测，则确定出含有高效的砷氧化细菌的细菌混合液。
进一步地，步骤s2中，所述珍珠岩颗粒的直径为0.2～0.4cm。
进一步地，步骤s2中，恒温器的温度设置为30℃，玻璃反应器的直径为7cm，高为15cm，利用氧气瓶以0.2mpa的压力向玻璃反应器中供氧，氧气瓶中氧气的纯度为99.999％，搅拌的流速设置为60.0ml/min。
进一步地，步骤s3中，所述sms培养基的ph值为7.0，其成分为：nahco3：0.84g/l，kno3：0.18g/l，na2hpo4·12h2o：0.1g/l，kh2po4：0.015g/l，mgso4·7h2o：0.1g/l，ch3cook：0.196g/l，酵母提取物：0.2g/l,乳酸：0.45g/l以及5.0ml/l微量元素。
进一步地，步骤s4中，合成地下水中的as(iii)的浓度为30.0mg/l，合成地下水的成分为：nh4cl：9mg/l，kno3：6mg/l，h3po3：3.16mg/l，srcl26h2o：1.21mg/l，(nh4)6moo24·4h2o：0.02mg/l，mncl2·4h2o：18mg/l，cacl2：277.5mg/l，mgso4：150mg/l，nahco3：7.8mmol/l，feso4·7h2o：0.01mmol/l。
进一步地，所述生物膜反应器能够在90分钟内完全将1.0mmol/las(iii)氧化成as(v)。
进一步地，所述sms固体培养基通过在sms培养基内加入1.5％琼脂得到。
本发明还提供一种上述生物膜反应器在修复高砷地下水上的应用。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供的生物膜反应器以多孔隙的珍珠岩作为成膜载体，具有接触面积大价格低廉的优点，以新鲜的合成矿物盐培养基作为微生物的成膜环境；本发明利用单一特定的砷氧化效率极高的菌株构建了一个高效稳定的生物膜反应器，该生物膜反应器能够在90.0分钟内完全将1.0mmol/las(iii)氧化成as(v)，该氧化效率在之前所有单株生物膜反应器中是最高的；本发明为筛选生物反应器最佳的砷盐氧化细菌提供了新的方向，对环境中的砷污染问题的修复具有重要意义。
附图说明
图1是本发明一种砷氧化细菌构建的生物膜反应器的制备流程示意图。
图2是本发明一种砷氧化细菌构建的生物膜反应器的制备装置示意图。
图3是本发明对分离得到的单株进行鉴定以及功能检测的结果示意图，其中：图3(a)为各个菌株的菌属分析结果，图3(b)为各个菌株的砷氧化基因分析结果，图3(c)为各个菌株对砷的氧化功能结果图。
图4是本发明显微镜下珍珠岩颗粒的形态，其中：图4(b)为显微镜下从生物膜反应器中取出的珍珠岩颗粒的形态，图4(c)为显微镜下干净的珍珠岩颗粒的形态。
图5是本发明砷浓度变化与时间的关系曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
请参考图1和图2，本发明的实施例提供了一种砷氧化细菌构建的生物膜反应器，包括以下步骤：
步骤s1，制备并确定含有高效的砷氧化细菌的细菌混合液，具体过程为：
1.1取0.5～1.0g直径为0.2～0.4cm的珍珠岩颗粒放置于10ml离心管中，用灭菌的玻璃棒将珍珠岩颗粒充分碾碎，涡旋震荡8～10min；
1.2利用灭菌的sms培养基(合成矿物盐培养基，syntheticmineralsaltmedium)梯度稀释碾碎后的珍珠岩颗粒，选取稀释100倍、1000倍、10000倍的稀释液，分别取100μl的稀释液涂布到含有1mmol/las(iii)和10mmol/lnahco3的无菌sms固体培养基(无菌sms固体培养基通过在sms培养基内加入1.5％琼脂得到)上；其中，sms培养基的ph值为7.0，其成分为：nahco3：0.84g/l，kno3：0.18g/l，na2hpo4·12h2o：0.1g/l，kh2po4：0.015g/l，mgso4·7h2o：0.1g/l，ch3cook：0.196g/l，酵母提取物：0.2g/l,乳酸：0.45g/l以及5.0ml/l微量元素；
1.3将涂布有稀释液的无菌sms固体培养基放置于30℃生化培养箱中培养，无菌sms固体培养基上长出单个的微生物菌落时，用接种环挑取所有不同的单个菌落，在新鲜的sms固体培养基上划线纯化；
1.4纯化后的细菌长出后，将这些菌株的单菌落分别接种到含有1mmol/las(iii)和10mmol/lnahco3的液体sms培养基中，放置于30℃摇床中，180转震荡培养，三天后取样并检测砷的浓度，对分离得到的单株进行鉴定以及功能检测；参考图3，其为对分离得到的单株进行鉴定以及功能检测的结果示意图，其中，图3(a)为各个菌株的菌属分析结果，图3(b)为各个菌株的砷氧化基因分析结果，图3(c)为各个菌株对砷的氧化功能结果图，根据分析鉴定结果确定含有高效的砷氧化细菌的细菌混合液。
步骤s2，将玻璃反应器放置在30℃的恒温器内，然后以多孔隙的珍珠岩颗粒作为成膜载体，将直径为0.2～0.4cm的珍珠岩颗粒填充于玻璃反应器中，加入步骤s1确定的细菌混合液浸没所有珍珠岩颗粒，从氧气瓶中以0.2mpa的压力向玻璃反应器内供氧，利用蠕动泵以60.0ml/min的流速搅拌玻璃反应器中的混合液，使其混合均匀；其中，玻璃反应器的直径为7cm，高为15cm，氧气瓶中的氧气订购自物理与数学所，纯度为99.999％，蠕动泵的型号为雷氟bl100，蠕动泵和氧气瓶之间采用直径为8mm的14#硅胶泵管连接。
步骤s3，向玻璃反应器中加入新鲜的sms培养基，每隔一周更换新鲜的sms培养基，持续三周，砷氧化细菌在珍珠岩上形成生物膜；同时，每周检测培养基中砷氧化的状况。
步骤s4，向玻璃反应器中加入合成地下水，持续培养三周，使砷氧化细菌在生物膜上富集，即得到生物膜反应器；合成地下水中的as(iii)的浓度为30.0mg/l，合成地下水的成分为：nh4cl：9mg/l，kno3：6mg/l，h3po3：3.16mg/l，srcl26h2o：1.21mg/l，(nh4)6moo24·4h2o：0.02mg/l，mncl2·4h2o：18mg/l，cacl2：277.5mg/l，mgso4：150mg/l，nahco3：7.8mmol/l，feso4·7h2o：0.01mmol/l，合成地下水通过高温高压灭菌，nahco3和feso4·7h2o高温灭菌后加入。
本发明提供的生物膜反应器能够应用于修复高砷地下水。
本发明以干净的珍珠岩颗粒为对照，利用电子显微镜观测珍珠岩上生物膜的形成，具体步骤为：将1g干净的珍珠岩颗粒和从生物膜反应器中取出的1g含有生物膜的珍珠岩颗粒分别置于10ml离心管中，用0.1molpbs(phosphatebuffersaline，磷酸缓冲盐溶液)缓冲液(ph＝7.2)清洗三次；分别取出珍珠岩颗粒，放置于新的10ml离心管中，用2.5％戊二醛持续浸泡珍珠岩颗粒4h，使生物膜结构固定；从2.5％戊二醛溶液中分别取出珍珠岩颗粒，用0.1molpbs缓冲液(ph＝7.2)清洗3次，然后用1％锇酸浸泡珍珠岩颗粒2h，进行第二次固定；从锇酸溶液中分别取出珍珠岩颗粒，分别用浓度为50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇浸泡珍珠岩颗粒，梯度脱水；脱水后的珍珠岩颗粒，先用液氮冷冻，然后将珍珠岩颗粒置于冷冻干燥机中冻干4h；冻干后样品放置于金属托盘上，拿至真空镀膜仪中，喷金5min；将喷金完的样品置于电子显微镜下，调节显微镜工作距离至11mm，加速电压至20kv，放大倍数5000倍条件下观察珍珠岩样品，参考图4，其为显微镜下珍珠岩颗粒的形态，其中，图4(b)为显微镜下从生物膜反应器中取出的珍珠岩颗粒的形态，图4(c)为显微镜下干净的珍珠岩颗粒的形态，图4(b)说明砷氧化细菌在珍珠岩颗粒上形成了比较完整的生物膜。
参考图5，其为砷浓度变化与时间的关系曲线图，一实施例中，将350ml合成地下水加入到生物膜反应器中，每隔5min取样放置于-20℃冰箱中，根据检测的样品中as(iii)的浓度变化，确定最终砷氧化完的最短反应时间；长期检测该反应时间下砷的氧化率；当砷氧化率降低到90％时，重新检测砷氧化完的最短反应时间，再在该反应时间下检测砷氧化率，结果表明，本发明的生物膜反应器能够在90分钟内完全将1.0mmol/las(iii)氧化成as(v)。
本发明提供的生物膜反应器以多孔隙的珍珠岩作为成膜载体，具有接触面积大价格低廉的优点，以新鲜的合成矿物盐培养基作为微生物的成膜环境；本发明利用单一特定的砷氧化效率极高的菌株构建了一个高效稳定的生物膜反应器，该生物膜反应器能够在90.0分钟内完全将1.0mmol/las(iii)氧化成as(v)，该氧化效率在之前所有单株生物膜反应器中是最高的；本发明为筛选生物反应器最佳的砷盐氧化细菌提供了新的方向，对环境中的砷污染问题的修复具有重要意义。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。